過敏性疾病關鍵啟動因子在人角質(zhì)形成細胞中表達的適宜刺激方法探索

劉海亮，包凱帆，江小燕，魏 筱，于 曦，陶 羽，王曉鈺，王 燕，洪 敏

(南京中醫(yī)藥大學藥學院，科技部國家規(guī)范化中藥藥理實驗室，江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，江蘇 南京 210023)

過敏性疾病關鍵啟動因子在人角質(zhì)形成細胞中表達的適宜刺激方法探索

劉海亮，包凱帆，江小燕，魏 筱，于 曦，陶 羽，王曉鈺，王 燕，洪 敏

(南京中醫(yī)藥大學藥學院，科技部國家規(guī)范化中藥藥理實驗室，江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，江蘇 南京 210023)

目的 研究不同刺激條件對人角質(zhì)形成細胞HaCaT細胞中TSLP、IL-33表達水平的影響，探討過敏性疾病中關鍵啟動因子TSLP、IL-33體外表達細胞模型的最佳刺激方法。方法 應用角質(zhì)形成細胞無血清培養(yǎng)液(K-SFM)體外培養(yǎng)HaCaT細胞，給予不同刺激劑，篩選出明顯促進HaCaT細胞中TSLP和IL-33表達的刺激劑。進而考察單獨與聯(lián)合刺激劑時的量效關系，最后對選出的刺激劑進行時效關系考察。TSLP和IL-33表達水平采用ELISA和免疫熒光法檢測。結果 (1)Poly(I:C)與TNF-α兩種刺激劑單獨使用時均能明顯刺激HaCaT細胞分泌TSLP和IL-33，其余刺激劑在本實驗濃度范圍內(nèi)未見明顯差異。(2) Poly(I:C)100 mg·L-1與TNF-α 20 μg·L-1聯(lián)合刺激對HaCaT細胞表達TSLP和IL-33的促進作用最為明顯。(3)對Poly(I:C)100 mg·L-1與TNF-α 20 μg·L-1聯(lián)合刺激HaCaT細胞的時效關系考察發(fā)現(xiàn)，刺激12 h HaCaT細胞中TSLP和IL-33的表達水平最高。結論 不同刺激劑和刺激時間對體外刺激HaCaT細胞表達細胞因子TSLP和IL-33的效應不同, 其中以Poly(I:C)100 mg·L-1與TNF-α 20 μg·L-1聯(lián)合刺激HaCaT細胞12 h后，TSLP和IL-33的表達水平升高最為明顯。該結果為過敏性疾病的病理機制及藥物作用研究提供了合適的方法。

HaCaT細胞;過敏性疾病; Poly(I:C);TNF-α; TSLP; IL-33

近年來過敏性疾病的發(fā)病率不斷上升，已知上皮細胞(EC)是過敏性疾病中激發(fā)和調(diào)節(jié)免疫反應的關鍵參與細胞，其分泌的細胞因子TSLP、IL-33作為關鍵啟動因子可能成為干預過敏性疾病的重要靶點[1-2]。在皮膚過敏性疾病中，角質(zhì)形成細胞是上述因子的主要來源[3]，故可選擇角質(zhì)形成細胞考察上述關鍵因子的產(chǎn)生及藥物的影響。但對于不同刺激劑和不同培養(yǎng)環(huán)境對角質(zhì)細胞內(nèi)細胞因子表達的影響依然知之甚少[4]。因此,本實驗利用體外培養(yǎng)的HaCaT 細胞，觀察不同刺激因素對HaCaT細胞中TSLP、IL-33表達水平的影響，探討過敏性疾病中TSLP、IL-33的表達的最佳刺激條件，為過敏性疾病病理機制及藥物作用的研究提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 無血清培養(yǎng)液K-SFM (keratinocyte serum free medium 1X)、牛垂體浸膏(bovine pituitary extract)、rhEGF、Trypsin、山羊血清、胰酶抑制劑，均為Gibco產(chǎn)品；Poly(I：C)、LPS、PMA均為Sigma生產(chǎn)；TNF-α、PeproTech；TSLP(FL-159)、rabbit polyclonal IgG、IL-33(M-266、rabbit polyclonal IgG，Goat anti-rabbit IgG-FITC，為Santa Cruz Biotechnology產(chǎn)品；DAPI(5 g·L-1)，抗熒光淬滅封片液，Beyotime Biotechnology產(chǎn)品；TritonX-100，北京鼎國生物技術有限公司生產(chǎn)；BSA，上海惠興生化試劑有限公司；Human TSLP ELISA Kit，eBioscience公司；Human IL-33 ELISA Kit，RD Systems公司；總蛋白定量試劑盒(BCA法)，南京建成生物工程研究所。

