氧化苦參堿對(duì)高糖毒性下血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用

易 云,吳 琴,黃莉萍,梁尚棟,高 云

(1.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院， 2.南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室，江西 南昌 330006)

氧化苦參堿對(duì)高糖毒性下血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用

易 云1,2,吳 琴2,黃莉萍2,梁尚棟2,高 云2

(1.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院， 2.南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室，江西 南昌 330006)

目的 研究氧化苦參堿對(duì)A2B受體介導(dǎo)高糖毒性下人臍帶靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)保護(hù)作用。方法 采用傳代細(xì)胞系培養(yǎng)方法培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，細(xì)胞分組如下: 5.5 mmol·L-1對(duì)照糖組(Control)，22.2 mmol·L-1高糖組 (22.2 mmol·L-1)， 44.4 mmol·L-1高糖組 (44.4 mmol·L-1)；對(duì)照糖 + 氧化苦參堿組(control+ OMT)， 22.2 mmol·L-1高糖+ 氧化苦參堿組 (22.2 mmol·L-1+ OMT)， 44.4 mmol·L-1高糖+ 氧化苦參堿組 (44.4 mmol·L-1+ OMT)。采用MTS法觀察高糖和氧化苦參堿保護(hù)效應(yīng)；結(jié)合蛋白印跡、 RT-PCR等方法觀察HUVEC中A2B受體的表達(dá)變化。結(jié)果 高糖培養(yǎng)可引起HUVEC受損和活性下降。氧化苦參堿(OMT)可明顯減少高糖性HUVEC損傷和活性下降，并對(duì)A2B的表達(dá)有明顯抑制作用。結(jié)論 氧化苦參堿對(duì)高糖條件下的HUVEC有保護(hù)作用，此作用可能通過抑制A2B的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。

氧化苦參堿；HUVEC；高糖；細(xì)胞毒性；A2B受體；糖尿病

內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂已經(jīng)成為2型糖尿病及其血管并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的重要使動(dòng)和關(guān)鍵因素，而2型糖尿病長(zhǎng)期存在的糖毒性、脂毒性和高血壓又進(jìn)一步加重內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂[1-2]。腺苷 (adenosine)是人體內(nèi)的一種重要的生物活性物質(zhì)，它是腺嘌呤核苷酸的前體和代謝產(chǎn)物，在全身各處組織都可以產(chǎn)生，其中血管內(nèi)皮組織是產(chǎn)生腺苷較多的組織。腺苷通過4種膜受體A1、A2A、A2B和A3來調(diào)節(jié)許多生理過程。生理狀態(tài)下，基礎(chǔ)水平的腺苷主要激活 A2A受體，當(dāng)腺苷水平上升并超過生理水平或達(dá)到病理水平時(shí) A2B才被激活。A2B受體與腺苷及其類似物結(jié)合后，通過跨膜信號(hào)傳遞途徑激活腺苷酸環(huán)化酶，使環(huán)磷酸腺苷(cAMP)形成增加，進(jìn)而擴(kuò)張血管平滑肌和抑制中性粒細(xì)胞的毒性作用，激活肥大細(xì)胞等炎癥細(xì)胞釋放細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，A2B受體在血管內(nèi)皮細(xì)胞有表達(dá)，并可能對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能有著調(diào)節(jié)作用。目前對(duì)腺苷A2B受體與糖尿病血管內(nèi)皮功能紊亂的研究非常少。

