固相萃取-高效液相色譜法同時(shí)測定血漿中氯米帕明和4種苯二氮類藥物濃度方法的研究

鄭付春, 石剛剛

(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院 1.第一附屬醫(yī)院藥劑科、2. 藥理學(xué)教研室，廣東 汕頭 515041)

◇實(shí)驗(yàn)方法學(xué)◇

鄭付春1, 石剛剛2

(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院 1.第一附屬醫(yī)院藥劑科、2. 藥理學(xué)教研室，廣東 汕頭 515041)

目的 建立同時(shí)測定血漿中氯米帕明和4種苯二氮類藥物奧沙西泮、地西泮、氯硝西泮、阿普唑侖濃度的固相萃取-高效液相色譜法(HPLC)。方法 XTerra C8 RP(4.6 mm×150 mm，5 μm)為色譜柱，磷酸鹽緩沖液(50 mmol·L-1，pH 3.0)和乙腈(73.2:26.8，V/V)為流動(dòng)相，流速1.2 mL·min-1，柱溫45 ℃；檢測波長 220 nm，血漿經(jīng)C1固相萃取柱預(yù)處理。結(jié)果 線性范圍分別為：阿普唑侖、氯硝西泮5.0～200.0 μg·L-1，地西泮10.0～500.0 μg·L-1，氯米帕明20.0～500.0 μg·L-1，奧沙西泮7.5～2 000 μg·L-1，相關(guān)系數(shù)均大于0.999 4；最低檢測限分別為：阿普唑侖1.5 μg·L-1、氯硝西泮1.4 μg·L-1、地西泮3.0 μg·L-1、氯米帕明5.5 μg·L-1、奧沙西泮2.2 μg·L-1；日內(nèi)及日間精密度(CV%)分別為2.2%～12.6%、2.1%～13.2%，偏差-10.6%～14.6%，提取回收率81.1%～100.1%。結(jié)論 該法可用于臨床血漿中氯米帕明和4種苯二氮類藥物的同時(shí)檢測，方法新穎、靈敏、經(jīng)濟(jì)，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

固相萃取法；氯米帕明；地西泮；奧沙西泮；氯硝西泮；阿普唑侖；高效液相色譜法

氯米帕明是臨床治療重度抑郁常用的三環(huán)類藥物之一，并用于強(qiáng)迫癥、焦慮癥治療。其機(jī)制主要是抑制五羥色胺再攝取，同時(shí)也是組胺H1受體、乙酰膽堿毒蕈堿受體和腎上腺素α1受體的拮抗劑/反向激動(dòng)劑，后三者效應(yīng)與其不良反應(yīng)直接有關(guān)[1]。眾所周知，氯米帕明在臨床有好的治療效果，但明顯的副作用也影響它應(yīng)用的安全性，如：增加癲癇發(fā)作、心臟毒性、認(rèn)知損害、抗膽堿能不良反應(yīng)、藥物相互作用以及過量致死性等[2]，在臨床需個(gè)體化治療，監(jiān)測患者血藥濃度是個(gè)體化用藥的重要保證。

1 材料與儀器

1.1 藥品試劑甲醇(北京百靈威科技有限公司)和乙腈(瑞典Oceanpak公司)為色譜純，其它試劑為分析純；去離子水為Milli-Q50超純水；地西泮、奧沙西泮、氯硝西泮、阿普唑侖，氯米帕明和鹽酸苯海拉明(內(nèi)標(biāo))對照品(中國藥品生物制品檢定所)，空白血漿(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血庫)。

1.2 儀器設(shè)備Agilent 1100高效液相色譜系統(tǒng)(包括四元泵、真空脫氣泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器DAD、數(shù)據(jù)分析軟件Chem Station for LC 3D Rev.A.10.01[1635]，美國Agileng公司)；AL204電子天平(瑞士Mettle Toledo公司)；PHS-3CA精密酸度計(jì)(上海大浦儀器有限公司)；Anke TGL-16G高速低溫冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；MS3渦旋儀(德國IKA 公司)；Milli-Q50超純水儀(美國Millipore公司)。