1.1.2 儀器 凈化工作臺，蘇州凈化設備公司，SW-CJ-1F；CO2細胞培養(yǎng)箱，日本三洋公司，MCO-20AIC；倒置熒光顯微鏡，日本Nikon公司，Nikon Ti；高壓滅菌器，日本三洋公司，MLS-3030CH；低速自動平衡離心機，北京醫(yī)用離心機廠，型號LDZ5-2；多功能酶標儀，型號：SyneRgy HT，美國Bio-Tek。

1.1.3 細胞 人角質(zhì)形成細胞HaCaT由南京大學模式動物研究所饋贈，用角質(zhì)形成細胞無血清培養(yǎng)液(K-SFM)添加重組人表皮生長因子(rhEGF) 2.5 μg·L-1和牛垂體提取物(BPE)25 mg·L-1體外培養(yǎng)人HaCaT。用胰酶消化，洗滌一次后加入培養(yǎng)液重懸，轉移到放置有無菌蓋玻片的細胞培養(yǎng)板中，置37 ℃、5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及處理 單獨刺激劑的量效關系考察 實驗分為6組(對照組、Poly(I:C)組、TNF-α組、LPS組、PMA組、Trypsin組)，每組3個復孔，刺激HaCaT細胞12 h后收取上清液，采用ELISA法和免疫熒光技術檢測不同刺激劑組TSLP和IL-33細胞因子表達水平，篩選出表達明顯的刺激濃度。Poly(I:C)組采用0.1、1、10、100 mg·L-1不同濃度單獨刺激，TNF-α組采用20、100、200 μg·L-1不同濃度單獨刺激，LPS組采用5、20、50 mg·L-1不同濃度單獨刺激, PMA組采用10、50、100 mg·L-1不同濃度單獨刺激，Trypsin組采用10、100、1 000 nmol·L-1不同濃度單獨刺激，并加無血清培養(yǎng)液作為對照組。

聯(lián)合刺激劑的量效關系考察 根據(jù)上述實驗篩選出的刺激劑，將實驗分為4組[對照組、Poly(I:C)組、TNF-α組、Poly(I:C)與TNF-α聯(lián)合組]進行，每組3個復孔，刺激HaCaT細胞12 h后收取上清液，采用ELISA 法和免疫熒光技術檢測不同刺激劑組TSLP和IL-33的表達水平。Poly(I:C)組采用0.1、1、10、100 mg·L-1不同濃度單獨刺激，TNF-α組采用20、100、200 μg·L-1不同濃度單獨刺激，Poly(I:C)與TNF-α組采用TNF-α 20 μg·L-1分別與Poly(I:C)0.1、1、10、100 mg·L-14個濃度聯(lián)合刺激，并加無血清培養(yǎng)液作為對照組。

聯(lián)合刺激劑刺激HaCaT細胞的時效關系考察 實驗分為4個組，0 h組、6 h組、12 h組和24 h組,每組6個復孔。對HaCaT細胞采用Poly(I:C)100 mg·L-1與TNF-α 20 μg·L-1聯(lián)合刺激0、6、12和24 h后收取培養(yǎng)上清液，0 h組作為對照組，采用ELISA 法檢測不同時間點TSLP和IL-33的表達水平。

1.2.2 TSLP和IL-33的檢測 免疫熒光檢測 將細胞接種到無菌蓋玻片上爬片培養(yǎng)24 h，細胞融合80%左右后,按1.2.1方案加入刺激劑處理后取出，4%多聚甲醛固定30 min, 1.5%山羊血清封閉60 min,然后加一抗4℃過夜,PBS沖洗后加FITC標記的二抗37 ℃孵育2 h后，DAPI復染核5 min,封片，用熒光顯微鏡觀察細胞中TSLP和IL-33的表達，藍色代表細胞核，綠色代表TSLP和IL-33的表達。

ELISA檢測，收集各組細胞培養(yǎng)上清液,保存在-20 ℃冰箱中,采用Human- TSLP、IL-33 ELISA試劑盒中推薦的步驟，檢測細胞培養(yǎng)上清液中TSLP和IL-33的表達水平。并通過樣本總蛋白定量檢測進行樣本蛋白校正。

