肺栓塞大鼠血管活性物質(zhì)改變及抗凝藥物對(duì)其影響*

張 瑩， 馮 偉， 燕存子， 西艾木西卡買爾·艾合買提， 林 勇， 劉 暉△

(1. 新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸二科， 新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室， 烏魯木齊 830054；2. 東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院呼吸科， 江蘇 南京 210009)

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肺栓塞大鼠血管活性物質(zhì)改變及抗凝藥物對(duì)其影響*

張 瑩1， 馮 偉1， 燕存子1， 西艾木西卡買爾·艾合買提1， 林 勇2， 劉 暉1△

(1. 新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸二科， 新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室， 烏魯木齊 830054；2. 東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院呼吸科， 江蘇 南京 210009)

目的：通過(guò)大鼠急性肺栓塞模型的制備，研究肺栓塞大鼠血管活性物質(zhì)改變及抗凝藥物對(duì)血管活性物質(zhì)的干預(yù)作用。方法：128只大鼠隨機(jī)分為4組(n=32): 對(duì)照組，栓塞未治療組，低分子肝素鈉+華法林組，利伐沙班組。采用自體血栓法復(fù)制急性肺栓塞模型并給予不同的抗凝藥物干預(yù)治療，于栓塞后不同時(shí)間檢測(cè)相應(yīng)生理生化指標(biāo)，并分別于栓塞后24 h，3 d，5 d，1周處死大鼠。比較不同組別大鼠肺栓塞病理改變。結(jié)果：栓塞組大鼠自血栓注入后迅速出現(xiàn)呼吸急促、口唇發(fā)紺、心率增快等體征。各組栓塞后均出現(xiàn)了肺動(dòng)脈高壓，BNP水平異常升高，內(nèi)皮素(ET-1)與一氧化氮(NO)、血栓素(TXB2)與前列環(huán)素(6-k-PGF1a)比例失衡，經(jīng)有效抗凝治療后BNP、ET-1與NO水平、TXB2與6-k-PGF1a水平逐漸趨于正常，接近對(duì)照組，肺動(dòng)脈高壓逐漸降低。利伐沙班治療肺栓塞效果與低分子肝素和華法林類似。結(jié)論：抗凝治療可有效改善肺栓塞后血管內(nèi)皮功能，減輕肺動(dòng)脈高壓，BNP水平逐漸恢復(fù)正常。利伐沙班在治療肺栓塞的有效性方面不劣于低分子肝素鈉和華法林。

肺栓塞；低分子肝素鈉；華法林；利伐沙班；大鼠

肺血栓栓塞(pulmonary thromboembolism，PTE) 是來(lái)自靜脈系統(tǒng)或右心房的血栓阻塞肺動(dòng)脈或其分支所致疾病，是常見(jiàn)的心血管急重癥之一。其病因復(fù)雜、發(fā)生率和病死率非常高，在歐美國(guó)家其死亡率在心腦血管疾病和惡性腫瘤之后，居第三位[1]。因此早期診斷，及時(shí)溶栓抗凝治療可有效解除肺動(dòng)脈栓塞，恢復(fù)栓塞血管再通，維持有效的肺循環(huán)血量，迅速降低右心前阻力，從而降低死亡率。

