納米Al2O3和Cd聯(lián)合暴露對(duì)銅銹環(huán)棱螺體內(nèi)Cd的生物積累和抗氧化酶活性的影響

龍奕，劉珊珊，王萌，馬陶武

吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，吉首 416000

納米Al2O3和Cd聯(lián)合暴露對(duì)銅銹環(huán)棱螺體內(nèi)Cd的生物積累和抗氧化酶活性的影響

龍奕，劉珊珊，王萌，馬陶武*

吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，吉首 416000

金屬氧化物納米顆粒的廣泛應(yīng)用導(dǎo)致它們大量地釋放到水環(huán)境中，其獨(dú)特的理化性質(zhì)有可能改變水環(huán)境中其他共存污染物(如重金屬)的生態(tài)毒性。為評(píng)價(jià)沉積物中納米氧化鋁(Al2O3-NPs)對(duì)重金屬Cd生態(tài)毒性的影響，采用底棲生物慢性暴露研究了Al2O3-NPs存在條件下Cd在底棲動(dòng)物銅銹環(huán)棱螺體內(nèi)生物積累的變化和Cd對(duì)肝胰臟抗氧化防御系統(tǒng)關(guān)鍵成分超氧化物歧化酶(SOD)與脂質(zhì)過氧化指標(biāo)丙二醛(MDA)以及Ⅱ相反應(yīng)的關(guān)鍵酶谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的影響。結(jié)果表明，低Cd濃度(5 μg·g-1)時(shí)，Al2O3-NPs對(duì)Cd生物積累沒有影響；中、高Cd濃度(25、100 μg·g-1)時(shí)，Al2O3-NPs顯著促進(jìn)Cd的生物積累，Al2O3-NPs對(duì)Cd的生物轉(zhuǎn)運(yùn)具有明顯的攜帶效應(yīng)。低Cd濃度時(shí)，無Al2O3-NPs處理組和Al2O3-NPs處理組的SOD活性與對(duì)照組相比均沒有顯著差異；中Cd濃度時(shí)，SOD活性顯著升高，而高Cd濃度時(shí)，SOD活性顯著下降，而且Al2O3-NPs處理組的SOD活性顯著低于無Al2O3-NPs處理組，Al2O3-NPs的存在加重了Cd對(duì)肝胰臟細(xì)胞的氧化脅迫或損傷。高Cd濃度時(shí)，無Al2O3-NPs處理組和Al2O3-NPs處理組的MDA水平均顯著升高，但Al2O3-NPs處理組的MDA水平顯著低于無Al2O3-NPs處理組，進(jìn)一步證明Al2O3-NPs對(duì)Cd氧化損傷的增強(qiáng)作用。中、高Cd濃度時(shí)，無Al2O3-NPs處理組和Al2O3-NPs處理組的GST活性均顯著下降，但Al2O3-NPs處理組的GST活性均顯著低于無Al2O3-NPs處理組，同樣說明了Al2O3-NPs對(duì)Cd毒性的增強(qiáng)作用。本研究提供了在沉積物-底棲動(dòng)物體系中Al2O3-NPs促進(jìn)重金屬生物積累的證據(jù)，而且Cd毒性的變化與肝胰臟中Cd的生物積累水平的變化基本一致，在中、高Cd濃度下，由于Al2O3-NPs的存在顯著促進(jìn)了Cd的生物積累，因而增強(qiáng)了Cd對(duì)銅銹環(huán)棱螺的生態(tài)毒性。