氧化苦參堿(oxymatrine, OMT) 是從豆科槐屬植物苦參(sophora flavescens Ait.) 等中提取的生物堿，具有四環(huán)的喹嗪啶類結(jié)構(gòu)。氧化苦參堿具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒、抗心律失常等作用?？僧a(chǎn)生抗炎和擴(kuò)血管作用[4-6]，提示其可能對(duì)高糖、高脂引起的血管內(nèi)皮損傷可能產(chǎn)生保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)以D-Glucose合并無糖培養(yǎng)基建立高糖模型，研究在高糖條件下,氧化苦參堿對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECS)的細(xì)胞毒性和保護(hù)作用及其作用機(jī)制,以進(jìn)一步闡述氧化苦參堿對(duì)A2B受體在高糖條件介導(dǎo)的保護(hù)作用機(jī)制,為由血管內(nèi)皮功能紊亂引起的各種糖尿病并發(fā)癥的防治探尋新靶點(diǎn),也為氧化苦參堿用于糖尿病及其并發(fā)癥的預(yù)防和治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人臍帶靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECS)，購(gòu)自江蘇南京，實(shí)驗(yàn)采用第3～9代。

1.1.2 氧化苦參堿 氧化苦參堿購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

1.1.3 試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基(批號(hào)：11875，Gibco，美國(guó))；胎牛血清(批號(hào)：12483020，Invitrogen，英國(guó))；0.25%胰酶(批號(hào)：T1300-100，Solarbio，中國(guó))；cell Titer96(批號(hào)：G3582，Promega，美國(guó))；二甲基亞砜(DMSO) (批號(hào)：0231，Amresco，中國(guó))；總RNA提取試劑盒(批號(hào)：DP419，TIANGEN，中國(guó))；RT試劑盒(批號(hào)：AT301，TransGEN，中國(guó))；熒光定量試劑盒(批號(hào)：RR820A，TaKaRa，日本)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，水為自制超純水。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HUVECS細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)液中，其中含10%胎牛血清，青霉素100 kU·L-1，鏈霉素100 mg·L-1，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及分組 將HUVECS細(xì)胞分成6個(gè)組，5.5 mmol·L-1對(duì)照糖組(Control)，22.2 mmol·L-1高糖組 (22.2 mmol·L-1)， 44.4 mmol·L-1高糖組 ( 44.4 mmol·L-1)；對(duì)照糖 + 氧化苦參堿組(control+ OMT)， 22.2 mmol·L-1高糖+ 氧化苦參堿組 (22.2 mmol·L-1+ OMT)， 44.4 mmol·L-1高糖+ 氧化苦參堿組 (44.4 mmol·L-1+ OMT)。

1.2.3 MTS法檢測(cè)氧化苦參堿對(duì)HUVECS細(xì)胞活性的影響 水浴37℃解凍MTS試劑，96孔板中每孔加入20 μl的MTS試劑，37℃，5% CO2孵育1～4 h，如為了延長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)間，每孔加入25 μl 10%SDS來終止反應(yīng)，等到后續(xù)檢測(cè)，多功能酶標(biāo)儀選取490 nm波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增(qPCR) 按說明書完成總RNA的提取和cDNA的合成。本實(shí)驗(yàn)選用GAPDH作為內(nèi)參，引物序列如下：

Primer A2B產(chǎn)物長(zhǎng)度為83bp

F 5′-ACCGAGACTTCCGCTACACTT-3′

R 5′-CTGACCATTCCCACTCTTGAC-3′

Primer GAPDH 產(chǎn)物長(zhǎng)度為138bp

F 5′-CAGGAGGCATTGCGTATGAT-3′

R 5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′

A2B和GAPDH擴(kuò)增體系分別如下：GoTaq@qPCR Master Mix，2× 10 μL，上游引物(10 μmol·L-1) 0.4 μL，上游引物(10 μmol·L-1) 0.4 μL，cDNA 2 μL，ROX 0.2 μL，無RNase水 7 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃×2 min；95℃×15 s，60℃×60 s，共40個(gè)循環(huán)；72℃×5 min。將PCR反應(yīng)板放入ABI7500系統(tǒng)，設(shè)置好運(yùn)行程序，運(yùn)行完后保存結(jié)果分析。

