氧化炎癥級聯(lián)反應(yīng)在二氯二丁基酯聯(lián)合乙醇誘發(fā)的小鼠胰腺纖維化進(jìn)展中的作用*

劉 芳， 史迎莉， 張曉芹， 許小凡， 陳 瑜， 張 紅△

(1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 2. 醫(yī)學(xué)科研實驗中心， 西安 712046)

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氧化炎癥級聯(lián)反應(yīng)在二氯二丁基酯聯(lián)合乙醇誘發(fā)的小鼠胰腺纖維化進(jìn)展中的作用*

劉 芳1， 史迎莉2， 張曉芹1， 許小凡2， 陳 瑜1， 張 紅2△

(1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 2. 醫(yī)學(xué)科研實驗中心， 西安 712046)

目的：探討胰腺氧化炎癥級聯(lián)反應(yīng)在二氯二丁基酯(DBTC)聯(lián)合乙醇誘發(fā)小鼠慢性胰腺炎胰腺纖維化進(jìn)展中的作用及機(jī)制。方法：健康昆明小鼠36只，隨機(jī)分為兩組(n=18)：對照組和模型組，模型組經(jīng)尾靜脈一次性注射DBTC(8 mg/kg)后加飲10%乙醇飼喂誘發(fā)慢性胰腺炎。造模后2、4、8周處死動物， HE及Masson膠原纖維染色觀察胰腺組織的病理學(xué)改變及纖維化程度，免疫組織化學(xué)法檢測F4/80的表達(dá)；制備胰腺組織勻漿檢測超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、髓過氧化物酶(MPO)的變化。結(jié)果：模型組小鼠HE染色和Masson染色顯示造模2周后可見成纖維細(xì)胞出現(xiàn)、巨噬細(xì)胞(F4/80陽染)浸潤，4周及8周巨噬細(xì)胞浸潤增加、伴隨胰腺實質(zhì)明顯減少并被大量纖維組織取代。胰腺組織勻漿SOD活性逐漸降低，MDA和MPO逐漸升高，與對照組同時間點相比，有顯著性差異(P<0.05)。結(jié)論：DBTC尾靜脈注射聯(lián)合飲用乙醇可以成功建立小鼠慢性胰腺炎胰腺纖維化模型，氧化炎癥級聯(lián)反應(yīng)在胰腺纖維化進(jìn)展中發(fā)揮重要的作用。

胰腺纖維化；氧化炎癥級聯(lián)反應(yīng)；F4/80；SOD；MDA；MPO；小鼠

慢性胰腺炎(chronic pancreatitis，CP)是胰腺實質(zhì)結(jié)構(gòu)局限性或彌漫性的慢性炎癥，胰腺腺泡和胰島細(xì)胞會出現(xiàn)不可逆性損害、萎縮或消失,引起不同程度胰腺內(nèi)、外分泌功能障礙，伴有難治性疼痛癥狀的疾病[1]。隨著生活水平的提高和檢查、診斷水平

的提升，發(fā)病率有明顯升高趨勢[2]。雖然CP的病因多樣，發(fā)病起始機(jī)制各異，但最終的病理結(jié)局大多是以胰腺纖維化為主要病理學(xué)特征[3]。慢性胰腺炎的病因復(fù)雜，在我國以膽源性疾病導(dǎo)致的膽管狹窄、梗阻為主要病因，二氯二丁基酯(dibutyltin dichloride ,DBTC)是脂溶性物質(zhì)，經(jīng)尾靜脈注射至動物體內(nèi)，經(jīng)肝臟、膽囊排泄至胰管，引起胰管上皮細(xì)胞損傷壞死，壞死的上皮細(xì)胞脫落聚集，阻塞胰膽管，造成類似臨床上的胰、膽管阻塞[4]，可成功復(fù)制胰腺炎模型。而慢性酒精中毒是西方國家慢性胰腺炎的主要病因，近年來因酒精引發(fā)的慢性胰腺炎在我國也呈現(xiàn)增多趨勢[5]。氧化炎癥級聯(lián)反應(yīng)(oxidative inflammatory cascade,OIC)，是指由炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)相互作用而引起的、通過正反饋調(diào)節(jié)的一系列事件，近年來成為研究炎癥反應(yīng)的熱點。本課題采用尾靜脈一次性注射DBTC聯(lián)合10%乙醇飲用復(fù)制小鼠慢性胰腺炎模型，觀察胰腺組織形態(tài)學(xué)、F4/80表達(dá)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)的變化，探討氧化炎癥級聯(lián)反應(yīng)在DBTC聯(lián)合乙醇誘發(fā)的小鼠胰腺纖維化模型中的作用。

