雙酚A對納米二氧化鈦理化特性及其DNA損傷效應(yīng)的影響

劉燕婕，張艷紅，呂斌,*

1. 長江航運總醫(yī)院/武漢腦科醫(yī)院檢驗科，武漢430015 2. 華中科技大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，武漢 430030

雙酚A對納米二氧化鈦理化特性及其DNA損傷效應(yīng)的影響

劉燕婕1,2，張艷紅2，呂斌2,*

1. 長江航運總醫(yī)院/武漢腦科醫(yī)院檢驗科，武漢430015 2. 華中科技大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，武漢 430030

納米二氧化鈦(nano-TiO2)應(yīng)用領(lǐng)域廣泛，由于其對有機(jī)物或生物分子有吸附作用，二者相互反應(yīng)，對各種細(xì)胞可能產(chǎn)生與nano-TiO2單獨作用時不同的毒性作用。為探討雙酚A(BPA)對nano-TiO2理化性質(zhì)的影響，以及BPA和nano-TiO2聯(lián)合暴露對人胚肝L-02細(xì)胞的DNA損傷效應(yīng)。用不同緩沖液，測定不同濃度的BPA(0、0.1、1、10 mol·L-1)對不同濃度nano-TiO2(0、0.1、1、10 mg·L-1)的粒徑、表面電位和吸附能力的影響；然后測定不同濃度BPA和nano-TiO2聯(lián)合暴露對人胚肝L-02細(xì)胞DNA雙鏈斷裂、DNA損傷關(guān)鍵修復(fù)酶hMsh2基因(hMsh2)、O6-甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)和DNA依賴蛋白激酶復(fù)合物催化亞基(DNA-PKcs)的mRNA表達(dá)水平表達(dá)的影響。結(jié)果表明在不同緩沖液中，隨著BPA濃度的增加，nano-TiO2粒徑增加，表面電位上升，在細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM中這一變化趨勢最為明顯；但在不同緩沖液中nano-TiO2對BPA的吸附能力無明顯差異。單獨nano-TiO2暴露不引起DNA雙鏈斷裂，對DNA損傷修復(fù)關(guān)鍵酶的表達(dá)也無明顯影響，但nano-TiO2可加重BPA的DNA雙鏈斷裂效應(yīng)。與相應(yīng)劑量的BPA單獨染毒組比較，nano-TiO2與BPA混合染毒組的細(xì)胞DNA雙鏈斷裂損傷加重(P<0.05)，hMsh2、MGMT和DNA-PKcs的基因表達(dá)水平明顯上升(P<0.05)。上述研究結(jié)果顯示BPA可促進(jìn)nano-TiO2團(tuán)聚，但團(tuán)聚的nano-TiO2仍可吸附BPA。單獨nano-TiO2暴露無DNA損傷作用，但nano-TiO2可加重BPA的DNA雙鏈斷裂效應(yīng)。其中hMSH2、MGMT和DNA-PKcs都參與2種污染物聯(lián)合暴露所致的DNA損傷修復(fù)。

納米二氧化鈦；雙酚A；理化性質(zhì)；聯(lián)合暴露；DNA損傷

納米二氧化鈦(nano-TiO2)是最常使用的納米材料之一，廣泛應(yīng)用于牙膏、防曬霜、化妝品、食品、藥物中[1]。nano-TiO2由于具有粒徑小、比表面積大、表面原子暴露等特點，可穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，產(chǎn)生大量活性氧(ROS)，對細(xì)胞造成不同程度的氧化應(yīng)激損傷，包括DNA損傷和染色體斷裂等[2-4]。近年來隨著納nano-TiO2的應(yīng)用日漸增多，大量進(jìn)入環(huán)境中的nano-TiO2很容易吸附環(huán)境中的不同污染物，可能產(chǎn)生與nano-TiO2單獨作用時不同的毒性作用[5]。

雙酚A(BPA)廣泛用于塑料瓶、食品和飲料容器制備及罐頭內(nèi)側(cè)涂層等[6]。BPA具有雌激素效應(yīng)，屬于環(huán)境雌激素，不但會干擾體內(nèi)雌激素平衡，還可通過氧化應(yīng)激導(dǎo)致機(jī)體損傷[7]。由于BPA在環(huán)境中廣泛存在，極易與nano-TiO2產(chǎn)生聯(lián)合作用，影響兩者的理化特性，并進(jìn)一步影響其聯(lián)合毒性效應(yīng)。