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制分別精密稱量地西泮、奧沙西泮、氯硝西泮、阿普唑侖、氯米帕明和內(nèi)標(biāo)對照品10 mg，用甲醇定容至10 mL，配制濃度為1 g·L-1的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，-20 ℃保存。濃度0.05 g·L-1的工作液當(dāng)天用流動(dòng)相新鮮配制。所有溶液避光保存。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品配制精密量取對照品地西泮、奧沙西泮、氯硝西泮、阿普唑侖和氯米帕明工作液(0.05 g·L-1)，加入空白血漿，配制如下終濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品：氯硝西泮和阿普唑侖：5.0～200.0 μg·L-1(5、12.5、25、50、100、200 μg·L-1)；地西泮：10.0～500.0 μg·L-1(10.0、31.25、62.5、125、250、500 μg·L-1)；氯米帕明：20.0～500.0 μg·L-1(20.0、31.25、62.5、125、250、500 μg·L-1)；奧沙西泮：7.5～2000 μg·L-1(7.5、50、125、250、500、1000、2000 μg·L-1)。并配制各低中高濃度質(zhì)控樣品(QC)。

2.3 血漿樣品預(yù)處理取固相萃取柱Bond Elut-C1(100 mg, 1 mL) (美國Agilent公司)，依次用5 mL甲醇、超純水活化；取500 μL 血漿，加入1 000 μL磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)，加入內(nèi)標(biāo)工作液50 μL，渦旋1 min混勻后上樣至上述C1柱；分別用1 mL去離子水、1 mL水/甲醇混合液(80 ∶20，V/V)淋洗1次棄去；用2 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，45 ℃氮?dú)獯蹈?，?fù)溶于125 μL流動(dòng)相，離心后取上清液進(jìn)樣。

2.4 色譜條件色譜柱Waters XTerra C8 RP(4.6 mm×150 mm，5 μm)，保護(hù)柱Agilent Zobax-Extend C18 (4.6 mm×10 mm，5 μm)；流動(dòng)相50 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH3.0):乙腈(73.2:26.8，V/V)；檢測波長 220 nm，柱溫45 ℃，流速1.2 mL·min-1，進(jìn)樣量50 μL。

2.5 臨床應(yīng)用患者服用恒定日劑量藥物2周后，于末次服藥后12 h取血約1.2 ml，置于枸櫞酸鈉抗凝管，2 h內(nèi)離心(1 400 r·min-1，15 min)，取血漿存于-20 ℃待測。

3 結(jié)果

3.1 方法選擇性取6份不同來源空白血漿500 μL，除不加內(nèi)標(biāo)外，其余按“2.3 血漿樣品預(yù)處理”項(xiàng)下操作，獲空白血漿色譜圖A；將標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液加入空白血漿，依同法操作，獲含藥血漿色譜圖B；由Fig 1 可以看出，成分間分離良好，未見血漿中雜質(zhì)干擾。

3.2 線性范圍及最低檢測限(LOD)將標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品按“2.3 血漿樣品預(yù)處理”項(xiàng)下操作。以被測藥物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)Y，被測藥物濃度為橫坐標(biāo)X，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，計(jì)算回歸方程。LOD定義為信噪比≥3。從Tab 1可以看出，各藥物在其線性范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均在0.9994及以上，LOD在1.4～5.5 μg·L-1之間。

Tab 1 Calibration, limit of detection (LOD) and limit ofquantitation (LOQ) for clomipramine and four BZDs

Y represents the peak area ratio of each drug to the IS, X represents the concentration of compound (μg·L-1)

Fig 1 Chromatograms obtained from (A) blank human plasma, (B) spiked human plasma with compounds

(all in 100 μg·L-1). Peaks: 1: Oxazepam, 2: Alprazolam, 3: Clonazepam, 4: Clomipramine, 5: IS, 6: Diazepam.