Cd；Al2O3-NPs；銅銹環(huán)棱螺；底棲動(dòng)物；沉積物；SOD；MDA；GST

隨著人工納米顆粒(engineering nanoparticles, ENPs)在生產(chǎn)過程和消費(fèi)品中日益廣泛的使用，ENPs勢(shì)必會(huì)大量地進(jìn)入水環(huán)境中[1]，其對(duì)水生生物的潛在威脅已經(jīng)引起高度關(guān)注[2]，了解其環(huán)境生物學(xué)效應(yīng)顯得非常重要。研究顯示，很多ENPs不僅自身對(duì)水生生物表現(xiàn)出毒性[3]，而且無論是存在于水相或沉積物中的ENPs，由于其較大的比表面積使得它們能夠與其它污染物(如持久性有機(jī)污染物和重金屬)發(fā)生相互作用(如吸附)[4-5]，從而改變與ENPs共存的其它污染物的生物有效性、生物積累特征和生態(tài)毒性[6-7]。因此，在ENPs的水生態(tài)毒理學(xué)研究中，探討ENPs與持久性有毒污染物的復(fù)合污染的生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)對(duì)于正確理解ENPs的潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)具有十分重要的意義。目前，一些學(xué)者開始關(guān)注ENPs與持久性有毒污染物的復(fù)合污染的生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)，但這些研究大多是基于水相的[8-9]，而基于沉積物-底棲動(dòng)物體系的研究相對(duì)較少[10]。沉積物不僅是底棲動(dòng)物的食物來源，而且是各種污染物的最終沉積庫(kù)，ENPs進(jìn)入水環(huán)境中后會(huì)快速積聚在沉積物中，因此研究沉積物中ENPs和持久性有毒污染物復(fù)合污染對(duì)底棲動(dòng)物的生態(tài)毒性顯得尤為重要。很顯然，沉積物棲居型底棲動(dòng)物是研究ENPs生態(tài)毒性以及ENPs與其它污染物相互作用的重要測(cè)試生物[7-11]。銅銹環(huán)棱螺(Bellamya aeroginosa)是腹足綱田螺科的一種典型的沉積物棲居型底棲軟體動(dòng)物，廣泛分布在我國(guó)淡水水體中，它對(duì)一些持久性有毒物質(zhì)的脅迫表現(xiàn)出較高的敏感性，適于沉積物毒性測(cè)試[12-17]。

金屬氧化物納米顆粒是應(yīng)用最廣泛的一類ENPs，其潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)受到廣泛關(guān)注[2]。迄今為止，已有一些有關(guān)納米二氧化鈦(TiO2-NPs)和重金屬Cd復(fù)合污染對(duì)一些水生生物(如大型溞、四膜蟲和魚類等)的生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)的研究報(bào)道，這些研究顯示在無毒性濃度TiO2-NPs存在的條件，Cd的生物有效性、生物積累和毒性受到明顯的影響[7, 18-21]。然而，在沉積物-底棲動(dòng)物體系中，有關(guān)金屬氧化納米顆粒與重金屬?gòu)?fù)合污染對(duì)沉積物棲居型底棲軟體動(dòng)物的生態(tài)毒理學(xué)研究還很少報(bào)道。不同的金屬氧化物納米顆粒往往具有不同理化性質(zhì)，因此它們與其它污染物相互作用后可能表現(xiàn)出不同的生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)。納米氧化鋁(Al2O3-NPs)在工業(yè)上應(yīng)用較多，如在光學(xué)器件和珠寶拋光中用作涂層和磨料[21]以及用在微電子器件上和作為化學(xué)催化劑[23]。

本研究以Al2O3-NPs作為研究對(duì)象，用銅銹環(huán)棱螺作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，選擇Cd作為模型污染物，采用沉積物慢性生物測(cè)試的方法，研究在無毒性濃度Al2O3-NPs存在時(shí)沉積物中Cd在銅銹環(huán)棱螺體內(nèi)的生物積累規(guī)律和Cd對(duì)肝胰臟抗氧化防御系統(tǒng)關(guān)鍵成分超氧化物歧化酶(SOD)與脂質(zhì)過氧化指標(biāo)丙二醛(MDA)以及Ⅱ相反應(yīng)的關(guān)鍵酶谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的影響，以期為合理評(píng)價(jià)沉積物中Al2O3-NPs與Cd復(fù)合污染的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

UV-757CRT紫外可見分光光度計(jì)(上海精科)；TGL-16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙平凡)；電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES，iCAP6300 Radial，Thermo Fisher Scientific，USA)；玻璃勻漿器，小型攪拌機(jī)。納米氧化鋁(Al2O3-NPs，購(gòu)自北京博宇高科新材料技術(shù)有限公司)：粒徑13 nm，純度99.9%；醋酸鎘(Cd(CH3COO)2·2H2O，分析純)購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為采自武漢植物園干凈池塘內(nèi)的銅銹環(huán)棱螺成螺。按Ma等的方法[14]在光溫氧可控的循環(huán)水培養(yǎng)系統(tǒng)中馴化培養(yǎng)60 d后，挑選大小均勻的健康個(gè)體，殼長(zhǎng)為(20.72 ± 1.77) mm，體重為(2.10 ± 0.33) g。實(shí)驗(yàn)所用沉積物為以采自湖南吉首市德夯自然保護(hù)區(qū)內(nèi)的無污染土壤制作的人工沉積物，采集與處理方法見文獻(xiàn)[14]。

