既濟湯對腦缺血/再灌注誘導(dǎo)的血管性癡呆小鼠認知功能和腦內(nèi)氧化應(yīng)激的影響*

劉豐熙， 牛 凱， 吳志剛， 薛貴平， 楊建明， 張丹參△

(1. 河北北方學院藥學系， 張家口 075000； 2. 圣大(張家口)藥業(yè)有限公司， 河北 張家口 075000)

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既濟湯對腦缺血/再灌注誘導(dǎo)的血管性癡呆小鼠認知功能和腦內(nèi)氧化應(yīng)激的影響*

劉豐熙1， 牛 凱2， 吳志剛1， 薛貴平1， 楊建明1， 張丹參1△

(1. 河北北方學院藥學系， 張家口 075000； 2. 圣大(張家口)藥業(yè)有限公司， 河北 張家口 075000)

目的：本研究旨在探討既濟湯對腦缺血/再灌注誘導(dǎo)的血管性癡呆(VD)小鼠認知功能和腦內(nèi)氧化應(yīng)激水平的影響。方法：將32只小鼠隨機分為4組(n=8):正常組、假手術(shù)組(手術(shù)但不執(zhí)行腦缺血/再灌注)、模型組(復(fù)制腦缺血/再灌注誘導(dǎo)的VD模型)、既濟湯治療組(復(fù)制腦缺血/再灌注誘導(dǎo)的VD模型后既濟湯治療)。術(shù)后給予既濟湯20 ml/kg，每天1次，連續(xù)給藥14 d，通過避暗實驗、探索實驗和跳臺實驗檢測所有小鼠的行為學表現(xiàn)。最后取腦，檢測腦組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量，評價腦內(nèi)的氧化應(yīng)激水平的變化情況。結(jié)果：避暗實驗結(jié)果顯示，既濟湯治療組較模型組動物逃避潛伏期顯著延長(P<0.01)，錯誤次數(shù)顯著下降(P<0.01)；探索實驗結(jié)果顯示，既濟湯治療組較模型組顯著縮短小鼠到達暗室時間(P<0.05)、到達高端時間(P<0.01)、到達后面明室時間(P<0.01)，并且顯著增加爬高端的次數(shù)(P<0.01)；跳臺實驗表明，既濟湯治療組較模型組能夠顯著延長小鼠的逃避潛伏期(P<0.01)。與正常組、假手術(shù)組比較，模型組小鼠腦組織勻漿中SOD活性顯著降低(P<0.01，P<0.01)、MDA含量顯著升高(P<0.01，P<0.01)；與模型組比較，既濟湯治療組小鼠腦組織SOD活性和MDA含量明顯回落(P<0.01，P<0.01)。結(jié)論：既濟湯可顯著改善VD小鼠的認知功能，其機制可能與其抑制腦內(nèi)的氧化應(yīng)激有關(guān)。

既濟湯; 血管性癡呆; 認知功能; 氧化應(yīng)激; 小鼠

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是全球范圍內(nèi)僅次于阿爾茨海默病的第二位癡呆性疾病[1]。隨著人口老齡化的來臨，我國VD的發(fā)病逐年增加，并有加速的趨勢[2]。VD不但嚴重影響患者的生活質(zhì)量，而且為家庭和社會增添了沉重經(jīng)濟和情感負擔。目前，雖然已有大量學者專注于VD的基礎(chǔ)和臨床研究，但臨床上仍沒有特異性的治療方案，主要從平衡神經(jīng)遞質(zhì)、改善腦循環(huán)以及保護腦細胞著手，治療效果不理想。

傳統(tǒng)醫(yī)學認為，VD屬于中醫(yī)的 “癡呆”、“呆癥”、“健忘”等疾病范疇，病在腦，與心和腎的關(guān)系密切[3]。以往的治療多采用補益心血、補腎益氣、活血化淤、祛痰開竅等治療方法，從單一臟腑的角度治療VD。作者立足中醫(yī)的整體觀念，從臟腑間的相互聯(lián)系出發(fā)，認為心腎不交可能是VD發(fā)生的重要原因。因此，本文從交通心腎入手，以小鼠為對象，線栓法建立腦缺血/再灌注損傷VD模型，通過行為學實驗，觀察自擬方既濟湯(在具有鎮(zhèn)靜安神、交通心腎的功效的交泰丸的基礎(chǔ)上加減而成)對VD的干預(yù)效果，并從氧化應(yīng)激的角度探討可能的機制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

