姜黃素對食管癌Ec109細胞增殖和PTEN/PI3K/Akt信號通路的影響*

李秀娟， 羅 強， 孫 黎， 劉 華， 金春亭， 范 婕△， 李玉珍

(1. 河北北方學院病理教研室， 2. 河北北方學院生命科學研究中心， 張家口 075000)

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姜黃素對食管癌Ec109細胞增殖和PTEN/PI3K/Akt信號通路的影響*

李秀娟1， 羅 強2， 孫 黎2， 劉 華2， 金春亭1， 范 婕1△， 李玉珍1

(1. 河北北方學院病理教研室， 2. 河北北方學院生命科學研究中心， 張家口 075000)

目的：觀察姜黃素對食管癌Ec109細胞增殖的抑制作用及腫瘤抑制基因/磷酯酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PTEN/PI3K/Akt)信號通路的影響。方法：體外培養(yǎng)人食管癌Ec109細胞，不同濃度姜黃素作用后，MTT法檢測其對Ec109細胞的增殖抑制作用，透射電鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)，Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率，Western blot法分析腫瘤抑制基因(PTEN)、蛋白激酶B(Akt)、糖原合成酶激酶-3(GSK3β)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase 3)蛋白的表達情況。結(jié)果：MTT檢測結(jié)果顯示姜黃素能顯著抑制Ec109細胞的增殖，且呈明顯的劑量和時間效應(yīng)關(guān)系；透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)姜黃素能誘導Ec109細胞發(fā)生凋亡；流式細胞儀分析顯示隨藥物濃度的增加，Ec109細胞凋亡率明顯升高；Western blot結(jié)果表明姜黃素可增強細胞中PTEN、GSK3β和Caspase 3的表達，抑制Akt的表達。結(jié)論：姜黃素通過上調(diào)PTEN、GSK3β和Caspase 3的表達，抑制PI3K/Akt信號通路，從而抑制食管癌Ec109細胞增殖。

姜黃素；PTEN/PI3K/AKT信號通路；食管癌

姜黃素是從植物姜黃根莖中提取的一種植物多酚，由于其抗炎、抗氧化、降血脂、抗動脈硬化及抗腫瘤等廣泛的藥理作用日益受到研究者的重視[1]。有資料顯示[2,3]姜黃素抗腫瘤的作用是通過誘導腫瘤細胞凋亡實現(xiàn)的，但其發(fā)揮生物學作用的精確靶點目前還不十分清楚。腫瘤發(fā)生過程中抑癌基因PTEN 的突變使其喪失了調(diào)節(jié)PI3K/Akt通路的能力，細胞增殖失去控制，從而引起癌變。目前在建立的小鼠模型中已經(jīng)觀察到該通路異常所導致的細胞轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)生[4]，但姜黃素誘導食管癌Ec109細

胞凋亡的過程中是否有該通路的參與還不明確。本研究旨在探討姜黃素是否通過作用PTEN/PI3K/Akt通路誘導食管癌Ec109細胞凋亡，進一步明確姜黃素誘導腫瘤細胞凋亡的作用途徑，為其早日應(yīng)用于腫瘤的臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

姜黃素購自美國Sigma公司，純度≥95%，溶解于二甲基亞楓(DMSO)中配成濃度為10 mmol/L的母液，-20℃避光保存。 MTT試劑盒、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司。PTEN、Akt、GSK3β、Caspase 3和β-actin單克隆抗體均購自Santa Cruz公司。

1.2 細胞株及細胞培養(yǎng)

人食管癌Ec109細胞由河北北方學院生命科學研究中心提供，細胞復蘇后置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO2及濕度飽和的條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)基每24小時更換一次，待融合率達到80%時，0.25%胰酶消化、傳代，選用狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.3 細胞增殖抑制實驗

Ec109細胞胰酶消化收集，顯微鏡下計數(shù)后將細胞濃度調(diào)整為5×104cells/ml，以每孔200 μl細胞懸液的量接種于96孔板，置于培養(yǎng)箱中24 h待其貼壁后，分別加入濃度為30、60、90 μmol/L姜黃素，每組設(shè)6個復孔，每孔終體積為200 μl，對照組加入等量培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48 h。分別加入MTT溶液20 μl/well，溫育4 h吸去上清，加入DMSO100 μl/well，置于培養(yǎng)箱中10 min使結(jié)晶充分溶解。用酶標儀測定各孔490 nm波長處吸光度(OD值)，計算細胞抑制率(%)=(OD處理組/OD-對照組)×100%，每組實驗重復3次，取平均值。