肺栓塞時(shí)肺血管內(nèi)皮功能會(huì)發(fā)生明顯變化，主要表現(xiàn)為其合成與釋放的重要血管活性物質(zhì)如內(nèi)皮素(ET)、血栓素(TXB2)、前列環(huán)素(6-k-PGF1a)、一氧化氮(NO)等發(fā)生改變而導(dǎo)致腦組織發(fā)生病理及功能改變[2]。低分子肝素鈉、華法林應(yīng)用于臨床多年效果比較確切，是肺栓塞抗凝治療的常用藥物。利伐沙班是一種新型口服抗凝藥物，與低分子肝素鈉和華法林抗凝效果、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估比較的報(bào)道較少[3]。本文通過(guò)制備大鼠急性肺栓塞動(dòng)物模型，了解肺血管活性物質(zhì)的變化并比較不同抗凝藥物對(duì)大鼠血管內(nèi)皮功能的影響，為急性肺栓塞的診斷、治療及預(yù)后提供思路和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康SD大鼠128只，體重200～250 g，雌性(購(gòu)于新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，每籠置5只大鼠，12 h∶12 h的明暗周期，自由采食及飲水，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程按照實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物護(hù)理和使用指南進(jìn)行，并遵循國(guó)家動(dòng)物研究中心的指導(dǎo)方針。大鼠隨機(jī)分為4組(n=32)：對(duì)照組、栓塞未治療組、低分子肝素鈉聯(lián)合華法林治療組、利伐沙班治療組 。各組又隨機(jī)分為治療后24 h、3 d，5 d，7 d 4個(gè)亞組(n=8)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型的制備 手術(shù)前1 d，在無(wú)菌條件下，腹腔注射10%的水合氯醛0.3 mg/kg麻醉大鼠,自大鼠內(nèi)眥靜脈采血0.5 ml，每毫升全血中加入2 U凝血酶，充分混勻，迅速推入細(xì)聚乙烯管室溫下靜置過(guò)夜，次日推入生理鹽水1 ml，制成直徑約為1～2 mm自體血栓，無(wú)菌手術(shù)刀切成3～4 mm長(zhǎng)，制成直徑1～2 mm，長(zhǎng)約3～4 mm的圓柱形的栓子備用，滅菌生理鹽水反復(fù)沖洗。大鼠稱重后行腹腔注射水合氯醛(0.3 ml/kg)麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，剃毛后，消毒頸部皮膚。沿頸靜脈走行剪開(kāi)頸部皮膚，暴露并分離左側(cè)頸外靜脈，為減輕動(dòng)物的內(nèi)源性纖維蛋白溶解活性，注射血塊前氨甲環(huán)酸注射液(60 mg/100 g)靜脈注射(氨甲環(huán)酸已被證明能增加大鼠栓塞材料的持久性[4])。抽取0．5 ml混懸液(約為15～20個(gè)血栓)，緩慢注入(時(shí)間約15 s)，然后推注少量生理鹽水沖洗套管針，以便保證血栓全部注入。觀察大鼠呼吸狀況，出現(xiàn)呼吸加快加深，確定造模成功。拔出套管針，結(jié)扎頸外靜脈近端，局部消毒后縫合皮下組織及皮膚，將大鼠放回飼養(yǎng)籠內(nèi)繼續(xù)飼養(yǎng)。對(duì)照組即假手術(shù)組，頸外靜脈注入約同等體積生理鹽水。全部操作應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行。手術(shù)力爭(zhēng)在30 min內(nèi)完成。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)各組處理方法 對(duì)照組(C組)及栓塞未治療組(U組)造模后立即每天一次皮下注射生理鹽水1 ml；低分子肝素鈉聯(lián)合華法林治療組(LMWH加WAR組)在栓塞后即刻給予1 ml生理鹽水稀釋的依諾肝素鈉(0.01 ml/kg)，頸背部皮下注射，每天1次，同時(shí)華法林(0.3 mg/kg)，1 ml生理鹽水稀釋后灌胃[5]，每天1次，連用 4 d以上者停用依諾肝素，維持華法林灌胃，根據(jù)大鼠用藥后的出血情況可適當(dāng)調(diào)整華法林計(jì)量；利伐沙班治療組在造模后即刻開(kāi)始利伐沙班(拜瑞妥 德國(guó) 拜耳醫(yī)藥保健有限公司)3 mg/kg，生理鹽水稀釋后1 ml每天一次灌胃治療[6]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，給藥組大鼠給藥時(shí)間分別為1、3、5、7 d。

1.2.3 氣管插管、開(kāi)胸測(cè)肺動(dòng)脈壓 按觀察時(shí)間點(diǎn)，大鼠用1%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)腹腔注射麻醉后固定于手術(shù)臺(tái)上，從甲狀軟骨處向下剪開(kāi)頸部正中皮膚約1.5 cm，鈍性分離皮下筋膜層和肌肉層，游離氣管，做倒“T”字形剪口，迅速以聚丙乙烯管插入氣管內(nèi)并接呼吸機(jī)輔助呼吸。沿胸部正中偏右0.5 cm處剪開(kāi)皮膚約2 cm，分離皮下筋膜層和肌肉層，剪斷肋骨，打開(kāi)胸腔，暴露肺動(dòng)脈，進(jìn)行肺動(dòng)脈插管并與BL-420F生物機(jī)能信息采集系統(tǒng)相連，測(cè)定并記錄平均肺動(dòng)脈壓力(mean pulmonary artery pressure,mPAP)。大鼠處死前左心室穿刺取血行內(nèi)皮素(endothelin,ET-1)、血栓素(thromboxane,TXB2)、前列環(huán)素(prostacyclin,6-k-PGF1a)、一氧化氮(nitrogen monoxide,NO)、血漿腦鈉肽(type B natriuretic peptide,BNP)等測(cè)定。