SBA-2程控避暗箱、XTY-2探索運動試驗儀和STT-2跳臺儀，均購自中國醫(yī)學科學院藥物研究所。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。既濟湯組方原則是交通心腎、理氣開竅。所含中藥：遠志、黃連、肉桂、益智仁、枸杞子、菟絲子、熟地、石菖蒲、炒棗仁、陳皮、澤瀉、白芍、阿膠和黃芩，均購自張家口市華佗藥房，嚴格按臨床用藥煎煮方法熬制成常規(guī)藥液。1 ml藥液含生藥1克。

1.2 動物與分組

健康昆明種雄性小鼠32只，體重(28±2)g，隨機分為4組(n=8)：分別為正常組、假手術(shù)組(進行手術(shù)，但不進行腦缺血/再灌注)、模型組(復(fù)制腦缺血/再灌注誘導(dǎo)的VD模型)、既濟湯組(復(fù)制腦缺血/再灌注誘導(dǎo)的VD模型后，既濟湯治療)。

1.3 模型制備與給藥方法

動物麻醉(3.5%水合氯醛10 ml/kg，腹腔注射)后，分離兩側(cè)頸總動脈，分離后用液體石蠟浸泡過的黑色手術(shù)線穿過左右兩側(cè)頸總動脈，盡量恢復(fù)兩側(cè)頸總動脈到原位，在氣管上方輕輕將黑色手術(shù)線打一松的反手結(jié)，結(jié)的松緊以不壓迫氣管為宜。在每側(cè)頸總動脈上方的黑線上穿過一條用液體石蠟浸泡過的白色手術(shù)線，按Himori法埋線后縫合切口[4]。術(shù)后48 h將頸下黑色手術(shù)線拉緊，阻斷兩側(cè)頸總動脈造成大腦缺血狀態(tài)， 5 min后輕拉兩側(cè)白色手術(shù)線，使頸總動脈恢復(fù)血液再灌注。

既濟湯治療組動物每日早7:00灌胃給既濟湯，20 ml/kg，每天1次，連續(xù)給藥14 d；正常組、假手術(shù)組和模型組動物每日早7:00給等量蒸餾水，每天1次，也連續(xù)給14 d。

1.4 行為學實驗

1.4.1 避暗實驗 避暗箱有明暗兩間隔室，兩室間有一個直徑為3 cm圓形通道，兩室底部均為不銹鋼柵欄。明室柵欄始終不通電，暗室柵欄通電(40 V)。小鼠受到電擊后立即逃避到明室，PcLab生物信號采集系統(tǒng)完成數(shù)據(jù)收集。第14天給藥后1 h進行避暗實驗，實驗分為訓練和測試，訓練前將小鼠放入避暗箱內(nèi)適應(yīng)3 min，然后將小鼠背向洞口放入明室，由于小鼠具有嗜暗習性，易進入暗室，進入暗室后由于受到電擊迅速逃離。在5 min內(nèi)經(jīng)多次電擊，小鼠形成記憶，記錄24 h后3 min內(nèi)小鼠受到電擊的次數(shù)(錯誤次數(shù))以及首次犯錯誤的時間(逃避潛伏期)。

1.4.2 探索實驗 探索運動實驗儀，由一個暗室和兩個明室組成，可記錄動物的活動行為信號。第14天給藥后1 h進行探索實驗，首先將小鼠放在前面明室中，同時打開箱門，當小鼠鉆進暗室時，則關(guān)上門斷其后路。記錄小鼠到達暗室時間、到達高端時間、到達明室時間(指后面的明室)和小鼠爬高端的次數(shù)。

