高原鼠兔血清中N-isopropyl oxamate的RP-HPLC檢測方法的建立*

汪 洋， 魏 蓮， 魏琳娜， 李 筱， 許利娜， 魏登邦

(青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心， 西寧 810016)

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高原鼠兔血清中N-isopropyl oxamate的RP-HPLC檢測方法的建立*

汪 洋， 魏 蓮， 魏琳娜， 李 筱， 許利娜， 魏登邦△

(青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心， 西寧 810016)

目的：探索N-isopropyl oxamate和血清蛋白結(jié)合水平，建立高原鼠兔血液中精子型乳酸脫氫酶(LDH-C4)特異性抑制劑N-isopropyl oxamate的高效液相色譜(HPLC)檢測方法。方法：取體重150～200 g高原鼠兔20只，隨機(jī)分為對照組和抑制劑組(n=10)。通過外源性加入不同濃度的N-isopropyl oxamate，檢測其與血清蛋白的結(jié)合水平。采用將血清先用胰蛋白酶酶解，再加入三氯乙酸的前處理法進(jìn)行HPLC檢測。結(jié)果：當(dāng)空白高原鼠兔血清加入抑制劑標(biāo)準(zhǔn)品達(dá)到血清中濃度為0.05 mmol/L、0.1 mmol/L、1 mmol/L、10 mmol/L、16.7 mmol/L、33.3 mmol/L、100 mmol/L時(shí)，抑制劑與血清蛋白的結(jié)合率分別為100%、100%、100%、86.84%、54.11%、40.10%、20.18%。在本文建立的方法下，回收率、精密度、穩(wěn)定性均良好。N-isopropyl oxamate在0.0125～0.25 mmol/L內(nèi)濃度與峰面積線性關(guān)系好。空白血清加入標(biāo)準(zhǔn)品達(dá)到終濃度為0.15 mmol/L、0.3 mmol/L和 1 mmol/L時(shí)，平均回收率分別為98.05%、98.98%、98.12%；精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.17%、0.92%、0.83 %；穩(wěn)定性RSD分別為1.38%、1.40%、0.88%。方法的重復(fù)性RSD為1.76%，最低定量限為0.0125 mmol/L。結(jié)論：N-isopropyl oxamate與高原鼠兔血清具有很強(qiáng)的親和力，直接用三氯乙酸沉淀蛋白的前處理方法無法準(zhǔn)確檢測其濃度，而先用胰蛋白酶消化血清，再用三氯乙酸沉淀蛋白的方法可實(shí)現(xiàn)血液中HPLC的精確檢測。

高原鼠兔；精子型乳酸脫氫酶；N-isopropyl oxamate；高效液相色譜

精子型乳酸脫氫酶是乳酸脫氫酶的一種同工酶，乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)同工酶亞基由ldh-a，ldh-b和ldh-c三個(gè)等位基因控制合成[1,2]。精子型乳酸脫氫酶是一種乳酸脫氫酶C(LDHC)亞基組成的同源四聚體(LDH-C4)[1,2]。LDH-C4對丙酮酸的親和力是對乳酸親和力的60多倍，且酶促反應(yīng)不易受高濃度乳酸抑制，有利于無氧糖酵解的進(jìn)行[3-5]。

先前的研究認(rèn)為，LDHC只在鳥類和哺乳類的精子細(xì)胞中表達(dá)，而在體細(xì)胞中不表達(dá)[6]。本室的研究發(fā)現(xiàn)，LDHC不僅在高原鼠兔精子中表達(dá)，而且在其心、肝、肺、腎、腦和骨骼肌細(xì)胞中表達(dá)，其中骨骼肌中的表達(dá)水平較高[7]。高原鼠兔是青藏高原特有的一種高原動(dòng)物，分布在海拔3 000～5 000 m 的高寒草原，其生存環(huán)境的顯著特征是低氧，高原鼠兔對低氧環(huán)境有很強(qiáng)的適應(yīng)性[8-12]。依據(jù)LDHC的酶促動(dòng)力學(xué)特征，推測LDH-C4在高原鼠兔體細(xì)胞中的表達(dá)與高原鼠兔適應(yīng)低氧環(huán)境有關(guān)。