3.3 精密度和準(zhǔn)確度將“2.2”項(xiàng)下配制的QC樣品，每個(gè)濃度進(jìn)行5 樣本分析，連續(xù)測定5 d，與標(biāo)準(zhǔn)曲線同時(shí)進(jìn)行。根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算QC濃度，與配制濃度對比，求得本方法的精密度與準(zhǔn)確度。結(jié)果表明(Tab 2)，被測化合物的日內(nèi)誤差(CV%) 為2.2%～12.6%，日間誤差(CV%) 為2.1%～13.2%，偏差為-10.6%～14.6%。

3.4 提取回收率取低中高濃度質(zhì)控樣品，重復(fù)測定5次，記錄峰面積，與未經(jīng)處理相應(yīng)濃度藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液直接進(jìn)樣峰面積比較，計(jì)算提取回收率。被測藥物及內(nèi)標(biāo)的提取回收率為81.1%～100.9%，見Tab 2。

3.5 穩(wěn)定性標(biāo)準(zhǔn)品貯備液-20 ℃凍存2個(gè)月穩(wěn)定，含藥血漿-20 ℃凍存2個(gè)月穩(wěn)定，含藥血漿凍融3次穩(wěn)定，樣品處理后4 ℃放置0、12、24 h穩(wěn)定，未處理樣品室溫放置0、2、4 h穩(wěn)定。

3.6 臨床應(yīng)用目前已對臨床服用奧沙西泮、氯米帕明的患者進(jìn)行了血藥濃度檢測，色譜圖見Fig 2。

4 討論

本工作建立了在臨床單用HPLC同時(shí)測定血漿中氯米帕明和4 種苯二氮類藥物濃度的方法，這對于科研實(shí)驗(yàn)中采用液質(zhì)聯(lián)用或氣質(zhì)聯(lián)用測定相比花費(fèi)低、且操作簡便，并可做到同時(shí)迅速、準(zhǔn)確地一次性分別進(jìn)行定性定量分析，可滿足臨床對血漿樣品中此類藥物含量測定要求。該方法在臨床尤其實(shí)用，可在國內(nèi)推廣使用。

Tab 2 Precision, accuracy and extraction yield results

a:Bias (%)=100×[(mean measured concentration)-(theoretical concentration)]/(theoretical concentration). b: Intra-day (n=5). c: Inter-day (n=5×5). d: Extraction yield (%)=analyte peak area compared to those obtained by injecting standard solutions at the same theoretical concentrations and the extraction yield values were calculated.

Fig 2 Chromatograms obtained from plasma samples in patients treated with (A) oxazepam; (B) clomipramine 1:Oxazepam;4:Clomipramine;5:IS

實(shí)驗(yàn)中觀察了2種色譜柱：ODS2(4.6 mm×250 mm，5 μm) 和 C8 (4.6 mm×150 mm，5 μm)。結(jié)果顯示，前者C18柱不能完全分離5種被測物，且分析時(shí)間長，可能源于藥物極性較小，在C18柱上保留時(shí)間長；而C8柱則能較好分離各組分，并縮短分析時(shí)間。流動(dòng)相pH 值對色譜行為影響非常明顯。在流動(dòng)相摸索中，首先采用流動(dòng)相水相pH 2.5、pH 4.3，發(fā)現(xiàn)峰展寬、拖尾、且分離不完全。我們又考察了不同的pH值，結(jié)果顯示，pH 3.0效果最好，改善分離度及峰形，且具適當(dāng)保留時(shí)間。

本工作的難點(diǎn)是樣品的前處理，在血漿中，同時(shí)、高效提取氯米帕明和苯二氮這兩類藥物并去除干擾是非常困難，但又是必須的。文獻(xiàn)報(bào)道[12]采用弱陽離子交換(WCX) 固相萃取柱進(jìn)行血漿預(yù)處理，但洗脫時(shí)需分酸性和堿性洗脫層分別收集被測物，再分別進(jìn)樣，方法耗時(shí)、復(fù)雜，不適于臨床應(yīng)用。孫紅雷等[9]結(jié)果顯示C18柱提取苯二氮等安眠藥效果最差，C2柱提取效果不均勻，而且去除雜質(zhì)效果較差。喬靜等[15]測試了幾種固相萃取柱對氯硝西泮的提取效率，結(jié)果顯示Silica柱、C18柱及HLB柱的回收率均較低，為36%～73.5%。Shinozuka等[11]結(jié)果顯示，HLB柱對氯米帕明提取回收率僅為72.4%。我們根據(jù)以上報(bào)道，改進(jìn)了萃取方法，采用了極性較大的C1柱，提高了極性及非極性化合物，即苯二氮類及其活性代謝產(chǎn)物的回收率。改進(jìn)的方法國內(nèi)未見報(bào)道。