1.4.3 跳臺實驗 跳臺實驗測試儀由5個隔室構(gòu)成，可同時測試5只動物，每個隔室有一橡皮臺，箱底是可通電的銅柵，訓練期，小鼠跳下平臺在通電后的箱底不斷被電擊，這個過程中獲得記憶；24 h后觀察小鼠第一次跳下平臺的時間和3 min內(nèi)跳下平臺的次數(shù)。第14天給藥后1 h進行實驗，先將小鼠放入反應(yīng)箱內(nèi)適應(yīng) 3 min，然后立即通36 V交流電，動物受到電擊跳上平臺，訓練 3 min。24 h后，將小鼠輕輕置于平臺上，記錄從小鼠被放至平臺到第一次跳下的時間，即跳臺潛伏期；同時記錄 3 min內(nèi)小鼠跳下平臺的次數(shù)，即錯誤次數(shù)。

1.5 小鼠腦組織SOD和MDA含量測定

行為學實驗檢測結(jié)束后，小鼠迅速斷頭處死，冰臺上取腦，冷生理鹽水沖洗后，用濾紙吸干表面的水分，稱重，制備10%腦組織勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液備用。黃嘌呤氧化酶法檢測腦組織中SOD活性，硫代巴比妥酸法檢測MDA含量。腦組織勻漿用BCA法蛋白定量。SOD活性和MDA含量以腦組織中總蛋白校準[5]。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 行為學實驗結(jié)果

避暗實驗結(jié)果顯示：與正常組和假手術(shù)組比較，模型組動物錯誤次數(shù)顯著增加(P<0.01)；既濟湯治療組較模型組動物逃避潛伏期顯著延長(P<0.01)，錯誤次數(shù)顯著下降(P<0.01)；而且既濟湯治療組動物逃避潛伏期顯著高于正常組和假手術(shù)組(P<0.01，P<0.01)，錯誤次數(shù)顯著少于正常組(P<0.05，表1)。探索實驗結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組動物到達暗室時間(P<0.05)、到達高端時間(P<0.01)和到達后面明室時間(P<0.01)都顯著延長；與假手術(shù)組比較，模型組動物到達暗室時間(P<0.05)和到達后面明室時間(P<0.01)顯著延長；與模型組比較，既濟湯治療組動物到達暗室時間(P<0.05)、到達高端時間(P<0.01)和到達后面明室時間(P<0.01)都顯著縮短，爬高次數(shù)顯著增加(P<0.01)；而且既濟湯治療組動物爬高次數(shù)也顯著高于正常組和假手術(shù)組(P<0.01，P<0.01)；但既濟湯治療組動物到達后面明室時間仍顯著高于正常組和假手術(shù)組(P<0.05，P<0.05，表2)。跳臺實驗結(jié)果顯示：既濟湯治療組動物的逃避潛伏期較模型組、正常組和假手術(shù)組都顯著增加(P<0.01，P<0.01，P<0.01)；模型組動物錯誤次數(shù)較正常組和假手術(shù)組顯著增多(P<0.05，P<0.05)，既濟湯治療組動物的錯誤次數(shù)較模型組有所減少，但無統(tǒng)計學差異(P>0.05，表3)。

GroupEscapinglatency(s)Errorcountsin3minsNormal7.75±3.6943.13±19.73Sham8.63±3.4639.00±13.47Model7.13±4.0263.38±13.28**##JiJidecoction-treated19.13±10.66**##△△25.63±8.19*△△

*P<0.05,**P<0.01vsnormal group;##P<0.01vssham group;△△P<0.01vsmodel group

Tab. 2 Effects of Jiji decoction on data of spatial probe test in mice with vascular dementia

*P<0.05,**P<0.01vsnormal group;#P<0.05,##P<0.01vssham group;△P<0.05,△△P<0.01vsmodel group

GroupEscapinglatency(s)Errorcountsin3minsNormal8.86±3.645.25±2.19Sham9.25±3.654.88±1.89Model4.88±2.108.63±3.46*#JiJidecoction-treated15.75±6.67**##△△6.13±3.27