N-isopropyl oxamate是對LDH-C4具有較高特異性的抑制劑[5,13,14]，當(dāng)其濃度低于0.1 mmol/L時(shí)，對LDH-A4和LDH-B4的酶活力沒有明顯的抑制效果，但對LDH-C4的酶活力抑制效果達(dá)到70%；當(dāng)其濃度達(dá)到10 mmol/L，它不僅抑制LDH-C4的酶活力，而且對LDH-A4和LDH-B4也表現(xiàn)出抑制作用[5]。為了研究LDH-C4在高原鼠兔體細(xì)胞中的功能及作用機(jī)理，我們用1 mmol/L濃度的N-isopropyloxamate通過腹腔注射和肌肉注射高原鼠兔，應(yīng)用高效液相色譜法測定血清無蛋白濾液中的抑制劑濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論是腹腔注射還是肌肉注射，在抑制劑濃度為1 mmol/L，注射劑量為3 ml、2 ml、1 ml時(shí)，按傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑法前處理得到的血清無蛋白濾液中均檢測不出抑制劑。

我們推測，原因可能是由于血清中LDH-C4與N-isopropyl oxamate親和力高，當(dāng)沉淀血清蛋白時(shí)，抑制劑隨蛋白而沉淀。因此，本文先采用胰蛋白酶酶解血清蛋白，再進(jìn)行有機(jī)溶劑沉淀法制備無蛋白濾液，應(yīng)用高效液相色譜建立了高原鼠兔血液中N-isopropyl oxamate測定方法，以便控制抑制劑的劑量,以此建立一種簡便有效的檢測血液中與血清蛋白高親合力化合物的新方法。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

Agilent 1260 HPLC 高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，配備G1354A 四元泵，G1313A自動(dòng)脫氣機(jī)，G1316A 柱溫箱，G1315 二極管陣列檢測器(DAD)和G1329 自動(dòng)進(jìn)樣器；離心機(jī)(Eppendorf 5430R，美國Eppendorf公司)；高效液相色譜分析用甲醇為色譜純(山東禹王實(shí)業(yè)有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。其它試劑：胰蛋白酶(1∶250，北京索萊寶生物科技有限公司)、三氯乙酸(天津凱通化學(xué)試劑有限公司)、0.9%生理鹽水(山東華魯制藥有限公司)。N-isopropyl oxamate按照文獻(xiàn)方法[13]合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、給藥及樣品采集

高原鼠兔捕捉于青海省海南州貴德縣拉脊山(北緯36°72′，東經(jīng)101°28′，海拔3 900 m)。樣本量20只，體重150～200 g，隨機(jī)分為2組(n=10)。第1組為空白對照組，注射1 ml 0.9%生理鹽水于高原鼠兔股二頭肌，雙側(cè)各注射500 μl；第2組為抑制劑組，注射1 ml 1 mmol/L抑制劑N-isopropyl oxamate于高原鼠兔股二頭肌，雙側(cè)各注射500 μl。所有動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)前靜息30 min，動(dòng)物用5%戊巴比妥鈉麻醉，采集血液并4℃保存。血液于4℃，5 000 r/min離心10 min，取血清。實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物處理方法均按照國家《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例(GB14923-2010)》執(zhí)行。

1.3 N-isopropyl oxamate與高原鼠兔血清蛋白的結(jié)合率測定

1.3.1 計(jì)算血清蛋白結(jié)合率的標(biāo)準(zhǔn)曲線 精確稱取N-isopropyl oxamate標(biāo)準(zhǔn)品1.31 g，溶于0.9% 生理鹽水并定容至10 ml，即為1 mol/L，再分別用流動(dòng)相稀釋得到濃度為0.05 mmol/L、0.1 mmol/L、1 mmol/L、10 mmol/L、16.7 mmol/L、33.3 mmol/L和100 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。各濃度進(jìn)樣量均為50 μl，每種濃度做5份樣品，以平均峰面積對標(biāo)準(zhǔn)品濃度進(jìn)行回歸計(jì)算，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。色譜條件：色譜柱 C18(Platisil ODS 5 μm，250×4.6 mm，Cat: 99503，USA)。流動(dòng)相：水(A)-甲醇(B)梯度洗脫(0～40 min，B：10%～55%)。流速 1 ml/min，柱溫25℃，檢測波長230 nm。