1.2.5 Western blot 將6孔板從培養(yǎng)箱取出，放到冰上靜置，移除培養(yǎng)基，用滅菌的PBS清洗兩遍( 去除酚紅)，每孔加1 mL 細(xì)胞裂解液(含10%PMSF)，在冰上充分裂解30 min后，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管，以12 000 r·min-1于4℃離心15 min，按比例加入5×loading buffer和DTT，混勻后煮沸5 min，使蛋白變性，取上清，分裝于0.5 mL離心管中，并置于-20℃保存。SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜。一抗(1 ∶1 000)4℃孵育過夜，TBST清洗3次，二抗(1 ∶2 000)室溫震蕩孵育，TBST清洗3次。膜加ECL發(fā)光劑反應(yīng)，X光膠片顯影定影后光密度分析。通過Image-J圖像分析軟件讀取目的條帶在X光膠片上測(cè)得的光密度掃描值，以各組β-actin條帶的掃描值標(biāo)化其相應(yīng)組A2B的蛋白表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 MTS檢測(cè)HUVECs細(xì)胞活性確定OMT濃度從加OMT后培養(yǎng)d 3檢測(cè)HUVECs細(xì)胞活性發(fā)現(xiàn)，10和30 μmol·L-1組與Control組、1和3 μmol·L-1組相比細(xì)胞活性明顯降低，且差異有顯著性 (P<0.01，見Fig 1)。結(jié)果表明，1和3 μmol·L-1組對(duì)細(xì)胞活性影響不大，根據(jù)參考文獻(xiàn)，我們選定OMT細(xì)胞干預(yù)濃度為3 μmol·L-1。

2.2 MTS測(cè)定高糖對(duì)HUVECs細(xì)胞毒性和OMT對(duì)其的保護(hù)作用從加高糖后培養(yǎng)d 3 MTS檢測(cè)高糖對(duì)細(xì)胞毒性以及OMT后發(fā)現(xiàn)， 22.2和44.4 mmol·L-1組與Control組相比細(xì)胞活性明顯降低，且差異有顯著性 (P<0.01)，但是Control組、Control+OMT組、22.2和44.4 mmol·L-1+OMT組三者之間相比差異無顯著性 (P>0.05，見Fig 2)

Fig 1 Viability of HUVECs in different oxymatrine

The HUVECs in 1,3,10 μmol·L-1and 30 μmol·L-1groups were given different concentrations of OMT for 3 days from d1 after seeding the cells in 6 cells plate,**P<0.01vscontrol group.

Fig 2 Effect of oxymatrine on viability of HUVECs

The HUVECs were given different concentrations of glucose or 3 μmol·L-1OMT for 3 days from d1 after seeding the cells in 6 cells plate.**P<0.01vscontrol group.

2.3 qPCR檢測(cè)A2B受體情況A2BqPCR結(jié)果表明：22.2、44.4 mmol·L-1組中A2B受體mRNA表達(dá)水平較Control組明顯增加(P<0.01)；22.2 mmol·L-1+OMT組A2B受體mRNA表達(dá)水平較22.2 mmol·L-1組明顯降低(P<0.01)；44.4 mmol·L-1+OMT組A2B受mRNA表達(dá)水平較44.4 mmol·L-1組明顯降低(P<0.05，見Fig 3)。

Fig 3 Effect of oxymatrine on expression of A2B receptor in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) cultivated

A2Bexpression in mRNA level was detected by qPCR.△△P<0.01, 22.2 and 44.4 mmol·L-1vscontrol group;**P<0.01vs22.2 mmol·L-1group;#P<0.05vs44.4 mmol·L-1group.