*P<0.05,**P<0.01vsnormal group;#P<0.05,##P<0.01vssham group;△△P<0.01vsmodel group

2.2 腦組織中SOD活性和MDA含量的測定

與正常組和假手術(shù)組比較，模型組小鼠腦組織勻漿中SOD活性顯著降低(P<0.01，P<0.01)、MDA含量顯著升高(P<0.01，P<0.01)；與模型組比較，既濟湯治療組小鼠腦組織中SOD活性和MDA含量明顯回落(P<0.01，P<0.01，表4)。

3 討論

VD是目前唯一一種可以預(yù)防和治療的癡呆類型。傳統(tǒng)醫(yī)學近年的理論研究提示，“心腎不交”在VD的發(fā)病中起著重要作用[6，7]。交泰丸是“交通心腎”的經(jīng)典方劑[8]。因此，本研究在交泰丸的基礎(chǔ)上加減組成既濟湯，改良后的方劑消炎抗菌成分降低，鎮(zhèn)靜催眠成分顯著提高，進而觀察其對認知行為的影響。腦缺血/再灌注損傷是目前通用的復(fù)制大鼠、小鼠VD模型的方法[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血/再灌注損傷小鼠出現(xiàn)顯著地認知功能障礙，表現(xiàn)為：小鼠在避暗實驗或跳臺實驗中錯誤潛伏期縮短、錯誤次數(shù)增加；探索實驗中小鼠到達暗室、高端和明室的時間顯著延長。當給予既濟湯連續(xù)14 d的治療后，VD小鼠的認知功能障礙明顯改善。實驗還發(fā)現(xiàn)，既濟湯治療組動物在避暗實驗中的逃避潛伏期、錯誤次數(shù)，探索實驗中的爬高次數(shù)的表現(xiàn)都顯著優(yōu)于正常組。這些結(jié)果提示，既濟湯對正常動物的學習記憶功能也有顯著地提高作用。因此，這些實驗表明既濟湯以“交通心腎”為靶點能夠顯著改善VD的癡呆癥狀。

GroupSOD(U/mgprot)MDA(nmol/mgprot)Normal3.80±0.3112.23±3.47Sham3.90±0.3111.03±3.64Model0.60±0.41**##28.66±6.89**##JiJidecoction-treated4.18±1.37△△15.33±7.27△△

**P<0.01vsnormal group;##P<0.01vssham group;

△△P<0.01vsmodel group

目前已有的報道表明，“交通心腎”對失眠、腸道預(yù)激綜合征、慢性腎功能不全、心腎綜合征等具有顯著地治療效果，但其現(xiàn)代醫(yī)學的理論基礎(chǔ)仍然不清楚，也未見報道。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)活性氧產(chǎn)物(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生超過內(nèi)源性的抗氧化防御機制的清除能力，進而引起的氧化應(yīng)激，是VD發(fā)病的重要機制[10-12]。本研究所使用的方劑既濟湯中黃連[13]具有抗腦損傷的功效，益智仁[14]可以益智健腦，遠志[15]具有抗癡呆和腦保護作用；黃連[16]、益智仁[17]、枸杞子[18]、菟絲子[19]、熟地[20]、遠志[21]、黃芩[22]具有較強的抗氧化活性。那么既濟湯對VD的保護效應(yīng)是否與其緩解腦內(nèi)的氧化應(yīng)激有關(guān)？因此實驗中進一步檢測了腦組織勻漿中SOD活性和MDA含量。結(jié)果顯示，VD模型組動物腦組織勻漿中，SOD活性顯著降低，MDA含量顯著升高；既濟湯治療組小鼠腦組織中SOD活性增加，MDA含量下降。這些數(shù)據(jù)表明，既濟湯對VD小鼠認知行為的保護作用可能與其降低腦內(nèi)的氧化應(yīng)激水平有關(guān)。因此從現(xiàn)代醫(yī)學的觀點看，既濟湯“交通心腎”作用，可能與其對機體各個臟器氧化還原狀態(tài)的調(diào)整有關(guān)，但這一觀點需要進一步的證據(jù)支持。中藥湯劑大多是混合性中藥成分，其作用靶點和機制遠比單一化學藥物復(fù)雜，既濟湯抑制VD小鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激效應(yīng)，是通過減少ROS產(chǎn)生還是阻斷了其后的氧化還原信號轉(zhuǎn)導(dǎo)實現(xiàn)的，尚需進一步探討。

