高糖對大鼠血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的影響及其機(jī)制*

張 靜， 楚海榮， 郭 英， 劉建華， 李文憑， 李 宏， 成 敏△

(1. 濰坊醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院， 2. 濰坊醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)中心， 山東濰坊 261053)

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高糖對大鼠血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的影響及其機(jī)制*

張 靜1， 楚海榮2+， 郭 英1， 劉建華2， 李文憑1， 李 宏2， 成 敏2△

(1. 濰坊醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院， 2. 濰坊醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)中心， 山東濰坊 261053)

目的：探討高糖對大鼠血管平滑肌細(xì)胞( VSMCs)表型轉(zhuǎn)化的影響及機(jī)制。方法：大鼠VSMCs由組織貼壁法培養(yǎng)獲得，以3～5代細(xì)胞為靶細(xì)胞，待細(xì)胞融合后用含有2%胎牛血清的DMEM孵育12 h，再置于正常組(5.5 mmol/L glucose)、高糖(25 mmol/L glucose)、高糖+P38抑制劑SB203580的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分析各組VSMCs合成型標(biāo)志蛋白OPN、收縮型標(biāo)志蛋白α-SMA及基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9的基因表達(dá)情況；Western blot檢測各組OPN、α-SMA和磷酸化P38的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：①高糖促進(jìn)了VSMCs的表型由收縮型轉(zhuǎn)化為合成型，同時(shí)上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的表達(dá)；②高糖能促進(jìn)P38蛋白的磷酸化,增加磷酸化P38的蛋白表達(dá)量；③P38/MAPK信號(hào)通路抑制劑SB203580明顯抑制了高糖促進(jìn)VSMCs表型轉(zhuǎn)化及MMP-2、MMP-9表達(dá)的效應(yīng)。結(jié)論：高糖能通過P38/MAPK信號(hào)通路促進(jìn)VSMCs的表型轉(zhuǎn)化。

大鼠，平滑肌細(xì)胞，高糖，表型轉(zhuǎn)化，P38/MAPK信號(hào)通路

糖尿病心腦血管并發(fā)癥是影響人體生命健康的主要原因。研究顯示，血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)具有收縮型和合成型兩種表型，其表型由收縮型向合成型轉(zhuǎn)化是一系列心腦血管并發(fā)癥(血管狹窄后重構(gòu)和動(dòng)脈粥樣硬化)發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵性起始步驟，且合成型的平滑肌細(xì)胞能促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移、調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的分泌[1]。研究已證實(shí)，高糖作為糖尿病心血管并發(fā)癥

的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可以促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移[2，3]，但目前有關(guān)高糖對平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的影響及報(bào)道甚少。本研究旨在探討高糖對血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的影響其可能機(jī)制，為臨床糖尿病心血管并發(fā)癥的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM高糖型和正常型培養(yǎng)基(HyClone公司，美國)；胰蛋白酶(HyClone公司，美國)；胎牛血清(HyClone公司，美國)；OPN抗體、α-SMA抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；磷酸化的P38單克隆抗體(cell signaling公司)；HRP-山羊抗兔抗體(北京中杉金橋生物有限公司)；小鼠抗β-actin抗體(北京中杉金橋生物有限公司)；HRP-山羊抗小鼠抗體(碧云天生物技術(shù)研究所)；BCA蛋白濃度試劑盒(Thermo scientific公司)；5% CO2培養(yǎng)箱(Thermo，美國)；TRIzol(Invitrogen公司)；熒光定量PCR儀( Bio-RadIQ5)，SYBR PrimeScriptaRT-PCR Kit II 及相關(guān)引物設(shè)計(jì)合成( 大連寶生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠胸主動(dòng)脈VSMCs的分離、培養(yǎng)和鑒定 按照本室以往的方法[4]：將頸椎脫臼處死的大鼠于75%的酒精中浸泡15 min?？v向剪開無菌分離的大鼠胸主動(dòng)脈管腔并去除內(nèi)膜。移入超凈臺(tái)內(nèi)盛有20%DMEM的無菌器皿中剪成2 mm×5 mm小塊，用吸管移入含4 ml培養(yǎng)液的25 ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，讓細(xì)胞分散粘貼在培養(yǎng)瓶壁上，倒放。在5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)4～6 h后輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，讓培養(yǎng)液緩慢沒過組織塊，繼續(xù)靜置培養(yǎng)。待細(xì)胞生長到80%左右時(shí)，用0.25%胰蛋白酶1∶1傳代。在倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)的細(xì)胞并拍照，用特異性α平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha smooth-actin,α-SMA)進(jìn)行免疫熒光染色。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 將處于對數(shù)生長期3～5代的平滑肌細(xì)胞按4×105cells/ml的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)90%時(shí)，用含2%胎牛血清的正常DMEM同步化12 h后，分組如下:(1)正常組(5.5 mmol/L glucose)；(2)高糖組(25 mmol/L glucose)；(3)高糖+P38抑制劑SB203580組。