1.3 沉積物生物測(cè)試

實(shí)驗(yàn)共設(shè)8個(gè)處理組，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，包括Cd單獨(dú)處理組(5、25、100 μg·g-1，以沉積物干重計(jì))、Al2O3-NPs(無毒性添加濃度0.05 g·kg-1)[22]單獨(dú)處理組以及分別與3種Cd濃度的組合處理、以及1個(gè)空白對(duì)照組。

人工沉積物加標(biāo)處理方法：對(duì)于每個(gè)處理，先將1 800 g干沉積物(過100目尼龍篩)和90 mg Al2O3-NPs粉末混合在一起，在攪拌機(jī)中連續(xù)攪拌1 h，然后轉(zhuǎn)入帶蓋小塑料桶中。然后用Cd(CH3COO)2·2H2O配制2 mg·mL-1(以純Cd計(jì))的Cd儲(chǔ)備液，按沉積物與Cd溶液1:1的體積比進(jìn)行混合(Cd儲(chǔ)備液的體積不足部分以去離子水補(bǔ)足)，用干凈的小木鏟攪拌至少24 h。對(duì)照組沉積物除不加Cd及Al2O3-NPs外，按相同方式處理。加標(biāo)完成后在室溫下靜置14 d。

將每組處理好的沉積物均分到3個(gè)重復(fù)測(cè)試缸(4 L)中，按沉積物與上覆水1: 4的體積比，沿缸壁小心加入去離子水，然后將所有測(cè)試缸置于1個(gè)水浴控溫的有機(jī)玻璃容器中，靜置3 d。暴露開始時(shí)，將所選實(shí)驗(yàn)螺隨機(jī)分組，放入測(cè)試缸中，每個(gè)測(cè)試缸內(nèi)放10只，以靜水充氧的方式暴露21 d，光照周期為12 h(白晝)∶12 h(黑暗)，水溫為(24 ± 1)℃，對(duì)每個(gè)測(cè)試缸加蓋尼龍網(wǎng)，中間留1個(gè)直徑為5 cm的圓孔，方便喂食。每3天更新1次上覆水并投喂少許觀賞魚餌料(三元牌)。暴露結(jié)束后，取出實(shí)驗(yàn)螺，用鉗子夾破螺殼，從內(nèi)臟團(tuán)中分離出肝胰臟，稱重，一部分立即放入液氮中保存，用于生化測(cè)定，另一部分放入烘箱中80 ℃下烘干至恒重，用于Cd含量的測(cè)定。

1.4 測(cè)定

1.4.1 肝胰臟中Cd含量的測(cè)定

采用HNO3-HClO4消解法消解銅銹環(huán)棱螺的肝胰臟樣品，然后采用ICP-OES測(cè)定Cd含量[12]。采用相同程序分析生物成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)貽貝(GBW08571，北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司)以進(jìn)行分析方法的質(zhì)量控制，結(jié)果表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。