1.3.2 高原鼠兔血清對N-isopropyl oxamate結(jié)合率的測定 各取250 μl空白組高原鼠兔血清按比例加入N-isopropyl oxamate標(biāo)準(zhǔn)品，使抑制劑在血清中的濃度分別達(dá)到0.05 mmol/L、0.1 mmol/L、1 mmol/L、10 mmol/L、16.7 mmol/L、33.3 mmol/L、100 mmol/L，再分別加入等體積10%三氯乙酸溶液，震蕩使其充分混勻，10 000 r/min離心10 min，取上清進(jìn)樣，各濃度進(jìn)樣量均為100 μl。

通過色譜峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用外標(biāo)法計(jì)算血清樣品經(jīng)三氯乙酸溶液沉淀蛋白后上清中的標(biāo)準(zhǔn)品濃度。結(jié)合率=(三氯乙酸處理前血清中標(biāo)準(zhǔn)品濃度-三氯乙酸處理后上清中剩余標(biāo)準(zhǔn)品濃度)/三氯乙酸處理前血清中標(biāo)準(zhǔn)品濃度×100%。

1.4 高原鼠兔血清中N-isopropyl oxamate高效液相色譜檢測方法的建立

1.4.1 樣品測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線 稱取N-isopropyl oxamate標(biāo)準(zhǔn)品65.5 mg，溶于0.9% 生理鹽水并定容至50 ml，即為10 mmol/L，再分別用流動(dòng)相稀釋至0.0125 mmol/L、0.025 mmol/L、0.05 mmol/L、0.1 mmol/L、0.15 mmol/L、0.2 mmol/L、0.25 mmol/L。各濃度進(jìn)樣量均為50 μl。每種濃度做5份樣品，以平均峰面積對標(biāo)準(zhǔn)品濃度進(jìn)行回歸計(jì)算，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。按信號/噪音=10計(jì)算最低定量限。

1.4.2 樣品前處理 取抑制劑組和空白對照組高原鼠兔血清各250 μl，95℃水浴15 min 熱變性，加入250 μl 10%胰蛋白酶(1∶250)，充分?jǐn)嚢杌靹颍?2℃水浴孵育12 h，再加入等體積(500 μl)10%三氯乙酸溶液，震蕩使其充分混勻，10 000 r/min離心10 min，取上清進(jìn)樣，進(jìn)樣量均為100 μl。色譜條件同1.3.1。

1.4.3 回收率、精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取空白對照組高原鼠兔血清加入抑制劑標(biāo)準(zhǔn)品，使抑制劑在血清中的濃度分別達(dá)到0.15 mmol/L、0.3 mmol/L和1 mmol/L，各取5份按1.4.2方法處理并進(jìn)樣分析，測定峰面積，測定值與相同濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液測定值相比計(jì)算平均回收率(n=5)及精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation, RSD)(n=5)。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取上述配制的血清樣品各5份，分別室溫放置0 h、2 h、4 h、6 h和24 h，按1.4.2方法處理并進(jìn)樣分析，測定峰面積，計(jì)算3個(gè)濃度血清樣品的RSD。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一抑制劑組高原鼠兔血清按1.4.2方法分別處理5次并進(jìn)樣分析，測定峰面積，計(jì)算RSD。

2 結(jié)果

2.1 N-isopropyl oxamate與高原鼠兔血清蛋白結(jié)合率的標(biāo)準(zhǔn)曲線及計(jì)算結(jié)果

按1.3.2方法處理后，當(dāng)空白高原鼠兔血清中抑制劑濃度為10 mmol/L、16.7 mmol/L、33.3 mmol/L、100 mmol/L時(shí)，N-isopropyl oxamate與高原鼠兔血清蛋白結(jié)合率分別為86.84%、54.11%、40.10%、20.18%；當(dāng)血清中抑制劑濃度為0.05 mmol/L、0.1 mmol/L、1 mmol/L時(shí)，上清中檢測不到抑制劑，N-isopropyl oxamate與血清蛋白結(jié)合率為100%，該濃度下抑制劑已全部與血清蛋白結(jié)合，在無蛋白濾液制備過程中隨蛋白而沉淀(圖1)。

Fig. 1 Standard curveand calculating result of intergrating rate between N-isopropyl oxamate and plateau pika serum A: Standard curve for calculating the intergrating rate; B: Calculating result of intergrating rate