納米顆粒物與有機(jī)物的相互作用可影響納米顆粒的物理化學(xué)特性和吸附性能，并進(jìn)一步影響聯(lián)合暴露的毒性效應(yīng)[8]。BPA和nano-TiO2均可導(dǎo)致DNA損傷，DNA損傷也是腫瘤等多種慢性毒性效應(yīng)的主要早期生理和病理改變之一。為此，本研究以人胚肝L-02細(xì)胞的DNA損傷作為毒性評價指標(biāo)，首先研究了BPA對nano-TiO2理化性質(zhì)的影響，然后分析BPA和nano-TiO2聯(lián)合暴露對人胚肝L-02細(xì)胞DNA斷裂和修復(fù)的影響，為深入了解納米材料的生態(tài)效應(yīng)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 主要試劑和細(xì)胞株

納米粒度分析儀Delsa NanoC，購自美國Beckman公司；Waters Micromass-quattro Micro三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(HPLC-MS/MS)，購自美國Waters公司；Nano-TiO2(Degussa P25型，銳鈦礦型/金紅石型=8/2)，購自德國Degussa公司；BPA為化學(xué)純，購自美國Sigma公司；細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM，購自美國Sigma-aldrich公司；人胚肝細(xì)胞L-02，購于武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物收藏中心，本實驗室保存。胎牛血清，購自美國Gibco公司；Trizol試劑，購自美國invitroge公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑，購自Promega公司；PCR引物由上海博亞生物技術(shù)公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 粒徑和Zeta電位檢測

在純水、CaCl2和DEME培養(yǎng)基中，分別配制nano-TiO2(1、5、10 mg·L-1)和BPA (0、0.1、1、10 μmol·L-1)的混合溶液，然后用納米粒度分析儀在不同時間內(nèi)(0～60 min內(nèi))測定粒徑和Zeta電位。

1.2.2 nano-TiO2對BPA的吸附實驗

在純水、CaCl2和DEME培養(yǎng)基中，分別配制含10 mg·L-1nano-TiO2和10 μmol·L-1BPA的混合溶液，混合后不同時間段內(nèi)分別取1 mL混合溶液，12 000 r·min-1離心5 min后取上清液，0.22 μm濾膜過濾后用HPLC-MS/MS檢測。以未加入nano-TiO2(10 mg·L-1)的不同濃度BPA作對照組檢測。為防止BPA光降解nano-TiO2，整個實驗需避光檢測。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

L-02細(xì)胞于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，5%CO2、37 ℃常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行染毒，分組見表1，陰性對照組只加培養(yǎng)基，以300 μmol·L-1H2O2為陽性對照組。各組在無血清的培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.4 中性彗星實驗

首先將1%正常熔點瓊脂糖100 μL鋪于磨砂載玻片上，室溫下固化1.5 h后，加上混有1.0×105個細(xì)胞的0.50%低熔點瓊脂糖100 μL，蓋上蓋玻片4 ℃條件下放置10 min，去掉蓋玻片后在避光的條件下，在裂解液(2.5 mol·L-1NaCl、100 mmol·L-1Na2EDTA、10 mmol·L-1Tris base、1% Triton-X 100 and 10% DMSO)裂解1 h后，置于新鮮冰冷電泳緩沖液(0.3 mol·L-1CH3COONa，pH=8.5)中電泳40 min(電壓25 V，電流300 mA)。停止電泳后，10 μg·mL-1的溴化乙啶染色拍照。用CASP軟件分析細(xì)胞，以O(shè)liver尾矩(Olive Tail Moment，OTM，即尾部DNA百分含量×(尾光密度中心-頭光密度中心)為評價指標(biāo)，每個樣本隨機(jī)分析100個細(xì)胞)。

1.2.5 RT-PCR實驗

Trizol提取細(xì)胞總RNA，采用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑擴(kuò)增目的基因。擴(kuò)增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠中電泳(含0.5 μg·mL-1的溴化乙錠)，并分析光密度，PCR產(chǎn)物量以積分光密度×面積表示。以GAPDH為對照，目的條帶與對照組的灰度值的比值表示mRNA的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果(Results)