1.4.2 生化測(cè)定

取冷凍的、已知重量的肝胰臟樣品，按1: 9(g: mL)的比例加入含0.0001 mol·L-1EDTA-2Na、0.01 mol·L-1蔗糖和0.8%(質(zhì)量百分?jǐn)?shù))NaCl的Tris-HCl緩沖液(0.01 mol·L-1、pH=7.4)，同時(shí)加入0.001 mol·L-1蛋白酶抑制劑PMSF溶液。用玻璃勻漿器在冰浴下制成勻漿，然后轉(zhuǎn)入0.5 mL離心管，于4 ℃、2 500 r·min-1，離心10 min，先取上清液20 μL(即10%勻漿上清液)，用勻漿介質(zhì)稀釋到1%，用于測(cè)SOD活性；再取上清液220 μL，用于測(cè)GST活性；剩余的勻漿液在10 000 r·min-1繼續(xù)離心20 min，取上清液，稀釋到1%，用于測(cè)定MDA含量。SOD活性采用氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)光化還原法測(cè)定，以活力單位表示SOD活性值，在550 nm下測(cè)吸光度，以50%抑制率的酶量為1個(gè)活力單位(U·mg-1蛋白)；GST活性采用CDNB法測(cè)定，在340 nm下測(cè)吸光度，活力單位以U·mg-1蛋白表示；MDA含量采用硫代苯巴比妥酸(TBA)比色法測(cè)定，在532 nm下測(cè)定吸光值，活力單位以nmol·mg-1蛋白表示；采用考馬斯亮藍(lán)染色法在595 nm下測(cè)定蛋白含量[14]。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)先進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，然后利用單因素方差分析法(ANOVA)和多重比較檢驗(yàn)法(LSD)進(jìn)行組間差異顯著性檢驗(yàn)，差異顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 Al2O3-NPs對(duì)銅銹環(huán)棱螺肝胰臟中Cd生物積累的影響

Cd和Al2O3-NPs加標(biāo)沉積物21 d暴露后銅銹環(huán)棱螺肝胰臟中Cd生物積累的變化如圖1所示。無論是在無Al2O3-NPs的處理組還是在Al2O3-NPs的處理組，銅銹環(huán)棱螺肝胰臟中Cd的生物積累均顯著高于對(duì)照組，而且隨沉積物Cd濃度的增加而顯著升高。在低Cd(5 μg·g-1)濃度下，Al2O3-NPs對(duì)Cd生物積累沒有影響。在中、高Cd(25、100 μg·g-1)濃度下，Al2O3-NPs顯著促進(jìn)Cd的生物積累，Al2O3-NPs處理組的Cd生物積累分別比無Al2O3-NPs處理組提高了約35%和62%。

圖1 Cd和Al2O3-NPs加標(biāo)沉積物21 d暴露后 銅銹環(huán)棱螺肝胰臟中Cd的含量注：各處理間無相同字母表示差異顯著，P<0.05，下同。Fig. 1 Hepatopancreatic Cd contents in Bellamya aeruginosa following 21-d exposure to Cd- and Al2O3-NPs-spiked sedimentsNote: Treatments labeled with different letters differed significantly, P<0.05. The same below.

2.2 Al2O3-NPs存在條件下Cd對(duì)銅銹環(huán)棱螺肝胰臟SOD活性的影響

Cd和Al2O3-NPs加標(biāo)沉積物21 d暴露后銅銹環(huán)棱螺肝胰臟SOD活性的變化如圖2所示。在無Al2O3-NPs處理組和Al2O3-NPs處理組，銅銹環(huán)棱螺肝胰臟SOD活性隨沉積物Cd濃度的增加均表現(xiàn)為先升后降的變化趨勢(shì)。在低Cd(5 μg·g-1)濃度下，無Al2O3-NPs處理組和Al2O3-NPs處理組的SOD活性與對(duì)照組相比均沒有顯著差異。在中Cd(25 μg·g-1)濃度下，無Al2O3-NPs處理組和Al2O3-NPs處理組的SOD活性均被顯著誘導(dǎo)，與對(duì)照組相比，分別上升了約56%和41%，Al2O3-NPs處理組的SOD活性顯著低于無Al2O3-NPs處理組。在高Cd(100 μg·g-1)濃度下，無Al2O3-NPs處理組和Al2O3-NPs處理組的SOD活性均被顯著抑制，與對(duì)照組相比，分別下降了約32%和43%，Al2O3-NPs處理組的SOD活性同樣顯著低于無Al2O3-NPs處理組。

圖2 Cd和Al2O3-NPs加標(biāo)沉積物21 d暴露后 銅銹環(huán)棱螺肝胰臟SOD活性Fig. 2 Hepatopancreatic SOD activities in Bellamya aeruginosa following 21-d exposure to Cd- and Al2O3-NPs-spiked sediments