1 材料與方法

1.1 藥品試劑和儀器

DBTC購于Sigma-Aldrich；大鼠抗小鼠F4/80單克隆抗體(sc-71088)購于Santa Cruz；即用型SABC免疫組化試劑盒(博士德試劑公司)；SOD、MDA和MPO試劑盒(南京建成生物研究所)；分光光度儀(DU530，Beckman)；顯微鏡及圖像采集系統(tǒng)(Zeiss A1)。

1.2 動物分組及造模

將健康昆明小鼠36只，購自第四軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心，動物合格證書號0001249 ( 6～8周齡，體重20～28 g)實驗前置清潔級環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，常規(guī)飼料，常規(guī)飲水，保持室溫在20℃～25℃，12 h晝夜交替，7 d后用于實驗研究。

DBTC 160 mg溶于40 ml無水乙醇，再緩慢加入生理鹽水至50 ml,搖至清亮(3.2 mg/ml)，經(jīng)尾靜脈一次性注射DBTC(8 mg/kg)后加飲10%乙醇(90 ml水+10 ml無水乙醇)替代正常飲水飼喂造模。

小鼠隨機(jī)分為對照組和模型組 (n=18)：對照組尾靜脈注射0.9%氯化鈉溶液(25 μl/10 g體重)，正常飲水；模型組尾靜脈注射DBTC，飲10%乙醇。造模后各組再在2周、4周和8周(n=6)3個時間點進(jìn)行后繼實驗。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 分別在造模后2周、4周、8周麻醉處死動物，完整摘除胰腺稱重，將部分胰腺用10%中性福爾馬林溶液固定，用于病理學(xué)觀察；部分胰腺新鮮組織液氮保存用于制作組織勻漿行SOD、MDA和MPO檢測。

1.3.2 胰腺組織的病理學(xué)觀察 胰腺組織經(jīng)脫水、包埋、切片，HE染色觀察各組小鼠胰腺組織的形態(tài)學(xué)改變；膠原纖維染色(Masson)石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，蘇木素浸染5 min， 1%鹽酸分化，Masson復(fù)合染色液(麗春紅0.7 g、酸性品紅0.3 g、冰醋酸1 ml、蒸餾水99 ml)浸染5 min， 1%的磷鉬酸液處理5 min，2%苯胺藍(lán)液復(fù)染5 min，1%冰醋酸水處理1 min，脫水，封片，觀察胰腺組織纖維化程度。

1.3.3 免疫組織化學(xué)法檢測胰腺F4/80表達(dá) 取相應(yīng)時間點小鼠胰腺石蠟切片，脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育5～10 min,羊血清封閉液室溫封閉30 min。滴加1∶300 稀釋的 F4/80 抗體， 4℃濕盒過夜,PBS清洗后滴加1∶500生物素化二抗孵育40 min，PBS清洗后DAB顯色，蘇木精復(fù)染，封片顯微鏡下觀察、拍照。

1.3.4 酶化學(xué)法檢測胰腺組織勻漿SOD、MDA和MPO的水平 將胰腺組織勻漿，按試劑盒說明書操作, 測定吸光度(A)值。根據(jù)公式計算標(biāo)本每毫克組織蛋白中SOD、 MDA和MPO 含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 胰腺組織病理學(xué)變化和纖維化程度

HE染色結(jié)果表明：模型組造模2周胰腺組織水腫，炎癥細(xì)胞浸潤，成纖維細(xì)胞出現(xiàn)；4周纖維化程度明顯，腺泡和胰腺萎縮，原有小葉結(jié)構(gòu)被增生的纖維組織分割，大量炎癥細(xì)胞浸；8周胰腺實質(zhì)組織結(jié)構(gòu)破壞明顯，纖維化程度加深，呈典型的慢性胰腺炎病理表現(xiàn)。Masson染色，2周藍(lán)染的膠原纖維在胰腺間質(zhì)中少量出現(xiàn)；4周和8周胰腺實質(zhì)腺泡明顯萎縮，大量藍(lán)染的膠原纖維在間質(zhì)中廣泛增生呈網(wǎng)格狀分隔胰島和腺泡細(xì)胞，呈現(xiàn)典型的慢性纖維化改變(圖1)。

Fig. 1 Pathological changes and the degree of fibrosis in the pancreas induced by DBTC plus ethanol (×200) DBTC: Dibutyltin dichloride

2.2 胰腺組織F4/80的表達(dá)變化

免疫組化法檢測發(fā)現(xiàn)：造模2周胰腺組織F4/80陽染的巨噬細(xì)胞數(shù)量較對照組明顯增加，隨著造模時間的延長，F(xiàn)4/80的表達(dá)進(jìn)一步增加，巨噬細(xì)胞浸潤更為顯著,并伴隨明顯的胰腺纖維化(圖2)。