1.4 透射電鏡細胞樣品制備

制備濃度為1×105cells/ml細胞懸液，以每組兩瓶細胞的量接種于50 ml培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)箱中過夜后棄去各瓶培養(yǎng)基，處理組加入30、60、90 μmol/L姜黃素1.5 ml和培養(yǎng)基1.5 ml，使終體積為3 ml，對照組加入等量培養(yǎng)基，24 h胰酶消化收集各瓶細胞及上清于離心管中，1 500 r/min離心5 min，棄上清，PBS清洗3次，2.5%戊二醛4℃固定，PBS沖洗，置于1%鋨酸1.5 h，梯度丙酮脫水，環(huán)氧樹脂浸透、包埋，聚合72 h修塊、切片、醋酸雙氧鈾和檸檬鉛雙染。

1.5 Annexin V-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡

將濃度為5×104cells/ml細胞懸液以每組一瓶細胞接種于培養(yǎng)瓶中，過夜棄去培養(yǎng)基，處理組分別加入30、60、90 μmol/L姜黃素1.5 ml和培養(yǎng)基1.5 ml，對照組加入等量培養(yǎng)基，24 h消化收集各瓶細胞及上清于離心管中，1 500 r/min離心7 min，棄上清，PBS清洗2次，各管分別加入Binding Buffer 500 μl、 Annexin V5 μl、PI 5 μl，5～15 min內(nèi)上流式細胞儀(FACSAria，美國BD公司)檢測。

1.6 Western blot法檢測蛋白

按1.3項方法處理細胞，分別提取對照組和用藥組細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，變性后-20℃保存。配制分離膠和濃縮膠，灌膠、上樣，上樣量為50 μg，80 V電壓進行電泳，待蛋白樣品電泳至下層分離膠時將電壓調(diào)至120 V，直到溴酚藍到達分離膠底部，停止電泳。轉(zhuǎn)膜，麗春紅染色確定待測蛋白轉(zhuǎn)移情況，5%脫脂奶粉封閉后分別與PTEN、Akt、GSK3β、Caspase 3和β-actin蛋白一抗4℃孵育過夜，PBST漂洗PVDF膜后與二抗室溫孵育1 h，清洗、發(fā)光、顯影，分析結(jié)果，計算檢測蛋白和β-actin的光密度比值。

1.7 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對Ec109細胞增殖的抑制作用

30、60、90 μmol/L姜黃素處理Ec109細胞后，細胞增殖均受到不同程度的抑制，與對照組相比，姜黃素作用24 h后，可明顯抑制Ec109細胞的生長(P<0.05)，48 h后各藥物組的抑制作用更加顯著(P<0.01)，且不同劑量的抑制作用比較差異顯著(P<0.01)，即姜黃素對Ec109細胞的增殖抑制呈明顯的劑量和時間效應(yīng)關(guān)系(表1)。30、60、90 μmol/L姜黃素作用Ec109細胞24 h抑制率分別為(18.2±1.8)%、(34.4±3.9)%和(49.3±2.3)%，故選用姜黃素處理Ec109細胞24 h用于后續(xù)各項實驗。

Tab. 1 Cell inhibition rate treated with curcumin

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group；##P<0.01vs30 μmol/L group；△△P<0.01vs60 μmol/L group

2.2 細胞超微結(jié)構(gòu)觀察

對照組Ec109細胞狀態(tài)良好，細胞膜完整，細胞器明顯，可見雙層核膜結(jié)構(gòu)。姜黃素作用24 h后，各組細胞體積均縮小。30、60 μmol/L組出現(xiàn)線粒體嵴和膜融合，染色質(zhì)厚薄不均邊集于核膜下等凋亡特征。90 μmol/L組粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒，線粒體空泡化，染色質(zhì)核膜下聚集成半月形，凋亡特征明顯(圖1)。

2.3 姜黃素對Ec109細胞早期凋亡的影響

Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，姜黃素能明顯地促進Ec109細胞凋亡。30、60、90 μmol/L用藥組細胞早期凋亡發(fā)生率與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且各劑量組凋亡發(fā)生率比較差異顯著(P<0.01)，即隨著藥物濃度的增加，Ec109細胞的凋亡率逐漸升高(表2)。

Fig. 1 Ultrastructure of Ec109 cells were observed by TEM after treated with Curcumin(×8K) A： Control； B： Curcumin at 30 μmol/L； C： Curcumin at 60 μmol/L； D： Curcumin at 90 μmol/L

Tab. 2 Apoptosis rate of Ec109 cells by FCM

*P<0.05vscontrol group；##P<0.01vs30 μmol/L group；△△P<0.01vs60 μmol/L group

2.4 姜黃素對Ec109細胞PTEN、Akt、GSK3β和Caspase 3蛋白表達的影響

Group(μmol/L)PTEN Akt GSK3β Caspase3 Control1.17±0.041.37±0.081.04±0.061.15±0.04301.32±0.06*1.24±0.051.20±0.06*1.39±0.04**601.43±0.08**#0.75±0.04**#1.37±0.10**#1.48±0.08**#901.54±0.03**△0.59±0.07**△1.45±0.07**△1.63±0.10**△

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group；#P<0.05vs30 μmol/L group；△P<0.05vs60 μmol/L group