2 結果

2.1 單獨刺激劑時HaCaT細胞分泌TSLP和IL-33的量效關系用不同刺激劑刺激HaCaT細胞12 h后收集細胞上清液，ELISA法測定上清液中TSLP(Fig 1A)、IL-33(Fig 1B)的含量，免疫熒光法檢測細胞中TSLP(Fig 2A)、IL-33(Fig 2B)的表達。結果表明，Poly(I:C)10、100 mg·L-1與TNF-α 20、100 μg·L-1濃度能明顯刺激HaCaT細胞表達TSLP。Poly(I:C)組1、10、100 mg·L-1，TNF-α組20、100 μg·L-1以及Trypsin組100 nmol·L-1濃度能明顯刺激HaCaT細胞表達IL-33，其余組別濃度未見明顯差異。

Fig 1 TSLP and IL-33 levels in HaCaT cells under different stimulants by ELISA A:TSLP; B:IL-33，*P<0.05,**P<0.01 vs control

Fig 2 Effects of different stimulants on TSLP(A)and IL-33(B) levels of HaCaT cells in co-culture system (immunofluorescence，A，×630；B，×200)

2.2 不同濃度聯(lián)合刺激劑時HaCaT細胞分泌TSLP和IL-33的量效關系為進一步篩選出刺激HaCaT細胞表達TSLP和IL-33的最佳刺激劑，采用上述實驗中表達比較明顯的poly(I：C)組和TNF-α組中表達較高的TNF-α 20 μg·L-1聯(lián)合刺激，并與單獨的poly(I：C)組和TNF-α 組進行比較。采用ELISA(Fig 3)和免疫熒光(Fig 4)檢測結果顯示，Poly(I:C)100 mg·L-1與TNF-α 20 μg·L-1聯(lián)合刺激時HaCaT細胞中TSLP(Fig 3A，F(xiàn)ig 4A)和IL-33(Fig 3B，F(xiàn)ig 4B)的表達最為明顯。

2.3 聯(lián)合刺激劑時HaCaT細胞分泌TSLP和IL-33的時效關系用poly(I：C)100 mg·L-1與TNF-α 20 μg·L-1聯(lián)合刺激HaCaT，于0、6、12、24 h收集細胞上清，ELISA法測定TSLP和IL-33含量。結果顯示與0 h相比：poly(I：C)100 mg·L-1與TNF-α 20 μg·L-1聯(lián)合刺激12、24 h后，HaCaT細胞中TSLP(Fig 5A)和IL-33(Fig 5B)的表達都明顯提高，其中以12 h最為明顯，故選擇poly(I：C)100 mg·L-1與TNF-α 20 μg·L-1聯(lián)合刺激HaCaT細胞12 h做為HaCaT細胞表達TSLP和IL-33的最佳時間。

Fig 3 Changes of TSLP and IL-33 levels in HaCaT cells under combined stimulants by ELISA A:TSLP; B:IL-33；*P<0.05,**P<0.01 vs control

Fig 5 Time-effect curve of TSLP and IL-33 expression of HaCaT cells in combined stimulants system A：TSLP：B：IL-33；**P<0.01 vs control

3 討論

近年來研究表明,角質(zhì)形成細胞在過敏性疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用，其分泌的細胞因子TSLP和IL-33作為關鍵啟動因子可能成為干預過敏性疾病的重要靶點[5-6]。TSLP主要由上皮細胞和肥大細胞分泌。屬 IL-7家族成員，其受體由IL -7 Rα和TSLPR組成。TSLP與受體結合后引起過敏性炎癥反應[7]。IL-33是最新發(fā)現(xiàn)的IL-1家族成員，是一個組織來源的細胞因子[8]。其受體為ST2，兩者結合可以介導Th2免疫反應[9]。本研究通過篩選角質(zhì)形成細胞中TSLP和IL-33表達的最佳刺激條件來建立適宜的過敏性疾病細胞模型。Toll樣受體(TLRs)作為連接天然免疫與特異性免疫的關鍵元件,在炎癥反應、細胞信號轉導方面起重要作用[10]。前期研究報道，TLR2、3、4、8、9與上皮細胞分泌TSLP和IL-33聯(lián)系密切，尤其是TLR3和TLR4[11]，它們的配體分別是Poly(I:C)和LPS，能介導過敏性炎癥反應。TNF-α也是過敏性疾病中的一種重要免疫調(diào)節(jié)因子，在炎性免疫反應中調(diào)控部分炎性介質(zhì)并協(xié)同刺激T淋巴細胞分泌細胞因子[12]。另有報道蛋白激酶C(PKC)的激活物PMA和Tryspin也被用于過敏性疾病研究中。PKC可激活下游蛋白激酶的磷酸化形成級聯(lián)反應，引起T細胞活化，促進IL-33及其受體的表達[13,14]。而細胞結構完整性和通透性的破壞，也會影響細胞膜的免疫應答、細胞分裂與分化等功能，Tryspin可使黏蛋白膜水解，導致上皮細胞間連接蛋白表達減少，繼而促進TSLP的表達增多，引發(fā)Th2型過敏性反應[15]。