1.2.4 肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察 各實(shí)驗(yàn)組于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，取出肺組織用等滲鹽水沖洗，對(duì)比觀察不同實(shí)驗(yàn)組肺組織情況。用10%的甲醛固定，石蠟包埋，蘇木精—伊紅(HE)染色后用光鏡觀察肺組織基本病理改變。并記錄動(dòng)脈內(nèi)有無(wú)血栓栓塞，有為陽(yáng)性，否為陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺栓塞模型的成功率

本實(shí)驗(yàn)中，肺栓塞大鼠共96只，有12只大鼠栓塞后死亡，造模成功率為87.5%(12/96)。其中U組有4只大鼠死亡； LMWH+WAR組有5只大鼠死亡；利伐沙班組有3只大鼠死亡。大鼠自血栓注入后5 min左右均出現(xiàn)呼吸急促、口唇發(fā)紺、心動(dòng)過(guò)速等體征。栓塞后1 h左右上述癥狀逐漸緩解，活動(dòng)量稍有增加，飼養(yǎng)籠內(nèi)緩慢爬行。栓塞后24 h，大鼠逐漸適應(yīng)栓塞癥狀，活動(dòng)量較栓塞當(dāng)日明顯增加。栓塞后24 h組大鼠肺組織病理標(biāo)本肺動(dòng)脈內(nèi)均可見(jiàn)不同程度的栓塞，確定造模成功。實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)大鼠死亡大多發(fā)生在栓塞后3 h之內(nèi)，考慮為急性應(yīng)激心血管功能失代償及繼發(fā)性纖溶系統(tǒng)作用所致，其中肺組織病理標(biāo)本HE染色可見(jiàn)肺動(dòng)脈內(nèi)存在大小不等的栓子，周圍有大量炎癥細(xì)胞聚集，伴肺間質(zhì)水腫并可見(jiàn)大量紅細(xì)胞滲出。LMWH加WAR組有2只大鼠抗凝過(guò)程中出現(xiàn)皮下出血及手術(shù)切口出血而死亡。

2.2 各組平均肺動(dòng)脈壓的改變

與U組相比C組在造模后各時(shí)間點(diǎn)平均肺動(dòng)脈壓未見(jiàn)明顯改變。U組平均肺動(dòng)脈壓在栓塞后5 d內(nèi)均明顯增加(P<0.05)。栓塞后3 d，LWMH加WAR組與利伐沙班治療組平均肺動(dòng)脈明顯降低(P<0.05)?？紤]為抗凝藥物對(duì)自體血栓的溶解作用。栓塞后1周U組肺動(dòng)脈壓也明顯降低，與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮主要因?yàn)樽泽w血栓的溶解作用所致(表1)。

2.3 各組血漿腦鈉肽的改變

栓塞后5 d內(nèi)U組BNP水平較C組均明顯增加(P<0.05)。栓塞后24 h U組與LMWH加WAR組、利伐沙班組BNP值無(wú)顯著性差異?？紤]為急性肺栓塞的機(jī)械阻塞作用，加之神經(jīng)體液因素和低氧所引起的肺動(dòng)脈收縮，導(dǎo)致右心后負(fù)荷增加，右心室壁張力增高，從而引起B(yǎng)NP的分泌[7]。栓塞后3 d及栓塞后5 d LMWH加WAR組、利伐沙班組BNP值較U組明顯降低(P<0.05，表2)。

2.4 各組ET-1和NO的改變

U組栓塞后血漿ET-1明顯升高，NO水平與C組相比明顯降低(P<0.05)。經(jīng)抗凝藥物治療后ET-1明顯降低，NO明顯升高，栓塞后1周各組ET-1與NO均無(wú)顯著性差異。ET-1和NO的平衡是維持正常血管張力的重要因素，肺栓塞后血管內(nèi)皮功能障礙，ET-1代謝異常，引起NO合成和釋放減少，導(dǎo)致二者比例失衡，加重肺動(dòng)脈高壓，并形成惡性循環(huán)。抗凝治療后機(jī)械因素導(dǎo)致血流切應(yīng)力影響減弱或解除，促使ET-1和NO逐漸趨于正常(表3)。