1.2.3 熒光定量RT-PCR檢測OPN、α-SMA和基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9基因的表達(dá) 按TRIzol試劑說明書提取總RNA，溶于DEPC水中，-80℃保存?zhèn)溆?。SYBRGreen熒光定量RT-PCR檢測各組OPN、α-SMA、MMP-2和MMP-9的基因表達(dá)量。相關(guān)基因引物由大連寶生物設(shè)計(jì)合成，其序列如表1所示。實(shí)驗(yàn)中陰性對照為超純水(無RNA酶，PCR級)，內(nèi)參為管家基因GAPDH。按2-ΔΔCt計(jì)算各組的擴(kuò)增效率。

Tab. 1 Oligonucleotide primers used for reverse transcription-polymerase chain reaction

GenesSequencesofprimersOPNForwardprime:5'-GCATCCTTGGCTTTG-CAGTC-3'Reverseprime:5'-TGGCTACAGCATCTGAGT-GTTTG-3'α-SMAForwardprime:5'-AGCCAGTCGCCATCAG-GAAC-3'Reverseime:5'-CCGGAGCCATTGTCACACAC-3'MMP-2Forwardprime:5'-TCCCGAGATCTGCAAG-CAAG-3'Reverseprime:5'-AGAATGTGGCCACCAG-CAAG-3'MMP-9Forwardprime:5'-AGCCGGGAACGTATCTG-GA-3'Reverseprime:5'-TGGAAACTCACACGC-CAGAAG-3'GAPDHForwardprime:5'-GGCACAGTCAAGGCT-GAGAATG-3'Reverserime:5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAG-TA-3'

1.2.4 Western blot檢測磷酸化P38、OPN和α-SMA的蛋白表達(dá) 按照蛋白提取試劑說明書提取細(xì)胞蛋白,在4℃ 12 000 r/min條件下離心5 min,抽取上清，放置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。將蛋白上清與SDS-PAGE上樣緩沖液按比例充分混勻，100℃恒溫水浴鍋中加熱5 min后于-20℃冰箱保存。于12%聚丙烯酰胺凝膠中上樣(50 μg/well)進(jìn)行還原性SDS PAGE電泳約3.5 h，轉(zhuǎn)膜(PVDF膜)用濕轉(zhuǎn)法，200 mA恒流50 min。用5%的BSA封閉1 h,在4℃孵育一抗(P-P38 1∶1 000,OPN 1∶300, α-SMA 1∶400)過夜，用TBST震蕩洗滌5×10 min/count，在室溫條件下孵育二抗山羊抗兔抗體(1∶5 000)1 h, 用TBST震蕩洗滌5×10 min，用ECL發(fā)光試劑在暗室中顯色，結(jié)果用圖像分析軟件Gel-Pro analyzer對目的條帶進(jìn)行掃描和密度分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 VSMCs的分離、培養(yǎng)和鑒定