2.1 BPA對nano-TiO2理化特性的影響

2.1.1 BPA對nano-TiO2粒徑和Zeta電位的影響

在pH=7.7時，nano-TiO2表面帶負(fù)電荷，加入BPA后，nano-TiO2粒徑增加，表面Zeta電位升高，其中nano-TiO2在含Ca2+(0.2 g·L-1CaCl2)的DMEM培養(yǎng)基中的粒徑最大(表1)。此外，在任意介質(zhì)中，隨著時間和BPA濃度的增加，nano-TiO2的粒徑增大，Zeta電位上升(圖1)。顯示BPA能促進(jìn)nano-TiO2團(tuán)聚，具劑量-效應(yīng)關(guān)系。

表1 在不同緩沖液中BPA對nano-TiO2粒徑和Zeta電位的影響(n=3)Table 1 Average particle size and zeta potential of nano-TiO2 and BPA mixture in different solutions (n=3)

注： *與純水組比較，P<0.05；a所用數(shù)據(jù)為動態(tài)光散射3次平均值。

Note: * compared with pure water, P<0.05；a, Data were the average value of three measurements by the dynamic light scattering.

圖1 不同介質(zhì)中nano-TiO2對BPA的吸附動力學(xué)曲線Fig. 1 Adsorption kinetics of BPA by nano-TiO2 in different media

2.1.2 BPA對nano-TiO2吸附特性的影響

在任意pH=7.7的介質(zhì)中，10 mg·L-1nano-TiO2與10 μmol·L-1BPA混合時，nano-TiO2可有效吸附BPA，在300 min左右達(dá)到吸附平衡，平衡時BPA吸附率為22%左右。nano-TiO2吸附BPA的量在各個

介質(zhì)中無顯著差異(圖1)。

2.2 nano-TiO2和BPA聯(lián)合暴露對DNA的損傷效應(yīng)

中性彗星試驗顯示的是DNA雙鏈斷裂效應(yīng)，結(jié)果顯示本實驗nano-TiO2劑量下單獨作用不引起明顯L-02細(xì)胞DNA斷裂損傷(P>0.05)；而10 μmol·L-1BPA單獨作用可顯著性增加L-02細(xì)胞DNA雙鏈斷裂(P<0.001)；BPA與nano-TiO2聯(lián)合染毒可顯著增加L-02細(xì)胞DNA斷裂損傷，并且隨著BPA濃度的升高，Olive尾矩增加，呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。二因子析因分析，二者混合染毒有顯著效應(yīng)，存在協(xié)同作用(F=213.93，P<0.001)(表2)。

2.3 nano-TiO2和BPA聯(lián)合暴露對DNA損傷修復(fù)關(guān)鍵酶mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR實驗表明DNA損傷修復(fù)關(guān)鍵酶mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果表明高濃度(10 μmol·L-1)的BPA與nano-TiO2共同作用于L-02細(xì)胞時，均可明顯升高M(jìn)GMT、hMsh2和DNA-PKcs的RNA表達(dá)量，低濃度BPA與nano-TiO2的相互作用對各個酶活性無明顯的影響(P<0.05)。見表3。

表2 BPA與nano-TiO2聯(lián)合暴露對DNA斷裂損傷效應(yīng)Table 2 Combined effect of BPA and nano-TiO2 exposure on DNA damage (Oliver tail ±s))

注：*與陰性對照組(0.31±0.47)比較，P<0.05。

Note: *compared with negative control group (0.31±0.47), P<0.05.

表3 BPA與nano-TiO2聯(lián)合暴露對DNA損傷修復(fù)關(guān)鍵酶mRNA表達(dá)的影響Table 3 Combined effect of BPA and nano-TiO2 exposure on the expression level of DNA damage repair enzymes

注：*與hMSH2陰性對照組(1.63±0.13)比較，P<0.05；#與DNA-PKcs陰性對照組(1.69±0.53)比較，P<0.05；※與MGMT陰性對照組(1.82±0.42)比較，P<0.05。

Note: * compared with hMSH2 negative control group (1.63±0.13), P<0.05;#compared with DNA-PKcs negative control group (1.69±0.53), P<0.05;※compared with MGMT negative control group (1.82±0.42), P<0.05.