2.3 Al2O3-NPs存在條件下Cd對(duì)銅銹環(huán)棱螺肝胰臟MDA含量的影響

Cd和Al2O3-NPs加標(biāo)沉積物21 d暴露后銅銹環(huán)棱螺肝胰臟MDA水平的變化如圖3所示。由圖可知，在低、中Cd(5、25 μg·g-1)濃度下，無Al2O3-NPs處理組和Al2O3-NPs處理組的MDA水平與對(duì)照組相比均沒有顯著差異。在高Cd(100 μg·g-1)濃度下，無Al2O3-NPs處理組和Al2O3-NPs處理組的MDA水平均顯著升高，與對(duì)照組相比，分別上升了約283%和170%，Al2O3-NPs處理組的MDA水平顯著低于無Al2O3-NPs處理組。

2.4 Al2O3-NPs存在條件下Cd對(duì)銅銹環(huán)棱螺肝胰臟GST活性的影響

Cd和Al2O3-NPs加標(biāo)沉積物21 d暴露后銅銹環(huán)棱螺肝胰臟GST活性的變化如圖4所示。可以看出，除低Cd濃度(5 μg·g-1)下，Al2O3-NPs處理組的GST活性與對(duì)照組相比顯著升高外，其他處理組的GST活性隨沉積物Cd濃度的增加均表現(xiàn)為顯著下降的變化趨勢(shì)。在中、高Cd(25、100 μg·g-1)濃度下，無Al2O3-NPs處理組的GST活性與對(duì)照組相比分別下降了約23%和35%；Al2O3-NPs處理組的GST活性與對(duì)照組相比分別下降了約30%和48%，Al2O3-NPs處理組的GST活性均顯著低于無Al2O3-NPs處理組。

圖3 Cd和Al2O3-NPs加標(biāo)沉積物21 d 暴露后銅銹環(huán)棱螺肝胰臟MDA水平Fig. 3 Hepatopancreatic MDA levels in Bellamya aeruginosa following 21-d exposure to Cd- and Al2O3-NPs-spiked sediments

圖4 Cd和Al2O3-NPs加標(biāo)沉積物21 d 暴露后銅銹環(huán)棱螺肝胰臟GST活性Fig. 4 Hepatopancreatic GST activities in Bellamya aeruginosa following 21-d exposure to Cd- and Al2O3-NPs-spiked sediments

3 討論(Discussion)

3.1 Al2O3-NPs對(duì)Cd生物積累的影響

ENPs與常規(guī)材料相比具有小尺寸、大表面積和高表面能等特點(diǎn)，導(dǎo)致它們對(duì)其他污染物具有強(qiáng)烈的吸附能力，隨之可能改變其他污染的生物有效性和生態(tài)毒性[24]。目前對(duì)Al2O3-NPs潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)的研究主要關(guān)注Al2O3-NPs自身的毒性[25-26]，而關(guān)于Al2O3-NPs對(duì)其他污染物的生物積累和生態(tài)毒性的影響則未見報(bào)道。