2.2 高效液相色譜法檢測N-isopropyl oxamate的標(biāo)準(zhǔn)曲線

N-isopropyl oxamate在0.0125 mmol/L～0.25 mmol/L范圍內(nèi)濃度與峰面積有良好的線性關(guān)系，回歸方程y=1736x+1.346，r=0.999(圖2)。其峰型良好，無雜峰干擾，基線平穩(wěn)(圖3A)。

Fig. 2 HPLC standard curve of N-isopropyloxamate HPLC: High performance liqid chromato-graphy

2.3 高效液相色譜法檢測高原鼠兔血清中N-isopropyl oxamate的方法學(xué)考察

N-isopropyl oxamate標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間33 min(圖3A)。空白對照組高原鼠兔血清按1.4.2方法處理后，在30 min 左右各時(shí)間點(diǎn)均未出峰(圖3B)。空白對照組血清分別加入N-isopropyl oxamate標(biāo)準(zhǔn)品濃度達(dá)到0.15 mmol/L、0.3 mmol/L、1 mmol/L，按1.4.2方法處理后，31.3 min出峰(圖3C)，低、中、高三個(gè)濃度的回收率均達(dá)到98%以上，上清中抑制劑濃度與空白血清中標(biāo)準(zhǔn)品加入量一致，31.3 min即為空白血清加入標(biāo)準(zhǔn)品后的出峰時(shí)間。抑制劑組血清按1.4.2方法處理后，出峰時(shí)間也是31.3 min(圖3D)。因此可根據(jù)該處峰面積計(jì)算上清中N-isopropyl oxamate的濃度，1.4.2方法處理后的高原鼠兔血清樣品能實(shí)現(xiàn)HPLC的準(zhǔn)確檢測。

在1.4.2色譜條件下，N-isopropyloxamate峰形良好，無雜峰干擾，基線平穩(wěn)，最低定量限為0.0125 mmol/L。0.15 mmol/L、0.3 mmol/L、1 mmol/L三個(gè)濃度的平均回收率分別為98.05%、98.98%、98.12%；精密度RSD分別為1.17%、0.92%、0.83%；穩(wěn)定性RSD分別為1.38%、1.40%、0.88%。該方法的重復(fù)性RSD為1.76 %。本方法適用高原鼠兔血液中N-isopropyl oxamate的定量分析。

Fig. 3 HPLC chomatogram A: HPLC chomatogram of N-isopropyloxamate; B: HPLC chomatogram of supernatantof blank pika plasmawith the treatmentof 1.4.2; C: HPLC chomatogram of supernatantof blank pika plasma added 0.15 mmol/LN-isopropyloxamatefollowed with the treatment of 1.4.2; D: HPLC chomatograms of supernatantof the serum in the inhibition group pikaswith the treatment of 1.4.2; HPLC: High performance liquid chromatography

2.4 高原鼠兔血液中N-isopropyl oxamate含量的計(jì)算結(jié)果

當(dāng)注射1 ml 1 mmol/L N-isopropyl oxamate于高原鼠兔股二頭肌，雙側(cè)各注射500 μl，靜息30 min后，應(yīng)用HPLC檢測其血液中抑制劑濃度為(0.077±0.014)mmol/L。該濃度N-isopropyl oxamate對LDH-C4抑制率在70%左右，同時(shí)基本不抑制LDH-A4和LDH-B4(研究結(jié)果另行發(fā)布)。此濃度范圍可研究LDH-C4在高原鼠兔低氧適應(yīng)中發(fā)揮的作用。

3 討論

N-isopropyl oxamate作為LDH-C4特異性抑制劑，其高親和力和特異性歸結(jié)于其特殊的氨基酸組成[15]。小鼠LDH-C4中的甘氨酸、蘇氨酸、亮氨酸含量要明顯高于其它同工酶，如亮氨酸殘基比LDH-A4，LDH-B4高出40多個(gè)，亮氨酸的支鏈碳原子形成了疏水性的非極性基團(tuán)[5]。我們比對高原鼠兔的LDH同工酶的氨基酸組成發(fā)現(xiàn)，LDH-C4的異亮氨酸數(shù)量比LDH-A4、LDH-B4均高出20多個(gè)。這些亮氨酸或異亮氨酸的的疏水性結(jié)構(gòu)組成了LDH-C4酶活性中心區(qū)域，因此LDH-C4更容易與帶側(cè)鏈的非極性基團(tuán)結(jié)合[5]。N-isopropyl oxamate的分子組成與LDH-C4的底物相近且具有非極性的支鏈結(jié)構(gòu)，能與血清中LDH-C4緊密結(jié)合，利用常規(guī)的前處理方法無法將其分開。胰蛋白酶是一種高效的肽鏈內(nèi)切酶，已廣泛用于血液的酶解，能專一作用于由堿性氨基酸精氨酸和亮氨酸羧基所組成的肽鍵，有效打斷肽鏈，解離釋放N-isopropyl oxamate。