2.4 Western blot應(yīng)用ImageJ系統(tǒng)軟件分析A2B受體蛋白印跡結(jié)果如下：22.2、44.4 mmol·L-1組中A2B受體蛋白表達(dá)水平較Control組明顯增加(P<0.01)； 22.2 mmol·L-1+OMT組A2B受體蛋白表達(dá)水平較22.2 mmol·L-1組明顯降低(P<0.05)；44.4 mmol·L-1+OMT組A2B受體蛋白表達(dá)水平較44.4 mmol·L-1組明顯降低(P<0.05,見Fig 4)。

3 討論

2型糖尿病(diabetes mellitus，DM)是胰島素分泌絕對(duì)或相對(duì)不足，并以高血糖、高血脂為特征的代謝紊亂綜合征，其中大血管病變直接影響糖尿病患者的預(yù)后與生存[7-8]。在糖尿病心血管并發(fā)癥中，血管內(nèi)皮細(xì)胞起著關(guān)鍵的作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞可通過分泌一系列生物活性物質(zhì)，如前列環(huán)素、血管內(nèi)皮舒張因子、內(nèi)皮素及血管性假血友病因子等，參與炎癥及免疫反應(yīng)，也參與腫瘤轉(zhuǎn)移、血栓形成、血管壁病變等病理過程[9-10]。高血糖環(huán)境下，血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生病變，其分泌活性隨之改變[11]。

腺苷 (adenosine)是人體內(nèi)的一種重要的生物活性物質(zhì)，對(duì)細(xì)胞的功能起到重要調(diào)節(jié)作用[12-13]。其受體被分為4個(gè)亞型:A1、A2A、A2B和A3，其中的A2B受體被發(fā)現(xiàn)在血管內(nèi)皮細(xì)胞有表達(dá)，并可能參與調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞促炎癥反應(yīng)[14-16]。Figler等[14]研究表明，糖尿病狀態(tài)下血管內(nèi)皮細(xì)胞A2B受體表達(dá)出現(xiàn)增強(qiáng)，導(dǎo)致炎癥因子IL-6分泌增多。A2B受體發(fā)揮促炎作用已被證明存在于小鼠肺部炎癥模型以及受哮喘或慢性阻塞性肺病患者[18-20]。A2B受體可促進(jìn)慢性肺部疾病病理過程的多種促炎介質(zhì)(如IL-4、IL-6、IL-8、IL-13、IL-19和單核細(xì)胞趨化蛋白1)的表達(dá)和釋放[21-22]。以上研究都表明A2B受體可能對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能具有重要調(diào)節(jié)作用[23-24]。我們實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)顯示，高糖引起人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)A2B受體表達(dá)明顯增高，此結(jié)果和Figler等結(jié)果相一致。

Fig 4 Effect of oxymatrine on expression of A2B receptor in HUVECs cultivated in glucose ±s,n=6)

A2Bexpression in protein level was detected by Western blot. The stain values (integrated optical density) of A2Bprotein expression (normalized to each β-actin internal control) were determined by image analysis.△△P<0.01, 22.2 mmol·L-1and 44.4 mmol·L-1vscontrol group;*P<0.05vs22.2 mmol·L-1group;#P<0.05vs44.4 mmol·L-1group.