[1] Baldessarini R J. Drug therapy of depression and anxiety disorders[M]// Brunton L L，Lazo J S，Parker K L，Eds. Goodman & Gilman′s The Pharmacological Basis of Therapeutics.11th Edition. McGraw-Hill，New York，2006：429-60.

[2] 尉秀峰，徐作國，隋忠慶. 氯米帕明的不良反應(yīng)/事件分析[J]. 中國藥物警戒，2013，10(2)：101-3.

[2] Wei X F，Xu Z G，Sui Z Q. Analysis of clomipramine adverse reaction/event[J].ChinJPharmacov，2013，10(2)：101-3.

[3] 李瑞芝，郭建友，李昌煜，石晉麗. 焦慮癥γ-氨基丁酸受體機(jī)制與藥物干預(yù)研究進(jìn)展[J]. 中國藥理學(xué)通報(bào)，2010，26(9)：1135 - 8.

[3] Li R Z，Guo J Y，Li C Y，Shi J L. Progress of the research in GABA receptors and anxiety disorder: mechanism and pharmaceutical intervention[J].ChinPharmacolBull，2010，26(9)：1135-8.

[4] George M B，Craig W S. Pharmacology[M]. 4th Edition. Elsevier Inc. Saunders，2013：186-97.

[5] 張亭亭，薛 瑞，李云峰，等. 單胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與單胺重?cái)z取抑制劑研究進(jìn)展[J]. 中國藥理學(xué)通報(bào)，2013，29(6)：741-4.

[5] Zhang T T，Xue R，Li Y F，et al. Research progress in monoamine transporters and monoamine transmitter reuptake inhibitors[J].ChinPharmacolBull，2013，29(6)：741-4.

[6] Mercolini L，Mandrioli R，Iannello C，et al. Simultaneous analysis of diazepam and its metabolites in rat plasma and brain tissue by HPLC-UV and SPE[J].Talanta，2009，80：279-85.

[7] Smink B E，Brandsma J E，Dijkhuizen A，et al. Quantitative analysis of 33 benzo-diazepines, metabolites and benzodiazepine-like substances in whole blood by liquid chromatography-(tandem) mass spectrometry[J].JChromatogrBAnalytTechnolBiomedLifeSci，2004，811：13-20.

[8] Gunnar T，Ariniemi K，Lillsunde P. Determination of 14 benzodiazepines and hydroxy metabolites，zaleplon and zolpidem as tert-butyldimethylsilyl derivatives compared with other common silylating reagents in whole blood by gas chromatography-mass spectrometry[J].JChromatogrBAnalytTechnolBiomedLifeSci，2005，818：175-89.

[9] 孫紅雷，李文海. 血中安眠藥物的固相萃取 GC/MS 分析方法研究[J]. 分析測試技術(shù)與儀器，2008，14(4)：209-13.

[9] Sun H L，Li W H. The research on the analysis of common hypnotic sedative drugs in blood by GC/MS with SPE[J].AnalysisandTestingTechnolInstruments，2008，14(4)：209-13.

[10] 賈晶瑩，張夢琪，桂雨舟，等. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定7 種抗抑郁類和5 種抗精神病類藥物的血藥濃度[J]. 中國藥物應(yīng)用與監(jiān)測，2010，7(5)：272-5.

[10] Jia J Y，Zhang M Q，Gui Y Z，et al. Quantitative determination of seven antidepressants and five antipsychotics in human serum by HPLC-MS/MS[J].ChinJDrugApplMonit，2010，7(5)：272-5.

[11] Shinozuka T，Terada M，Tanaka E. Solid-phase extraction and analysis of 20 antidepressant drugs in human plasma by LC/MS with SSI method[J].ForensicSciInt，2006，162：108-12.