2.5 各組TXB2和6-k-PGF1a的改變

TXB2和6-k-PGF1a為TXA2和PGI2的穩(wěn)定代謝產(chǎn)物，因此TXB2和6-k-PGF1a能間接反映血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能狀況。本實(shí)驗(yàn)中，與C組相比栓塞后24 h各組TXB2均明顯升高，6-k-PGF1a明顯降低(P<0.05)。經(jīng)抗凝藥物治療后TXB2明顯降低，6-k-PGF1a明顯升高。栓塞后5 d利伐沙班治療組較LMWH加WAR組TXB2恢復(fù)相對(duì)較快(P<0.05,表3)。經(jīng)各組肺栓塞后相應(yīng)觀察指標(biāo)的對(duì)比分析可見(jiàn)利伐沙班在治療肺栓塞的有效性上不劣于低分子肝素鈉和華法林。

2.6 各組肺栓塞后病理改變

造模后24 h除對(duì)照組外，各組肺組織病理解剖肺動(dòng)脈內(nèi)均可見(jiàn)血栓栓塞，肺栓塞局部可見(jiàn)肺組織肺泡萎陷，肺小動(dòng)脈擴(kuò)張充血，肺間質(zhì)水腫并可見(jiàn)大量紅細(xì)胞滲出。栓塞后3 d U組、LMWH加WAR組、利伐沙班組肺動(dòng)脈內(nèi)血栓較栓塞后24 h各組均有所減少，其中LMWH加WAR組、利伐沙班組較U組明顯。栓塞后1周各組病理圖片肺動(dòng)脈內(nèi)均未見(jiàn)明顯血栓。

Tab. 1 mPAP in four groups at different time points(mmHg, ±s)

mPAP: Mean pulmonary artery pressure; LMWH+WAR: Low-molecular-weight heparin and warfarin group

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsuntreated group

Tab. 2 BNP in four groups at different time points(pg/ml, ±s)

BNP: Type B natriuretic peptide; LMWH+WAR: Low-molecular-weight heparin and warfarin group

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsuntreated group

Tab. 3 Serum biomarkers in four groups at different time ±s)

LMWH+WAR: Low-molecular-weight heparin and warfarin group; ET-1: Endothelin-1; NO: Nitrogen monoxide; TXB2: Thromboxane; 6-k-PGF1α: Prostacyclin

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsuntreated group

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采取自體血栓法復(fù)制大鼠急性肺栓塞動(dòng)脈模型，實(shí)驗(yàn)大鼠均為雌性，主要考慮藥物代謝的性別差異。有研究提出[8]藥物在雌性大鼠體內(nèi)的代謝明顯地較雄性大鼠體內(nèi)慢，所以雌性大鼠體內(nèi)的血藥濃度高而持久，藥效更好。造模后各組平均肺動(dòng)脈壓均顯著升高，自體血栓隨血循環(huán)進(jìn)入肺組織，破壞肺血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，并引起不可逆損傷。研究顯示，在肺栓塞時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞功能受損，肺動(dòng)脈血管內(nèi)皮合成多種生物活性物質(zhì)，分泌的血管舒張因子和收縮因子失調(diào)，引起血管重塑，在肺動(dòng)脈高壓發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[9,10]。

Battistini[11]假定ET-1是肺栓塞的始動(dòng)因素，并認(rèn)為內(nèi)皮素受體拮抗劑可能會(huì)成為未來(lái)肺栓塞患者的治療用藥。這反映ET-1在急性肺栓塞中是一個(gè)至關(guān)重要的血管活性物質(zhì)。ET-1和NO是一對(duì)相互拮抗的血管活性物質(zhì)，它們被認(rèn)為是肺動(dòng)脈高壓中最重要的調(diào)節(jié)因子。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示肺栓塞后出現(xiàn)肺動(dòng)脈壓及ET-1值升高，NO值降低，有效抗凝治療后ET-1與NO值逐漸趨于對(duì)照組，肺動(dòng)脈壓逐漸降至正常。因此，降低體內(nèi)的ET-1水平，升高NO水平對(duì)防治肺動(dòng)脈高壓有著十分重要的意義。

TXA2和PGI2是另一對(duì)重要的作用截然相反的血管活性物質(zhì)。TXB2和6-k-PGF1a為TXA2和PGI2的穩(wěn)定代謝產(chǎn)物，因此TXB2和6-k-PGF1a能間接反映血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能狀況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示肺栓塞后血漿TXB2水平升高，6-k-PGF1a水平降低，抗凝藥物的治療有效的逆轉(zhuǎn)了肺栓塞后血漿TXB2和6-k-PGF1a的變化，降低了血管張力，一定程度上保護(hù)了血管內(nèi)皮功能，減輕了肺栓塞所致的肺動(dòng)脈高壓。