在本研究中，我們通過沉積物生物測(cè)試研究了Al2O3-NPs存在情況下Cd在底棲動(dòng)物銅銹環(huán)棱螺肝胰臟中的生物積累和氧化脅迫的變化規(guī)律。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低Cd濃度(5 μg·g-1)時(shí)，Al2O3-NPs對(duì)Cd的生物積累沒有影響，當(dāng)沉積物中的Cd處于中、高水平(25、100 μg·g-1)時(shí)，Al2O3-NPs顯著促進(jìn)Cd的生物積累，Al2O3-NPs對(duì)Cd的生物轉(zhuǎn)運(yùn)具有明顯的攜帶效應(yīng)。本研究的結(jié)果與一些研究者針對(duì)TiO2-NPs基于水介質(zhì)的生物測(cè)試結(jié)果是相似的，Zhang等[6]發(fā)現(xiàn)在水介質(zhì)中由于TiO2-NPs對(duì)Cd具有較強(qiáng)的吸附作用，極大地增強(qiáng)了Cd在鯉魚(Cyprinus carpio)體內(nèi)的生物積累，積累的Cd包括游離的Cd和與TiO2-NPs結(jié)合的Cd，增加的Cd積累主要來自后者；Tan等[18]的研究表明當(dāng)Cd和Zn被TiO2-NPs吸附后，大型溞(Daphnia magna)對(duì)Cd和Zn的吸收顯著增加；Tan等[19]進(jìn)一步指出，TiO2-NPs能夠促使大型溞從溶解相中吸收的Cd顯著增加，主要是由于進(jìn)入大型溞腸道中的TiO2-NPs為Cd離子提供了大量的結(jié)合位點(diǎn)，即當(dāng)大型溞從水中吸收溶解Cd時(shí)，腸道中的TiO2-NPs吸附這些Cd離子，導(dǎo)致更多的Cd離子積累在大型溞體內(nèi)，因此認(rèn)為TiO2-NPs不僅作為載體將Cd轉(zhuǎn)運(yùn)到體內(nèi)，而且在腸道中TiO2-NPs還提供Cd吸附結(jié)合位點(diǎn)；同樣，Yang等[20]的研究也表明，TiO2-NPs可以充當(dāng)Cd在原生動(dòng)物四膜蟲(Tetrahymena thermophila)體內(nèi)積累的載體，Cd可以以自由離子或Cd-TiO2-NPs復(fù)合物的形式被吸收，其中以復(fù)合體形式吸收的占46.3%。然而還有一些研究顯示，TiO2-NPs對(duì)Cd的生物積累沒有影響，例如，TiO2-NPs不影響Cd在海生紫貽貝(Mytilus galloprovincialis)組織中Cd的積累[27]，這與淡水生物不同，可能與測(cè)試介質(zhì)的理化性質(zhì)有關(guān)，如由于ENPs的團(tuán)聚和沉淀作用并不顯著增加對(duì)Cd的吸附；此外，Vale等[28]指出TiO2-NPs對(duì)Cd在淡水雙殼類河蜆(Corbicula fluminea)體內(nèi)的生物積累沒有影響，這可能與河蜆的取食方式(濾食)有關(guān)。因此，在水介質(zhì)中，金屬氧化物ENPs促進(jìn)重金屬生物積累的潛在機(jī)制至少體現(xiàn)在3個(gè)方面：一是，ENPs吸附重金屬離子形成復(fù)合體物，這種吸附了大量ENPs的復(fù)合物更容易被水生生物攝取，因而引起重金屬離子積累增加；二是，由于ENPs容易被生物吸收，進(jìn)入腸道的ENPs可以吸附更多的重金屬離子，增加其生物積累；三是，雖然ENPs可以吸附重金屬離子，但由于ENPs在水環(huán)境中能夠快速聚集并沉降(特別是受到離子強(qiáng)度的影響)[29]，并不能有效地吸附重金屬離子，抑或即使吸附了一些重金屬離子，但測(cè)試生物并不能有效地?cái)z取，當(dāng)測(cè)試介質(zhì)中重金屬離子濃度較低時(shí)，ENP不會(huì)對(duì)重金屬產(chǎn)生影響，而當(dāng)重金屬離子濃度相對(duì)較高時(shí)，ENPs的吸附作用降低測(cè)試介質(zhì)中重金屬離子濃度，反而會(huì)降低生物積累，如TiO2-NPs的存在使Cu在大型溞體內(nèi)的積累量降低14倍[30]。銅銹環(huán)棱螺是1種沉積物棲居型、以鰓呼吸的底棲動(dòng)物，主要從沉積物中取食[14]，在本研究中采用的上覆水是去離子水，因而離子強(qiáng)度的影響可以忽略，因此在沉積物測(cè)試介質(zhì)中，銅銹環(huán)棱螺可能同時(shí)從間隙水和包含有大量Al2O3-NPs與Cd的復(fù)合體中攝取Cd，而增加的Cd積累主要來自復(fù)合體。本研究提供了在沉積物-底棲動(dòng)物體系中Al2O3-NPs促進(jìn)重金屬生物積累的重要證據(jù)，但Al2O3-NPs存在時(shí)重金屬的生物轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制還有待進(jìn)一步考證。