血管內(nèi)皮功能紊亂是糖尿病血管并發(fā)癥發(fā)生的基礎(chǔ)[25]。對(duì)于糖尿病患者治療的最終目的是預(yù)防和延緩糖尿病各種慢性并發(fā)癥，而改善內(nèi)皮細(xì)胞功能，已成為治療糖尿病患者的目標(biāo)之一。氧化苦參堿(oxymatrine, OMT) 是從豆科槐屬植物苦參(Sop hora flavescens ait.) 等中提取的生物堿，具有四環(huán)的喹嗪啶類結(jié)構(gòu)。氧化苦參堿具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒、抗心律失常等作用[26-27]，可產(chǎn)生抗炎和擴(kuò)血管作用[28-29]，提示其可能對(duì)高糖、高脂引起的血管內(nèi)皮損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)顯示，高糖培養(yǎng)3 d能引起人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的活性下降，用氧化苦參堿(3 μmol·L-1)干預(yù)后能明顯改善，實(shí)驗(yàn)表明人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)在高糖毒性下腺苷A2B受體表達(dá)與正常對(duì)照組比較存在明顯差異，提示腺苷A2B受體與糖尿病血管內(nèi)皮功能病變有關(guān)。用氧化苦參堿干預(yù)發(fā)現(xiàn)干預(yù)組腺苷A2B受體表達(dá)與高糖組比較存在明顯差異，qPCR和蛋白印跡結(jié)果顯示：隨著高糖濃度的增高，A2B受體表達(dá)水平明顯增強(qiáng)，氧化苦參堿干預(yù)后，A2B受體表達(dá)下降，細(xì)胞活性明顯要比高糖處理的細(xì)胞活性要好，提示氧化苦參堿對(duì)腺苷A2B受體在高糖條件介導(dǎo)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)通過細(xì)胞及分子水平相結(jié)合的研究，觀察到氧化苦參堿對(duì)在高糖條件下人血管內(nèi)皮細(xì)胞有保護(hù)作用，可能通過抑制A2B受體表達(dá)的升高產(chǎn)生保護(hù)作用。相信通過深入了解氧化苦參堿對(duì)A2B受體在高糖條件介導(dǎo)的保護(hù)作用機(jī)制，能夠?yàn)橐蜓軆?nèi)皮功能紊亂引起的各種糖尿病并發(fā)癥的防治探尋新靶點(diǎn)，為氧化苦參堿用于糖尿病及其并發(fā)癥的預(yù)防和治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

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Protective effect of oxymatrine on vein endothelial cell from glucose toxicity

YI Yun1,2, WU Qin2, HUANG Li-ping2, LIANG Shang-dong2, GAO Yun2

(1.TheDepartmentofScienceandTechnology,TheSecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,2.DeptofPhysiology,BasicMedicalCollege,NanchangUniversity,Nanchang330006,China)

Aim To study the effect of oxymatrine (OMT) on protecting human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) from toxicity induced by high glucoseinvitro. Methods The HUVECs were cultured with medium containing different concentrations of glucose or OMT. The cells were randomly divided into 6 groups: 5.5 mmol·L-1control group(Control), 22.2 mmol·L-1high glucose (22.2 mmol·L-1), 44.4 mmol·L-1high glucose (44.4 mmol·L-1), control + OMT(control+ OMT), 22.2 mmol·L-1high glucose + OMT(22.2 mmol·L-1+ OMT), 44.4 mmol·L-1high glucose+OMT (44.4 mmol·L-1+ OMT). The protective effect of oxymatrine was assessed by MTS assays. The expression of A2Bin HUVECs was detected by Real-time quantitative PCR (qPCR) and Western Blot methods. Results The glucose was shown to have caused cytotoxicity in HUVECs. Oxymatrine (3 μmol·L-1) was found to have protected HUVECs from glucose toxicity effectively, and reduced the expression of A2Bsignificantly. Conclusion Oxymatrine can obviously protect HUVECs from cytotoxicity induced by high glucose and the effect is performed partly by decreasing A2Bexpression.

oxymatrine; human umbilical vein endothelial cells (HUVECs); high glucose; cytotoxicity; A2Breceptor; diabetes

時(shí)間：2015-3-16 15:41 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150316.1541.020.html

2014-12-12,

2015-02-24

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81100829, 81360136)；江西省青年科學(xué)家培養(yǎng)計(jì)劃資助項(xiàng)目(No 2BCB22001)；江西省主要學(xué)科學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人培養(yǎng)計(jì)劃資助項(xiàng)目(No 2BCB22001)

易 云(1985-)，男，碩士，研究方向：生理學(xué)和藥理學(xué)，E-mail: yiyun.2010@163.com； 吳 琴(1985-)，女，碩士，研究方向：生理學(xué)和藥理學(xué),共同第一作者，E-mail: 271872335@qq. com； 高 云(1973-)，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，生理學(xué)碩導(dǎo)，研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)，通訊作者，E-mail:gaoyun90 @163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.04.012

A

1001-1978(2015)04-0499-05

R284.1；R322.12；R329.24；R392.11；R587.1