3 討論

目前植物提取成分已成為抗腫瘤藥物的重要來源，姜黃素便是從植物姜黃中提取的色素[5]，因其抗腫瘤作用日益受到研究者的重視，作用機制有：損傷細胞線粒體，使之釋放細胞色素C，活化Caspase 3誘導腫瘤細胞凋亡[6]；抑制腫瘤血管生長因子而抑制腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移[7]；阻遏細胞周期，誘導細胞分化[8]；調(diào)節(jié)多種細胞信號轉(zhuǎn)導途徑如Notch-1[9]、TGF-β[10]、NF-κB[11]等抑制腫瘤細胞增殖。但姜黃素是否通過作用PTEN/PI3K/Akt信號通路誘導腫瘤細胞凋亡目前并不十分清楚，因此本實驗觀察姜黃素對體外培養(yǎng)的人食管癌細胞Ec109增殖和PTEN/PI3K/Akt信號通路的影響。

Fig. 2 Effect of curcumin on protein expression of PTEN, Akt, GSK3β, Caspase 3 1： Control； 2： Curcumin 30 μmol/L； 3： Curcumin 60 μmol/L； 4： Curcumin 90 μmol/L

本研究結(jié)果顯示姜黃素能顯著抑制食管癌Ec109細胞的增殖，且呈明顯的劑量和時間效應(yīng)關(guān)系。透射電鏡形態(tài)學觀察顯示隨著姜黃素濃度的增加，Ec109細胞凋亡的特征越來越明顯。Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞儀檢測，結(jié)果表明30、60、90 μmol/L姜黃素作用后細胞凋亡發(fā)生率與對照組相比差異顯著，該結(jié)果進一步說明姜黃素確實能夠誘導Ec109細胞凋亡。

為明確姜黃素抑制Ec109細胞增殖，誘導其凋亡的作用途徑，本實驗采用Western blot法檢測了PTEN/PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白的表達情況。結(jié)果顯示姜黃素處理癌細胞后，PTEN 、GSK3β和Caspase 3蛋白的表達明顯增加，而Akt的表達明顯下降。出現(xiàn)這一結(jié)果的原因為姜黃素作用癌細胞后上調(diào)了抑癌基因PTEN的表達，繼而PTEN使PI3K的活化產(chǎn)物PIP3去磷酸化，降低了細胞內(nèi)PIP3的濃度，從而抑制了Akt的激活，使Akt的表達水平降低[12]。而Akt抑制后使其下游靶基因GSK3β激活[13]，進而調(diào)節(jié)下游凋亡相關(guān)蛋白Caspase 3[14]的表達，所以30、60、90 μmol/L姜黃素處理Ec109細胞后GSK3β、Caspase 3表達均顯著升高。綜上，本研究結(jié)果表明姜黃素通過抑制PTEN/PI3K/Akt信號通路而抑制食管癌細胞Ec109的增殖。

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The effects of curcumin on PTEN/PI3K/Akt pathway in Ec109 cells

LI Xiu-juan1， LUO Qiang2， SUN Li2， LIU Hua2， JIN Chun-ting1， FAN Jie1△， LI Yu-zhen1

(1. Department of Pathology， Hebei North University， 2. Life Sciences Research Center， Hebei North University， Zhangjiakou 075000, China)

Objective: To investigate the inhibition effect of curcumin on the proliferation of the human esophageal carcinoma cell line Ec109 and its impact on PTEN/PI3K/Akt signaling pathway. Methods: Esophageal carcinoma Ec109 cells were cultured in vitro conventionally and were treated with curcumin at different concentrations. The cell proliferation level was examined by MTT colorimetry, the ultrastructure of curcumin-treated Ec109 cells were detected with transmission electron microscope(TEM) and cell apoptosis was observed by FCM with AnnexinV-FITC/PI double staining. The protein levels of PTEN, Akt, GSK3β and Caspase 3 of curcumin-treated Ec109 cells were detected by Western blot. Results: MTT test showed that curcumin could inhibit the proliferation of Ec109 cells in a time and concentration-dependent manner. TEM examination indicated that curcumin could induce Ec109 cell apoptosis. FCM detection showed that Ec109 cell apoptotic rate increased significantly with the increase of drug concentration. On the other hand, curcumin could promote the expression of PTEN, GSK3β and Caspase 3 yet reduce the expression of Akt. Conclusion: Curcumin could obviously up-regulate the expression of PTEN,GSK3β and Caspase 3, surpress PI3K/Akt signaling pathway and hence inhibit the proliferation of Ec109 cells.

curcumin; PTEN/PI3K/Akt pathway; esophageal carcinoma

河北省醫(yī)學科學研究重點課題計劃(ZD20140083)

2015-01-29 【修回日期】2015-06-19

R735.1

A

1000-6834(2015)05-465-04

10.13459/j.cnki.cjap.2015.05.021

△【通訊作者】Tel： 18931335085； E-mail： fanjie9@sina.com