Fig. 2 Macrophages infiltration in model group (×400)

2.3 胰腺組織勻漿SOD、MDA和MPO活性變化

DBTC尾靜脈注射聯(lián)合飲用乙醇后，隨造模時間延長胰腺組織中SOD活性持續(xù)降低，組間差異有顯著性(P<0.05,)；MDA持續(xù)升高，與對照組相應(yīng)時間點對比，有顯著性差異(P<0.05,)，且組間差異有顯著性(P<0.05,)。在造模2周、4周時，胰腺組織中MPO升高，與同時間點對照常組對比有明顯差異(P<0.05)；8周時MPO略有增高，與正常組相比無統(tǒng)計學(xué)差異，造模后各組之間差異有顯著性(P<0.05，表1)。

GroupSOD(U/mg·pro)MDA(nmol/mg·pro)MPO(U/)g·proControl2w389.89±7.915.90±0.140.70±0.134w387.63±3.556.29±0.980.73±0.128w389.27±6.055.19±0.620.65±0.14Model2w295.74±6.97*7.04±0.19*1.09±0.15*4w250.26±7.42*#9.22±0.31*#1.09±0.141*#8w184.87±9.20*△15.14±1.30*△0.72±0.14△

SOD： Superoxide dismutase； MDA： Malondialdehyde; MPO： Myeloperoxidase

*P<0.05vscontrol at the same time；#P<0.05vsmodel 2 w group;△P<0.05vsmodel 4 w group

3 討論

慢性胰腺炎是由于膽道疾患或長期飲酒引起的胰腺實質(zhì)局限性或彌漫性的慢性炎癥，腺泡和胰島細(xì)胞會出現(xiàn)不可逆性損害、萎縮或消失,引起不同程度的胰腺內(nèi)、外分泌功能障礙[6]。采用尾靜脈注射DBTC復(fù)制慢性胰腺炎模型的同時在飲水中加入乙醇，發(fā)現(xiàn)乙醇可以加劇胰腺損傷的強(qiáng)度和進(jìn)程。此方法誘發(fā)大鼠慢性胰腺炎模型已經(jīng)被多個實驗所證實[7,8]。但是由于小鼠的膽道解剖結(jié)構(gòu)與大鼠有所不同[9]，相同方法是否也會誘發(fā)小鼠慢性胰腺炎及其機(jī)制目前尚不清楚。

本文采用DBTC尾靜脈注射聯(lián)合長期飲用乙醇的方法復(fù)制小鼠慢性胰腺炎，是參照Vera Portocarrero等[10]在注射DBTC基礎(chǔ)上加10%的乙醇飼喂，加劇胰腺損傷的進(jìn)程和強(qiáng)度，產(chǎn)生較符合人類CP病理形態(tài)學(xué)特征及其血清學(xué)改變的CP模型， 通過這種單次注射，成功率可達(dá)80%，并且成本較低的造模方法來復(fù)制的CP模型，適合藥物治療研究。本實驗結(jié)果驗證此方法可以成功復(fù)制小鼠慢性胰腺炎胰腺纖維化模型。

近來有學(xué)者提出了氧化炎癥級聯(lián)反應(yīng)(oxidative inflammatory cascade，OIC)的概念，是指由炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)相互作用而引起的、通過正反饋調(diào)節(jié)的一系列事件[11]。氧自由基是炎癥反應(yīng)的效應(yīng)器，氧自由基的過度產(chǎn)生能誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)加重[12]。處于慢性氧化應(yīng)激狀態(tài)的機(jī)體，可以促使巨噬細(xì)胞活化，使炎癥復(fù)合物水平升高超過抗炎復(fù)合物的控制，引起機(jī)體促炎和抗炎網(wǎng)絡(luò)失衡和系統(tǒng)性的低度慢性亞臨床促炎狀態(tài)[13]。同時研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激反應(yīng)可以促進(jìn)細(xì)胞因子及黏附分子的釋放，增強(qiáng)炎癥細(xì)胞的黏附能力，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞在反應(yīng)局部浸潤、聚集、活化，引發(fā)局部炎性損傷。局部浸潤的炎癥細(xì)胞不僅可以促進(jìn)細(xì)胞因子的釋放，而且促進(jìn)局部的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。由此可見: 氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)二者可以相互作用使慢性炎癥得以持續(xù)，炎癥損傷不斷增強(qiáng)[14]。