有文獻(xiàn)指出[12]BNP雖然不能單獨(dú)用于急性肺栓塞的確診與排除，但是對(duì)于診斷明確者BNP濃度變化對(duì)于評(píng)估肺栓塞病情的嚴(yán)重性及危險(xiǎn)分層有幫助，而且對(duì)臨床療效及預(yù)后評(píng)估有一定價(jià)值。本文觀察了大鼠肺栓塞后血漿BNP水平變化發(fā)現(xiàn)肺栓塞后BNP濃度有不同程度的升高，考慮可能原因?yàn)樗ㄗ拥臋C(jī)械阻塞作用，加之神經(jīng)體液因素和低氧所引起的肺動(dòng)脈收縮，右心后負(fù)荷增加，右心室壁張力增高，肺功能降低，對(duì)BNP的清除能力下降，導(dǎo)致BNP濃度升高?？鼓委熀驜NP水平逐漸下降，考慮與血栓的溶解，心肺功能的改善，BNP的生成相對(duì)減少，BNP的清除能力下降相關(guān)。

利伐沙班是第一個(gè)在美國(guó)獲得批準(zhǔn)的用于治療深靜脈血栓和肺栓塞的新型口服抗凝藥[13,14]。經(jīng)抗凝治療后各組各時(shí)間點(diǎn)肺動(dòng)脈壓、BNP、ET-1、NO、TXB2、6-k-PGF1a的比較顯示，利伐沙班在治療肺栓塞疾病中的有效性不劣于低分子肝素鈉、華法林。目前新型抗凝藥物仍處于進(jìn)一步的研究發(fā)展階段，現(xiàn)已展示了良好的發(fā)展前途，相信隨著實(shí)驗(yàn)及臨床研究的不斷深入，新型口服抗凝藥物將成為肺栓塞性疾病抗凝治療的新途徑。

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The changes of vascular active substances in pulmonary embolism rats and a comparative study of anticoagulant drugs

ZHANG Ying1, FENG Wei1, YAN Cun-zi1, XI Ai-mu-xi-ka-mai-er·Ai-he-mai-ti1, LIN Yong2, LIU Hui1△

(1. Department of Respiratory Medicine, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, the Animal Laboratory of Xinjiang Medical University,Wulumuqi 830054; 2. Department of Respiration, Zhongda Hospital, Southeast University, Nanjing 210009, China)

Objective: To establish the rat model of acute pulmonary embolism, and study the changes of vascular active substances in pulmonary embolism rats, and investigate the interventive effect of anticoagulant drugs on vascular active substances. Methods: One hundred and twenty-eight rats were randomly divided into four groups: control group, model group, low-molecular-weight heparin and warfarin treated group and rivaroxaban-treated group (n=32 in each group). The method of autologous thrombosis was used to establish the animal model of acute pulmonary embolism. The animals were treated with saline or different anticoagulant drugs. The physiological and biochemical parameters were detected at different time points after embolization. The rats were killed after embolism of 24 h, 3 d, 5 d or 1 week respectively and the pathologic samples of lung tissues were collected to analyze the pulmonary pathological changes in different groups. Results: Rats in embolization group after blood clots injection showed shortness of breath, oral cyanosis; quicken heart rates and other symptoms. All embolization groups had pulmonary hypertension, the levels of type B natriuretic peptide(BNP) were increased significantly. The ratio of endothelin-1(ET-1)/NO and thromboxane (TXB2) and prostacyclin (6-k-PGF1a) were abnormal. After treated with effective anticoagulant drugs, the levels of BNP, ET-1, NO, TXB2and 6-k-PGF1a were tended to the normal levels in the control group. The pulmonary hypertensions were gradually decreased. The efficacy of rivaroxaban on pulmonary embolism was the same as that of the low molecular weight heparin or warfarin. Conclusion: Anticoagulation therapy can effectively improve endothelial function after pulmonary embolism, reduce pulmonary hypertension, and revise the increased BNP levels to normal levels. The efficacy of rivaroxaban is not inferior to that of low molecular weight heparin and warfarin.

pulmonary embolism; low molecular weight heparin; warfarin; rivaroxaban; rats

新疆醫(yī)學(xué)動(dòng)物模型研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(XJDX1103-2013-01)

2014-12-08 【修回日期】2015-02-13

R563.5

A

1000-6834(2015)02-178-005

10.13459/j.cnki.cjap.2015.02.022

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