本文采用高原鼠兔血清中先加入胰蛋白酶42℃孵育12 h，使抑制劑與血清蛋白完全解離后，再加入三氯乙酸沉淀蛋白的前處理方法來檢測血液中N-isopropyl oxamate的濃度。此方法靈敏、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，0.15 mmol/L、0.3 mmol/L、1 mmol/L三個(gè)濃度的平均回收率分別為98.05%、98.98%、98.12%；精密度RSD分別為1.17%、0.92%、0.83 %；穩(wěn)定性RSD分別為1.38%、1.40%、0.88%。方法的重復(fù)性RSD為1.76%，最低定量限為0.0125 mmol/L。檢測結(jié)果顯示，當(dāng)注射1 ml 1 mmol/L抑制劑于高原鼠兔股二頭肌并靜息30 min后，血液中的抑制劑濃度為0.077 mmol/L。綜上可見，本文建立了一種HPLC的簡便有效的檢測方法。

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Establishment of RP-HPLC detection method of N-isopropyl oxamate in the serum of plateau pikas

WANG Yang, WEI Lian, WEI Lin-na, LI Xiao, XU LI-na, WEI Deng-bang△

(Research Center for High Altitude Medicine, Qinghai University, Xining 810016, China)

Objective: To explore the intergrating of N-isopropyl oxamate and serum protein and establish a high performance liquid chromatography(HPLC)detection method of N-isopropyl oxamate (specific inhibitor of testis-specific lactate dehydrogenase (LDH-C4)) in the blood of plateau pikas. Methods: Twenty highland pika 150～200 g,were randomly divided into two groups(n=10): control group and inhibitor group.Different concentrations of N-isopropyl oxamate were added to examine the intergrating of N-isopropyl oxamate and serum protein. In order to determine its concentration in the pika blood accurately, we used the method of adding trypsin to incubate the serum first, followed by trichloroacetic acid treatment and detecting by HPLC. Results: When the concentrations of N-isopropyl oxamate in the pika serum were added to 0.05 mmol/L, 0.1 mmol/L, 1 mmol/L, 10 mmol/L, 16.7 mmol/L, 33.3 mmol/L and 100 mmol/L, the intergrating rates between N-isopropyl oxamate and plateau pika serum were 100%, 100%, 100%, 86.84%, 54.11%, 40.10% and 20.18%, respectively. The method established in this paper was good on recovery rates, precision and stability. A good linearity was obtained in the range of 0.0125-0.25 mmol/L. When the concentrations of N-isopropyl oxamate in the serum were added to 0.15 mmol/L、0.3 mmol/L and 1 mmol/L, the recovery rates were 98.05%, 98.98% and 98.12%, respectively; the precision relative standard deviation( RSD) of concentrations were 1.17%, 0.92% and 0.83 %, respectively; the stability relative standard deviation (RSD) of concentrations were 1.38%, 1.40% and 0.88%, respectively. The repeatability RSD of the method was 1.76%. Quantitative limit was 0.0125 mmol/L. Conclusion: N-isopropyl oxamate has a strong affinity with plateau pika serum protein that can't be accurately determined with common HPLC method. It can be accurately determined in the blood by adding trypsinto digest the serum protein first, followed by adding trichloroacetic acid to precipitate the protein.

plateau pika; LDH-C4; N-isopropyl oxamate; RP-HPLC

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31260512)；青海省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2012-Z-905，2014-ZJ-714)

2015-01-12 【修回日期】2015-06-05

Q95-3

A

1000-6834(2015)05-469-05

10.13459/j.cnki.cjap.2015.05.022

△【通訊作者】Tel： +86 971 5310695； E-mail: weidengbang@163.com