越來越多的研究結(jié)果表明,氧化應(yīng)激在胰腺慢性炎癥和纖維化中起重要作用。氧化應(yīng)激反應(yīng)不僅是慢性胰腺炎病因之一，也伴隨疾病發(fā)展演變的過程[15]。SOD是一種生物活性蛋白質(zhì)，能有效地清除氧自由基，同時也是唯一的以自由基為底物的酶，在維護(hù)生物機(jī)體內(nèi)自由基產(chǎn)生與清除的動態(tài)平衡中起著重要的作用[16]。過多的氧自由基如果不能得到及時清除，將在組織中堆積，與細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸發(fā)生反應(yīng)，生成脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物MDA等引起炎癥反應(yīng)、組織損傷等改變。F4/80是成熟巨噬細(xì)胞表達(dá)的一種蛋白，是巨噬細(xì)胞活化的標(biāo)志。MPO是由中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞分泌的含血紅素輔基的血紅素蛋白酶，是血紅素過氧化物酶超家族成員之一，它可以催化底物過氧化氫和氯離子生成產(chǎn)物次氯酸鹽，并形成具有氧化能力的自由基，參與炎癥反應(yīng)的氧化應(yīng)激過程[17]。胰腺巨噬細(xì)胞浸潤增加的同時，胰腺組織勻漿MPO的活性也明顯升高，提示慢性胰腺炎纖維化進(jìn)展伴隨著巨噬細(xì)胞在胰腺浸潤聚集，從而導(dǎo)致髓過氧化物酶活性升高,氧化能力增強(qiáng)，產(chǎn)生過多的氧自由基。而此時由于胰腺的SOD活性降低，不能有效清除組織中的自由基，導(dǎo)致自由基在胰腺組織中堆積，與細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸發(fā)生反應(yīng)，則生成大量MDA，進(jìn)一步引起炎癥反應(yīng)、組織損傷。

本研究結(jié)果表明，DBTC尾靜脈注射聯(lián)合飲用乙醇是一種復(fù)制小鼠慢性胰腺炎的可靠方法，氧化應(yīng)激介導(dǎo)的自由基增加和炎癥細(xì)胞反應(yīng)在慢性胰腺炎胰腺纖維化中發(fā)揮了重要的作用，氧化炎癥級聯(lián)反應(yīng)在DBTC聯(lián)合乙醇誘發(fā)的小鼠胰腺纖維化進(jìn)展中發(fā)揮重要的作用，可以作為遏制慢性胰腺炎胰腺纖維化的靶點。

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The role of oxidative inflammatory cascade on pancreatic fibrosis progression in mice induced by DBTC plus ethanol

LIU Fang1, SHI Ying-li2, ZHANG Xiao-qin1, XU Xiao-fan2, CHEN Yu1, ZHANG Hong2△

(1. College of Basic Medicine, 2. Medical Research Center, Shanxi University of Chinese Medicine, Xi’an 712046, China)

Objective: To explore the role and mechanism of oxidative inflammatory cascade in pancreatic fibrosis progression of chronic pancreatitis(CP) in mice induced by dibutyltin dichloride (DBTC) plus ethanol. Methods: Thirty-six KM mice were randomly divided into 2 groups(n=18):control group and model group(DBTC combined with ethanol). The mice in model group were intravenously injected with DBTC (8 mg/kg) in tail vein and drink 10% ethanol. After modeling 2 weeks, 4 weeks and 8 weeks, the mice were anesthetized and sacrificed, the pathological changes and the degree of fibrosis in the pancreas were observed by HE and Masson staining, the F4/80 expression level were detected by immunohistochemistry, the content of superoxide dismutase(SOD), malondialdehyde(MDA)and myeloperoxidase(MPO)were measured in the pancreatic homogenates. Results: The fibroblasts and macrophages (f4/80 positive staining) could be seen obviously in pancreas of model group at 2 weeks. At 4 weeks and 8 weeks, macrophages infiltration increased and pancreatic tissue was substituted by the proliferation of fibrosis significantly. At every time-point，in pancreatic homogenates SOD was decreased, MDA and MPO markedly increased. There was significant differences between two groups(P<0.05). Conclusion: DBTC injection joint ethanol drinking can successfully establish the model of chronic pancreatitis and pancreatic fibrosis in mice. Oxidative inflammatory cascade plays an important role in the progression of pancreatic fibrosis.

mouse； pancreatic fibrosis； OIC； F4/80； SOD； MDA； MPO

國家自然科學(xué)基金(81102725)；陜西省中醫(yī)藥管理局項目(jc10)；陜西省教育廳自然科學(xué)基金資助項目(11JK0717，14JK1189)

2015-04-22 【修回日期】2015-06-23

R363

A

1000-6834(2015)05-477-04

10.13459/j.cnki.cjap.2015.05.024

△【通訊作者】Tel： 029-38183453； E-mail： zhangh1227@163.com