3.2 Al2O3-NPs對(duì)Cd毒性的影響

當(dāng)生物機(jī)體受到外源性化學(xué)物質(zhì)脅迫時(shí)，作為機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)的重要組分的SOD可以通過將O2-·歧化為H2O2來降低或消除氧化脅迫以維持活性氧自由基的平衡，是機(jī)體對(duì)抗活性氧自由基的第一道防線，但過多的活性氧自由基則會(huì)激活或抑制SOD活性；MDA水平是衡量機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度和細(xì)胞氧化損傷的指示，因此，細(xì)胞SOD活性和MDA含量的改變體現(xiàn)了機(jī)體保護(hù)自身免受毒害的1種防護(hù)機(jī)制，因此它們常常被當(dāng)作指示和評(píng)價(jià)污染物潛在生態(tài)毒性的良好生物標(biāo)志物[31-32]。本研究表明，低Cd濃度(5 μg·g-1)時(shí)，無Al2O3-NPs處理組和Al2O3-NPs處理組的SOD活性與對(duì)照組相比均沒有顯著差異，說明沒有造成活性氧自由基積累和氧化脅迫；中Cd濃度(25 μg·g-1)時(shí)，SOD活性顯著升高，表明已經(jīng)引起明顯的氧化脅迫；高Cd濃度(100 μg·g-1)時(shí)，SOD活性顯著下降，則表明已經(jīng)引起嚴(yán)重的氧化損傷，而且，與無Al2O3-NPs處理組相比，Al2O3-NPs處理組的SOD活性顯著下降，說明Al2O3-NPs加重了Cd對(duì)肝胰臟細(xì)胞的氧化脅迫或損傷，在高Cd濃度時(shí)，無Al2O3-NPs處理組和Al2O3-NPs處理組的MDA水平均顯著升高，且Al2O3-NPs處理組的MDA水平顯著低于無Al2O3-NPs處理組，進(jìn)一步證明了Al2O3-NPs對(duì)Cd氧化損傷的增強(qiáng)效應(yīng)。

GST是一種在機(jī)體Ⅱ代謝中參與親電性化合物解毒的關(guān)鍵酶，它同時(shí)也參與細(xì)胞的抗氧化防御，污染脅迫時(shí)GST活性的改變體現(xiàn)了機(jī)體對(duì)污染物的生物轉(zhuǎn)化和抗氧化功能，GST同樣可以作為指示和評(píng)價(jià)污染物潛在生態(tài)毒性的敏感生物標(biāo)志物[33]。本研究顯示，中、高Cd(25、100 μg·g-1)濃度時(shí)，無Al2O3-NPs處理組和Al2O3-NPs處理組的GST活性均顯著下降，說明在較高濃度Cd長(zhǎng)期脅迫下，細(xì)胞中GST活性直接被抑制或在對(duì)Cd的解毒過程中被大量消耗[34]；而且Al2O3-NPs處理組的GST活性均顯著低于無Al2O3-NPs處理組，也說明了Al2O3-NPs對(duì)Cd毒性的增強(qiáng)作用。其他一些有關(guān)金屬氧化物ENPs對(duì)重金屬毒性影響的研究也顯示ENPs的確可以通過增加重金屬的生物積累而顯著增強(qiáng)生物毒性，例如，在浮游動(dòng)物中，TiO2-NPs可以使Ag對(duì)大型溞幼體的毒性增加40%[30]；TiO2-NPs同樣可以顯著增強(qiáng)Cu對(duì)大型溞的毒性[35]；TiO2-NPs顯著增強(qiáng)As對(duì)網(wǎng)紋溞(Ceriodaphnia dubia)的毒性[36]。然而在浮游植物中得到的結(jié)果卻相反，TiO2-NPs降低Cd對(duì)淡水綠藻月牙藻(Pseudokirchneriella subcapitata)的毒性[7]；TiO2-NPs可以降低Cd對(duì)萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的生物積累和毒性[37-38]；TiO2-NPs同樣降低Cd對(duì)銅綠微囊藻的毒性[39]，這可能與不同類型生物吸收TiO2-NPs和Cd的方式不同有關(guān)，在浮游植物測(cè)試體系中，由于TiO2-NPs對(duì)Cd離子的吸附作用，水中游離態(tài)Cd離子濃度降低，而Cd與TiO2-NPs的復(fù)合物難以被浮游植物吸收，從而降低毒性對(duì)Cd離子對(duì)藻的毒性明顯降低。