原代細(xì)胞培養(yǎng)4～7 d, 有細(xì)胞以組織塊為中心呈放射狀萌出。細(xì)胞向外生長形成細(xì)胞暈，進(jìn)而形成細(xì)胞簇。胞體呈長梭形、三角形或不規(guī)則形，有多個(gè)突起，長短不一，胞核呈卵圓形居中，有多個(gè)核仁。原代細(xì)胞體積小，折光性強(qiáng)；傳代后的細(xì)胞體積增大，折光性減弱，呈典型的“峰-谷”狀生長。α-SMA免疫熒光染色陽性。

2.2 高糖對VSMCs表型轉(zhuǎn)化的影響

在高糖狀態(tài)下，VSMCs合成型標(biāo)志蛋白OPN的基因表達(dá)量明顯升高，為正常組的(2.84±0.19)倍；而收縮型標(biāo)志蛋白α-SMA的基因表達(dá)量下降，為正常組的(0.62±0.09)倍，表明高糖促進(jìn)了VSMCs由收縮型向合成型轉(zhuǎn)化(圖1)。

2.3 高糖對平滑肌細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-2和基質(zhì)金屬蛋白酶-9基因表達(dá)的影響

基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9在高糖組的基因表達(dá)量分別為(0.244±3.118)、(0.442±2.221)較正常組 (0.163±0.899)、 (0.171±0.912)明顯升高(P<0.01)。SB203580組的基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的基因表達(dá)量分別為(0.148±0.423)、(0.147±0.628)均較高糖組(0.442±2.221)、(0.244±3.118)明顯降低(P<0.01，圖2)。

2.4 高糖對VSMCs磷酸化P38蛋白表達(dá)的影響

與正常組相比，正常組磷酸化P38的蛋白表達(dá)量較少(0.103±0.003)，高糖處理明顯增加了磷酸化P38的蛋白表達(dá)量(0.477±0.013 )(P<0.01,圖3)。

2.5 P38/MAPK信號(hào)通路抑制劑SB203580對VSMCs表型轉(zhuǎn)化的影響

基因結(jié)果顯示：P38/MAPK信號(hào)通路抑制劑SB203580抑制了高糖對VSMCs表型轉(zhuǎn)化的影響，蛋白結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)：合成型標(biāo)志蛋白OPN的表達(dá)量下降而收縮型標(biāo)志蛋白α-SMA的表達(dá)量升高(P<0.05，圖4)。

3 討論

在糖尿病患者中，心血管并發(fā)癥是危害人體健康的主要疾病。長期的高血糖除了引起內(nèi)皮損傷、血小板黏附、導(dǎo)致血栓形成外，同時(shí)炎性細(xì)胞向受損內(nèi)皮處聚集并釋放大量炎性因子，刺激內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞增殖，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[5]。VSMCs是組成血管壁的主要細(xì)胞，具有收縮型(分化型)和合成型(去分化型)兩種表型。在健康血管中，VSMCs位于血管壁的中膜，處于分化狀態(tài)。當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損或受其他因素刺激時(shí)，處于分化狀態(tài)的VSMCs會(huì)返回去分化狀態(tài)，并獲得增殖和遷移等能力。VSMCs的表型轉(zhuǎn)化在心血管疾病如動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、哮喘和血管動(dòng)脈瘤中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。揭偉等的研究表明，高糖能上調(diào)大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞骨橋蛋白表達(dá)[6]。在本實(shí)驗(yàn)中，高糖能促進(jìn)VSMCs表型由收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚?，即收縮型標(biāo)志分子α-SMA的基因和蛋白表達(dá)降低，而合成型標(biāo)志分子OPN的基因和蛋白表達(dá)增加。與此同時(shí)，合成型的VSMCs表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的水平也明顯增高。此外，基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的表達(dá)能促進(jìn)VSMCs由血管壁的中膜向內(nèi)膜下遷移，促進(jìn)血管形成新生內(nèi)膜，從而加速了動(dòng)脈粥樣硬化的形成[7]。