本實驗選擇Poly(I:C)、TNF-α、LPS、PMA和Trypsin等5種刺激劑對HaCaT細胞進行刺激，觀察不同刺激劑和不同培養(yǎng)環(huán)境對HaCaT細胞分泌TSLP和L-33細胞因子的影響,并根據(jù)TSLP和IL-33的表達水平進而考察不同刺激條件時的量效關系和時效關系，篩選出Poly(I:C)100 mg·L-1與TNF-α 20 μg·L-1聯(lián)合刺激HaCaT細胞12 h后TSLP和IL-33的表達水平升高最為明顯。該實驗獲得了HaCaT細胞分泌TSLP和IL-33的最佳刺激條件，將此作為過敏性疾病體外細胞模型來模擬過敏性疾病的致病因素和病理過程，為探索藥物對過敏性疾病初期的作用及其機制提供了實驗依據(jù)。

Fig 4 Effects of combined stimulants on TSLP(A)and IL-33(B) levels of HaCaT cells in co-culture system (immunofluorescence，A，×630；B，×200)

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Observation of adequate stimulus methods for key initiative factor expression in human keratinocytes of anaphylactic disease

LIU Hai-liang,BAO Kai-fan,JIANG Xiao-yan,WEI Xiao,YU Xi,TAO Yu,WANG Xiao-yu,WANG Yan,HONG Min

(SchoolofPharmacy,NanjingUniversityofChineseMedicine,NationalStandardLaboratoryofPharmacologyforChineseMateriaMedica,JiangsuKeyLaboratoryforPharmacologyandSafetyEvaluationofChineseMateriaMedica,Nanjing210023,China)

Aim To explore the expressed level of initiative key factors TSLP and IL-33 in a human keratinocyte cell line, HaCaT cells were chosen to be stimulated by different stimulants, and develop a stable and effectiveinvitromodel to observe allergic sensitization. Methods HaCaT cells were cultured in K-SFM with different stimulants to screen out the stimulants which could significantly improve the expressed level of TSLP and IL-33. Expressed level of TSLP and IL-33 was analyzed by ELISA kits and immunofluorescence. Results (1) The dose-response relationship of single stimulant indicated that both Poly(I:C) and TNF-α could significantly improve expressed level of TSLP and IL-33 in HaCaT cells, but the rest of stimulants was not observed significant stimulation in concentration range of this experiment. (2) Dose- effect relationship of combined stimulants indicated that poly(I ∶C)100 mg·L-1combined with TNF-α 20 μg·L-1was the most efficient. (3) Time-effect relationship of the above-mentioned combined stimulants showed that 12 h was the optimal time of stimulation. Conclusions Different stimulants and different time result in various expressed levels of TSLP and IL-33 in HaCaT cells. 12 h stimulus duration of Poly(I:C)100 mg·L-1combined with TNF-α 20 μg·L-1is the most efficient stimulating way. This result provides an effectiveinvitromodel to study the pathomechanism and drug efficacy of allergic sensitization.

HaCaT cells;anaphylactic disease;Poly(I:C); TNF-α; TSLP; IL-33

時間：2015-3-16 15:41 網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150316.1541.013.html

2014-11-17,

2015-02-16

國家自然科學基金資助項目(No 81473395、81373549、81073121)；江蘇省自然科學基金資助項目(No BK20141466)；江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目；江蘇省‘青藍工程’資助

劉海亮(1989-)，男，碩士生，研究方向: 免疫藥理學，E-mail:18252066889@163.com; 洪 敏(1972-)，女，博士，教授，研究員，博士生導師，研究方向: 中藥免疫藥理學，通訊作者，E-mail: hongmin72@hotmail.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.04.027

A

1001-1978(2015)04-0576-06

R329.24；R392.12；R593.102.2