3 討論(Discussion)

納米材料在自然環(huán)境下易于聚集，從而影響納米顆粒的分布和毒性。P25 nano-TiO2的初始平均粒徑為25～50 nm，表面帶負(fù)電荷。由于同種電荷之間互相排斥，nano-TiO2的表面電荷可在一定程度上使其保持分散性。當(dāng)nano-TiO2溶解在水溶液中，-OH等溶解在水中的離子或分子會結(jié)合于nano-TiO2表面，改變nano-TiO2的表面電荷從而使顆粒有一定的團(tuán)聚。BPA的解離常數(shù)為9.7，因此在pH =7.7時,未解離的BPA可與覆蓋于nano-TiO2表面的-OH產(chǎn)生競爭，減少nano-TiO2表面的-OH，Zeta電位上升，nano-TiO2團(tuán)聚程度增加，并呈現(xiàn)一定的時間和劑量關(guān)系。溶液中的離子濃度明顯影響nano-TiO2的Zeta電位和團(tuán)聚程度。nano-TiO2和BPA在CaCl2和含大量離子的DMEM溶液中的Zeta電位和團(tuán)聚程度明顯高于純水，說明溶液中的離子是影響團(tuán)聚的主要因素。

雖然nano-TiO2在不同介質(zhì)中的Zeta電位和團(tuán)聚程度不同，但并不影響其對BPA的吸附能力，說明團(tuán)聚狀態(tài)并非影響納米材料吸附性能的主要因素。團(tuán)聚狀態(tài)的nano-TiO2仍可以有效吸附BPA，因此納米材料在環(huán)境中的潛在毒性效應(yīng)值得高度重視。

單細(xì)胞凝膠電泳(single cell gel electrophoresis, SCGE)，又稱彗星實驗(comet assay)，能夠靈敏地檢測DNA斷裂。其中中性彗星試驗?zāi)軠y定DNA雙鏈斷裂等。本實驗結(jié)果顯示，高濃度BPA(10 μmol·L-1)單獨染毒可導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂。 nano-TiO2單獨染毒在本實驗劑量下沒有明顯的DNA雙鏈損傷效應(yīng)，但聯(lián)合染毒時可促進(jìn)BPA的雙鏈斷裂損傷效應(yīng)(P<0.001)，兩者具有協(xié)同效應(yīng)。協(xié)同作用使混合暴露組在低濃度即發(fā)生了明顯的DNA斷裂損傷(表2)，顯示低濃度BPA和nano-TiO2聯(lián)合暴露時潛在的生態(tài)和健康風(fēng)險增加。以往有研究表明納米顆?？纱┩讣?xì)胞膜，進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)線粒體膜，干擾線粒體功能產(chǎn)生ROS[9]。ROS作為第二信使參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，啟動多種細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)。但當(dāng)各種外源或內(nèi)源性因素引起的ROS超過體內(nèi)的清除能力時，則會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的一些生物大分子(脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA等)受到損傷?，F(xiàn)認(rèn)為在氧化應(yīng)激條件下，細(xì)胞ROS水平升高，超過機(jī)體清除能力，可以攻擊DNA分子中的單個堿基和核糖部分，造成DNA鏈斷裂增加[10]。Matsuoka等[11]發(fā)現(xiàn)20 mg·mL-1的nano-TiO2與支氣管上皮細(xì)胞作用，引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)，ROS的產(chǎn)生超過細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)的清除能力。近期研究還表明nano-TiO2和一氧化碳聯(lián)合暴露能加速ROS生成，最終導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和DNA損傷[12]。綜合以上文獻(xiàn)，本實驗nano-TiO2與BPA聯(lián)合染毒時，對DNA損傷的協(xié)同效應(yīng)，很可能與ROS水平升高有關(guān)，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步闡釋。

DNA損傷修復(fù)酶在修復(fù)DNA斷裂與維護(hù)細(xì)胞穩(wěn)定方面具有重要作用。MGMT是參與烷基化損傷的關(guān)鍵酶[7]；hMsh2是一種重要的DNA錯配修復(fù)基因，其產(chǎn)物參與錯配修復(fù)途徑中識別DNA錯配并啟動修復(fù)反應(yīng)的作用[13]；DNA-PKcs與ku蛋白結(jié)合形成DNA依賴的蛋白激酶全酶(DNA-PK),在雙鏈DNA斷裂的非同源末端結(jié)合修復(fù)途徑中發(fā)揮重要作用，同時DNA-PKcs還可以通過磷酸化Sp1、fos、P53等一系列蛋白質(zhì)底物廣泛參與轉(zhuǎn)錄、信號傳導(dǎo)及凋亡等細(xì)胞過程[14]。本研究顯示，nano-TiO2單獨作用，并不引起DNA斷裂，也不影響DNA斷裂相關(guān)酶的RNA表達(dá)水平，但nano-TiO2與不同濃度的BPA聯(lián)合染毒，與相應(yīng)劑量的BPA單獨染毒比較，各種DNA修復(fù)酶表達(dá)水平均升高，說明nano-TiO2可增加BPA的DNA損傷及隨后發(fā)生的DNA損傷修復(fù)水平。烷基化修復(fù)、錯配修復(fù)和DNA斷鏈修復(fù)等修復(fù)途徑均可能參與nano-TiO2與BPA聯(lián)合暴露所致DNA損傷的修復(fù)。