研究顯示，多條信號(hào)通路參與了VSMCs表型轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)，其中蛋白質(zhì)的磷酸化是其改變基因表達(dá)的直接方式[8]。P38/MAPK是參與細(xì)胞內(nèi)炎癥反應(yīng)的重要信號(hào)通路,可被多種細(xì)胞外刺激激活由非磷酸化狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿峄癄顟B(tài), 通過促進(jìn)下游底物的磷酸化實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞生長、增殖、分化和某些因子表達(dá)的調(diào)控[9，10]。李艷波等的研究表明，高糖可激活P38/MAPK信號(hào)通路，促使細(xì)胞產(chǎn)生單核細(xì)胞趨化因子MCP-1、環(huán)氧化酶COX-2、G蛋白偶聯(lián)趨化因子受體CXCR3等，進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成[11，12]。在本實(shí)驗(yàn)中，高糖促進(jìn)了VSMCs由收縮型轉(zhuǎn)化為合成型，同時(shí)高糖組磷酸化的P38蛋白表達(dá)量明顯增加。然而，當(dāng)用SB203580特異性的抑制P38/MAPK信號(hào)通路后，VSMCs的表型轉(zhuǎn)化受到抑制，同時(shí)其分泌的MMP-2和MMP-9也明顯減少，說明P38/MAPK信號(hào)通路介導(dǎo)了高糖誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化。

總之，高糖可通過P38/MAPK信號(hào)通路促進(jìn)VSMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，增加MMP-2和MMP-9的分泌，增強(qiáng)其對基底膜的降解能力，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成。本結(jié)果完善了糖尿病患者高發(fā)心血管疾病的機(jī)制，為臨床糖尿病心血管并發(fā)癥的防治提供了理論依據(jù)。

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The effects and mechanisms of high glucose on the phenotype transformation of rat vascular smooth muscle cells

ZHANG Jing1, CHU Hai-rong2+, GUO Ying1, LIU Jian-hua2, LI Wen-ping1, LI Hong2, CHENG Min2△

(1. Clicinal College, Weifang Medical University, 2. Medicine Research Center, Weifang Medical University, Weifang 261053, China)

Objective: To investigate the effects and mechanisms of high glucose on the phenotype transformation of rat vascular smooth muscle cells (VSMCs). Methods: VSMCs were isolated from rat thoracic aorta and the 3rd～5thVSMCs were incubated with normal glucose (5.5 mmol/L), high glucose (25 mmol/L), or high glucose (25 mmol/L) +P38 inhibitor(25 mmol/L+SB203580) for another 24 hours.Then the gene expression of osteopontin(OPN), alpha smooth-actin(α-SMA),matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and matrix metalloproteinase-9(MMP-9) were assayed by real time RT-PCR, the protein expression of P38 were assayed by Western blot. Results: ①High glucose promoted the phenotype transformation of VSMCs and up-regulated the expression of MMP-2 and MMP-9. ②High glucose promoted the phosphorylation of P38. ③SB203580, the inhibitor of P38/MAPK signal pathway, inhibited the effects of high glucose on phenotype transformation and expression of MMP-2 and MMP-9. Conclusion: High glucose may promote phenotype transformation of VSMCs via the signal pathway of P38/MAPK.

rat; vascular smooth muscle cells; high glucose; phenotype transformation; P38/MAPK

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30900290，31270993)；國家教育部“新世紀(jì)優(yōu)秀人才計(jì)劃”資助項(xiàng)目(NCET10-0922)；山東省自然科學(xué)基金(ZR2013CQ032)；山東省高等學(xué)?？萍加?jì)劃項(xiàng)目(J11LF17)；山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2013-239)

2015-01-26 【修回日期】2015-06-09

R331.3

A

1000-6834(2015)05-458-04

10.13459/j.cnki.cjap.2015.05.019

△【通訊作者】Tel： 0536-8462463； E-mail： chengmin1976@wfmc.edu.cn；+： 共同第一作者