總之，本研究表明既濟湯可顯著改善VD小鼠的認知功能，其機制可能與其抑制腦內(nèi)的氧化應(yīng)激有關(guān)。今后，既濟湯有效成分、作用靶點和發(fā)生機制的進一步闡明，將為相關(guān)疾病的防治提供新思路。

[1] Sudduth TL, Powell DK, Smith CD,etal. Induction of hyperhomocysteinemia models vascular dementia by induction of cerebral microhemorrhages and neuroinflammation[J].JCerebBloodFlowMetab, 2013, 33(5): 708-715.

[2] 曲艷吉, 卓 琳, 王華麗, 等. 1980-2011 年中國社區(qū) 55 歲及以上人群中血管性癡呆流行病學的 Meta 分析[J]. 中國卒中雜志, 2013, 8(7): 533-543.

[3] 韓 飛, 荊志偉, 于亞南, 等. 中藥有效成分治療血管性癡呆的研究進展[J]. 中國實驗方劑學雜志, 2012, 18(7): 273-276.

[4] Himori N, Watanabe H, Akaike N,etal. Cerebral ischemia model with conscious mice: involvement of NMDA receptor activation and derangement of learning and memory ability[J].JPharmacolMethods, 1990, 23(4): 311-327.

[5] 李 潔, 余小燕. 肉堿對大鼠力竭運動后心肌線粒體呼吸鏈功能及抗氧化能力的影響[J]. 中國應(yīng)用生理學雜志, 2012, 28(5): 405-409.

[6] 馬 琳. 論老年性癡呆與心腎不交[J]. 世界中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2010, 5(9): 739-740.

[7] 郭閆葵, 浦家祚, 趙世珂, 等. 腎虛與血管性癡呆的相關(guān)研究[J]. 中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志, 2010, 8(8): 985-987.

[8] 全世建, 何樹茂, 錢莉莉. 交泰丸交通心腎治療失眠作用機理研究[J]. 遼寧中醫(yī)藥大學學報, 2011, 13(8): 12-14.

[9] 車玉琴, 任玉峰, 高 杰. IGF-Ⅱ?qū)Υ笫竽X缺血/再灌注損傷后海馬TNF-α含量的影響[J]. 中國應(yīng)用生理學雜志, 2009, 25(2): 249-250,276.

[10]馬婧怡, 張萬鑫, 陳 虹, 等. 松果菊苷對血管性癡呆大鼠氧化應(yīng)激損傷的保護作用[J]. 中國藥理學通報, 2014, 30(5): 638-642.

[11]Aliev G, HoreckJ, Vanová O,etal. The three-vessel occlusion as a model of vascular dementia-oxidative stress and mitochondrial failure as an indicator of brain hypoperfusion[J].SystBiolFreeRadicAntioxid, 2014: 2023-2032.

[12]Kim HA, Miller AA, Drummond GR,etal. Vascular cognitive impairment and Alzheimer’s disease: role of cerebral hypoperfusion and oxidative stress[J].NaunynSchmiedebergsArchPharmacol, 2012, 385(10): 953-959.

[13]亓 丹. 黃連的藥理作用及臨床使用研究[J]. 中華醫(yī)藥雜志, 2004, 4(9): 186-188.

[14]崔開宇, 王 平, 游秋云. 益智仁揮發(fā)油對大鼠快動眼睡眠剝奪恢復(fù)后腦組織氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量及其受體表達的影響[J]. 中國實驗方劑學雜志, 2013, 19(4): 223-227.

[15]劉大偉, 康利平, 馬百平. 遠志化學及藥理作用研究進展[J]. 國際藥學研究雜志, 2012, 39(1): 32-36.