綜上所述，nano-TiO2在環(huán)境和生物介質(zhì)中易于團(tuán)聚，但團(tuán)聚的nano-TiO2仍可有效吸附痕量BPA，并增加BPA的DNA損傷效應(yīng)。兩者的DNA損傷作用具有協(xié)同效應(yīng)，同時增加DNA修復(fù)酶的表。因此在考慮納米材料的毒性效應(yīng)時，需要進(jìn)一步評價團(tuán)聚的納米材料的潛在毒性效應(yīng)。

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◆

Impacts of Bisphenol A on Physicochemical Properties and DNA Damage Effects of Titanium Dioxide Nanoparticles on Human Embryo Liver Cell

Liu Yanjie1,2, Zhang Yanhong2, Lu Bin2,*

1. Laboratory Department, General Hospital of Yangtze River Shipping/Wuhan Brain Hospital, Wuhan 430015, China 2. School of Public Health, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China

2 November 2014 accepted 4 February 2015

Titanium dioxide nanoparticles (nano-TiO2) have been used widely and may react with a wide range of organic and biological molecules and then exhibit toxic effects in various cell lines, with or without photo activation. The effects of the interaction of TiO2nanoparticles (nano-TiO2) with bisphenol A (BPA) on their physicochemical properties and DNA damage effects in human embryo L-02 hepatocytes were evaluated. Different concentrations of BPA (0, 0.1, 1, 10 μmol·L-1) and nano-TiO2(0, 0.1, 1, 10 mg·L-1) were mixed to analyze the size distribution, zeta potential and adsorption capacity of nano-TiO2in different media. Then L-02 cells were exposed to different concentration of BPA (0, 0.1, 1, 10 μmol·L-1) and nano-TiO2(0, 0.1, 1, 10 mg·L-1) for 24 hours, respectively. DNA damage and the expression of DNA repair enzymes O6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT), DNA-dependent protein kinase catalytic subunit (DNA-PKcs) and hMSH2 in L-02 cells were analyzed. Results indicated that addition of BPA to nano-TiO2dispersions increased the aggregation level and zeta potential of nano-TiO2in all media. Nano-TiO2had a similar adsorption capacity in different media, although a higher aggregation level was observed in cell culture medium. Obviously, Interactions of nano-TiO2with BPA increased agglomeration and zeta potential, but did not influence the adsorption capacity of nano-TiO2. The aggregated nano-TiO2can enrich BPA effectively. Toxicity analysis showed that nano-TiO2did not induce significant DNA damage, but the mixture of nano-TiO2and BPA increased DNA double strand breaks and the expression of three DNA repair enzymes. It is clear that BPA and nano-TiO2mixture induce synergistic DNA damage effects. And hMSH2, MGMT and DNA-PKcs all participated in the DNA damage repair pathway induced by the mixture of BPA and nano-TiO2.

titanium dioxide nanoparticles; bisphenol A; physicochemical characters; combined exposure; DNA damage

國家863項目(No. 2012AA06A304)；國家自然科學(xué)基金項目(No. 21277054)；交通運輸部長江航務(wù)管理局科技項目(No. 201410015)

劉燕婕(1967-)，女，博士，研究方向為環(huán)境毒理學(xué)，E-mail: liuyanjie0411@aliyun.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: lubin@mails.tjmu.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20141102003

2014-11-02 錄用日期：2015-02-04

1673-5897(2015)2-224-06

X171.5

A

呂斌(1967-)，女，博士，教授，主要研究方向為環(huán)境毒理學(xué)，發(fā)表論文80余篇。

劉燕婕, 張艷紅, 呂斌. 雙酚A對納米二氧化鈦理化特性及其DNA損傷效應(yīng)的影響[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報, 2015, 10(2): 224-229

Liu Y J, Zhang Y H, Lu B. Impacts of bisphenol A on physicochemical properties and DNA damage effects of titanium dioxide nanoparticles on human embryo liver cell [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(2): 224-229(in Chinese)