[12] 張 吟，陳一農(nóng)，陳崇宏. 固相萃取-高效液相色譜法分析血漿中的13種藥物[J]. 中國藥學(xué)雜志，2010，45(21)：1648-51.

[12] Zhang Y，Chen Y N，Chen C H. Determination of 13 drugs in plasma by high performance liquid chromatography with solid phase extraction[J].ChinPharmJ，2010，45(21)：1648-51.

[13] Uddin M N，Samanidou V F，Papadoyannis I N. Validation of SPE-HPLC determination of 1，4-benzodiazepines and metabolites in blood plasma,urine,and saliva[J].JSepSci，2008，31：3704-17.

[14] Badawi N，Simonsen K W，Steentoft A，et al. Simultaneous screening and quantification of 29 drugs of abuse in oral fluid by solid-phase extraction and ultraperformance LC-MS/MS[J].ClinChem，2009，55：2004-18.

[15] 喬 靜，劉憲平，辛國斌. 固相萃取HPLC/MS法測定血中氯硝安定[J]. 中國法醫(yī)學(xué)雜志，2007，22(3)：149-50.

[15] Qiao J，Liu X P，Xin G B. Determination of clonazepam in blood sample by SPE-HPLC-MS[J].ChinJForensicMed，2007，22(3)：149-50.

Simultaneous determination of clomipramine and four benzodiazepines in human plasma by HPLC-DAD after solid phase extraction

ZHENG Fu-chun1, SHI Gang-gang2

(1.DeptofPharmacy，the1stAffiliatedHospital; 2.DeptofPharmacology，ShantouUniversityMedicalCollege，ShantouGuangdong515041，China)

Aim To establish a novel, highly sensitive, rapid and cost-effective HPLC method to simultaneously determine tricyclic antidepressant clomipramine and four benzodiazepines of diazepam, alprazolam, clonazepam, oxazepam in human plasma pretreated by solid phase extraction. Methods The assay was achieved by using C8 column (4.6 mm×150 mm, 5 μm) kept at 45 ℃, mobile phase 73.2:26.8V/V(50 mmol·L-1, pH 3.0 phosphate buffer: acetonitrile) with flow rate of 1.2 ml·min-1, and UV detection was set at λ220 nm. Solid phase extraction was performed on C1 cartridges. Results The calibration curve was demonstrated to be linear (r>0.9994) in the ranges of 5～200 μg·L-1for alprazolam and clonazepam, 10～500 μg·L-1for diazepam, 20～500 μg·L-1for clomipramine, and 7.5～2000 μg·L-1for oxazepam; the limit of detection (LOD) was 1.5,1.4, 3.0, 5.5 and 2.2 μg·L-1for alprazolam, clonazepam, diazepam, clomipramine and oxazepam respectively. Intra-day and inter-day precision revealed a coefficient of variation of 2.2%～12.6% and 2.1%～13.2%, respectively. Extraction yield ranged from 81.1%～100.1% for all analytes. Conclusion The developed method is accurate, reproducible, convenient, and suitable for routine therapeutic drug monitoring of clomipramine and the four benzodiazepines.

solid phase extraction; clomipramine; diazepam; oxazepam; clonazepam; alprazolam; HPLC

時(shí)間：2015-3-16 15:41 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150316.1541.028.html

2014-10-17,

2015-02-15

中央財(cái)政支持地方高校發(fā)展專項(xiàng)資金；廣東省自然科學(xué)基金團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(No 9351503102000001)；廣東省自籌經(jīng)費(fèi)類科技計(jì)劃項(xiàng)目

鄭付春(1967-)，女，碩士，副主任藥師，研究方向：新藥開發(fā)研究，E-mail: zhengfc@stu.edu.cn,Tel:0754-88905491； 石剛剛(1957-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：心血管藥理學(xué)及藥物開發(fā)，通訊作者， Tel：0754-88566782， E-mail:ggshi@stu.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.04.028

A

1001-1978(2015)04-0582-04

R446.11；R971.3；R971.4