[16]宋 玨, 路 通, 謝 林, 等. 黃連解毒湯抗氧化作用的血清藥理學研究[J]. 中國實驗方劑學雜志, 2010, 16 (4): 118-122.

[17]石紹淮, 劉 冰, 李 歡, 等. 超高效液相色譜法同時測定益智中 4 種抗氧化活性成分[J]. 中國藥學雜志, 2014, 49(7): 592-595.

[18]馮美玲, 王書芳, 張興賢. 枸杞子的化學成分研究[J]. 中草藥, 2013, 44(3): 265-268.

[19]劉海云, 吳歡歡, 何志堅. 菟絲子提取物對亞急性衰老小鼠的抗衰老作用研究[J]. 江西中醫(yī)學院學報, 2013 (6): 72-74.

[20]安紅梅, 史云峰, 胡 兵, 等. 熟地黃對 D-半乳糖衰老模型大鼠腦衰老的作用研究[J]. 中藥藥理與臨床, 2008, 24(3): 59-60.

[21]Shi T, Li Y, Jiang Y,etal. Isolation of flavonoids from the aerial parts of Polygala tenuifolia Willd. and their antioxidant activities [J].JChinPharmSci, 2013, 22(1): 36-39.

[22]辛文妤, 宋俊科, 何國榮, 等. 黃芩素和黃芩苷的藥理作用及機制研究進展[J]. 中國新藥雜志, 2013, 22(6): 647-653.

Effects of Jiji decoction on the cognitive function and oxidative stress in mice with vascular dementia induced by cerebral ischemia/reperfusion

LIU Feng-xi1, NIU Kai2, WU Zhi-gang1, XUE Gui-ping1, YANG Jian-ming1, ZHANG Dan-shen1△

(1. Department of Pharmacy, Hebei North University, Zhangjiakou 075000; 2. Santa (Zhangjiakou) Pharmaceutical Co., LTD, Zhangjiakou 075000,China)

Objective: To determine the effects of Jiji decoction (Traditional Chinese Medicine) on the cognitive function and oxidative stress in mice with vascular dementia (VD) induced by cerebral ischemia/reperfusion. Methods: Thirty-two mice were randomly divided into normal group (n=8), sham group (operation, but no cerebral ischemia/reperfusion,n=8), model group (vascular dementia model induced by cerebral ischemia/reperfusion,n=8), and Jiji decoction- treated group (vascular dementia model plus treatment with Jiji decoction,n=8). Fourteen days of treatment after operation, the cognitive behavior was measured in step-through test, spatial probe test and platform test. Afterwards, to assess the levels of oxidative stress, the activity of superoxide dismutase(SOD) and content of malonaldehyde (MDA) in brain of these mice were measured. Results: Data from step-through test indicated that the escaping latency of Jiji decoction- treated group was prolonged and the error counts were decreased significantly (P<0.01) compared with those of model group. Data from spatial probe test indicated that the time of entering darkroom, the time of climbing height and the time of entering bright room in Jiji decoction-treated group were shortened and the counts of climbing height were increased (P<0.05～0.01) significantly compared with those of model group. Data from platform test showed that the escaping latency of Jiji decoction- treated group was prolonged significantly (P<0.01) compared with that of model group. Compared with normal and sham group, the activity of SOD was decreased and the content of MDA was increased in model group significantly (P<0.01). Compared with those of model group, the levels of SOD and MDA in Jiji decoction- treated group were improved significantly (P<0.01). Conclusion: Jiji decoction could improve cognitive function of VD mice. Its mechanism might be related with the inhibition of oxidative stress in the brain.

Jiji decoction; vascular dementia; cognitive function; oxidative stress

河北省教育廳科學研究項目(Z2011311)；張家口市科技局研究項目(1101090D)；河北北方學院校級青年基金項目(Q201131)

2014-09-24 【修回日期】2015-02-05

R364.1；R28

A

1000-6834(2015)02-170-005

10.13459/j.cnki.cjap.2015.02.020

△【通訊作者】Tel: 18931316068； E-mail: zhangjk1979@163.com