總的來看，在本研究中，沉積物中Al2O3-NPs存在的情況下，Cd對(duì)銅銹環(huán)棱螺肝胰臟SOD活性、MDA含量和GST活性的影響與肝胰臟中Cd的生物積累水平的變化是一致的，在中、高Cd濃度下，Al2O3-NPs顯著促進(jìn)了Cd的生物積累，因而增強(qiáng)了Cd的生態(tài)毒性。因此，在以后的研究中，不僅要關(guān)注Al2O3-NPs本身的環(huán)境轉(zhuǎn)歸和毒性，更要關(guān)注Al2O3-NPs與其他污染物共存時(shí)對(duì)其他污染物的協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)和聯(lián)合毒性效應(yīng)，同時(shí)還要考慮環(huán)境因子的影響，這樣才能全面了解Al2O3-NPs的潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。

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Effects of Cd and Al2O3-NPs Co-exposure on Bioaccumulation of Cd and Antioxidase Enzyme Activities inBellamyaaeroginosa

Long Yi, Liu Shanshan,Wang Meng, Ma Taowu*

College of Biology and Environmental Science, Jishou University, Jishou 416000, China

16 October 2014 accepted 21 November 2014

The widespread applications of metal oxide nanoparticles lead to unintentional release of these materials into aquatic environments, the unique physico-chemical properties may potentially alter the ecotoxicity of co-existing contaminants, such as heavy metals. In this work, the dynamics of Cd accumulation and the effects of Cd on two key components of antioxidant defense system, superoxide dismutase (SOD) and lipid peroxidation index malondialdehyde (MDA), and phase Ⅱ biotransformation enzyme glutathione-S-tansferase (GST) in the hepatopancreas of Bellamya aeroginosa, a benthic macroinvertebrate, were investigated in the presence of aluminum oxide nanoparticles (Al2O3-NPs) by applying chronic exposure to assess the impacts of Al2O3-NPs on ecotoxicity of Cd. The results showed that Al2O3-NPs had no significant effect on Cd bioaccumulation at low Cd concentration (5 μg·g-1). By contrast, Cd bioaccumulation was significantly enhanced by Al2O3-NPs at medium and high Cd concentration (25 and 100 μg·g-1), indicating obvious carrier effect of Al2O3-NPs on Cd biotransport. At low Cd concentration, SOD activities in treatments with or without Al2O3-NPs, had no significant difference compared to the controls; at medium Cd concentration, SOD activities in all treatments significantly increased. But at high Cd concentration SOD activities significantly decreased, and moreover SOD activities in treatments with Al2O3-NPs were statistically lower than those in treatments without Al2O3-NPs, indicating the presence of Al2O3-NPs aggravated oxidative stress or damage caused by Cd. For MDA, at high Cd concentration, MDA levels in treatments with or without Al2O3-NPs significantly increased, but MDA levels in treatments with Al2O3-NPs were lower than those in treatments without Al2O3-NPs, which further testified the enhancement of Al2O3-NPs on oxidative damage by Cd. As for GST, at medium and high Cd concentration, GST activities in treatments with or without Al2O3-NPs significantly decreased, but GST activities in treatments with Al2O3-NPs were significantly lower than those in treatments without Al2O3-NPs, which also confirmed above enhancement effects. Overall, our study provided the evidence that Al2O3-NPs enhanced Cd bioaccumulation in the sediment-zoobenthos system, and the change of Cd toxicity coincided with the body burden of Cd, at medium and high Cd concentration, high levels of Cd bioaccumulation enhanced ecotoxicity of Cd on B. aeroginosa.

Cd; Al2O3-NPs; Bellamya aeruginosa; zoobenthos; sediment; SOD; MDA; GST

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41171383)

龍奕(1989-)，女，碩士，研究方向?yàn)樯鷳B(tài)毒理學(xué)，E-mail: long12202008@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: mtw922@163.com

10.7524/AJE.1673-5897.20141016001

2014-10-16 錄用日期：2014-11-21

1673-5897(2015)2-216-08

X171.5

A

馬陶武(1968-)，男，博士，教授，主要研究方向?yàn)樗鷳B(tài)毒理學(xué)，發(fā)表論文40余篇。

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