酚類化合物短期暴露對小麥和大麥苗期根伸長的影響

王珊，蘇玉紅，喬敏

1. 新疆大學化學化工學院，烏魯木齊 830046 2. 中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心，北京 100085

酚類化合物短期暴露對小麥和大麥苗期根伸長的影響

王珊1,2，蘇玉紅1,*，喬敏2

1. 新疆大學化學化工學院，烏魯木齊 830046 2. 中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心，北京 100085

采用小麥和大麥為受試作物，以其在受試化合物污染的土壤中培育3 d后獲得的根伸長的半數(shù)抑制濃度(IC50)評價了12種酚類化合物的毒性效應。結果表明，在所設濃度范圍內(nèi)，酚類對作物根伸長均存在劑量-效應關系。小麥對受試酚類的IC50范圍為：12.92～231.76 mg·kg-1，其中鄰苯二酚只在最高濃度500 mg·kg-1時對小麥的毒性效應顯著。大麥對受試化合物的IC50范圍為：7.15～478.31 mg·kg-1。小麥對3-甲基酚、雙酚A、2-萘酚和壬基酚相對敏感，而其它8種化合物則是大麥相對更敏感。酚類化合物對小麥和大麥的毒性強度整體趨勢一致。

酚類化合物；小麥；大麥；根伸長；植物毒性

酚類物質(zhì)是指芳香環(huán)與羥基相連的一大類有機化合物，被廣泛地應用于石油化工、煉焦、制藥、造紙、顏料合成、木材防腐、塑料制造、皮革等工業(yè)部門[1-2]，是重要的化工原料之一，也是有毒化學物質(zhì)。酚類化合物具有致癌、致畸和致突變的潛在毒性[3]。它們經(jīng)空氣及水傳播，可長期殘留于土壤中，會對生態(tài)環(huán)境和人體健康造成嚴重的危害。20世紀70年代中期，美國國家環(huán)保局(Environmental Protection Agency, EPA)就將11種酚類化合物列入129種環(huán)境優(yōu)先污染物之中[4]。中國也將6種酚類化合物確定為優(yōu)先控制有機污染物[5]，世界各國對于酚類化合物的環(huán)境污染和生態(tài)效應都給予了普遍的關注和高度的重視。

然而，單純的化學分析不足以評估污染土壤的潛在生態(tài)影響，因此，利用生物對污染土壤進行生態(tài)毒性評估獲得了廣泛的關注[6]。自20世紀80年代以來，研究人員廣泛開展生態(tài)毒理試驗方法的研究，其中土壤生態(tài)毒理診斷通過選擇敏感物種(如，土壤微生物、陸生植物、土壤中脊椎動物、與土壤接觸的無脊椎動物等)作為毒性診斷的指標，提供土壤污染的信息。高等植物是生態(tài)系統(tǒng)中的基本組成部分，利用其生長狀況診斷土壤污染，是土壤質(zhì)量評價的重要方法之一。目前已建立的高等植物毒理試驗方法有根伸長抑制試驗、種子發(fā)芽試驗和植物幼苗早期生長試驗[7]。試驗的評價指標一般選擇種子發(fā)芽率、根伸長抑制率、芽伸長抑制率、生物量(鮮重、干重)等。其中植物根因與土壤直接接觸，常常能快速敏感的反映污染物毒性，多項研究結果也表明對外源污染物的敏感性短期內(nèi)通常表現(xiàn)為根伸長抑制率大于芽伸長等其他評價指標[8-10]。

小麥作為全球最主要的糧食作物之一，常被用來進行根分生組織細胞遺傳學測試[11]及表征化學品生態(tài)毒性效應[12-13]。大麥在我國栽培作物中分布最廣泛，也常被用于生態(tài)風險評估測試[14]。本研究選擇典型須根系作物小麥和大麥作為供試作物，采集自然土樣進行作物早期生長實驗，觀察酚類化合物污染土壤對小麥和大麥苗期根伸長抑制率的影響，確定小麥和大麥根伸長對不同酚類物質(zhì)的敏感程度，為快速評價酚類污染土壤的潛在生態(tài)風險提供科學依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 供試材料和儀器

試劑：2,4,6-三氯酚，2,4-二氯酚，2-氯酚，雙酚A(純度均為98%，北京伊諾凱科技有限公司)，4-硝基酚，3-甲基酚，2,4-二甲基酚，苯酚，間苯二酚(純度均為99%，百靈威化學技術有限公司)，鄰苯二酚(純度為99%，梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司)，壬基酚(純度為98%，阿達瑪斯試劑有限公司)，2-萘酚(純度為99%，德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司)，丙酮為國產(chǎn)色譜純。上述試劑均避光保存。

供試土壤和種子：供試土壤黃棕壤，采自北京市大興區(qū)黃村鎮(zhèn)耕地區(qū)0～20 cm表層黃棕壤(風干，過2 mm篩，無明顯植物殘體)，土壤理化性質(zhì)見表1。小麥(Triticum aestivum，中國春)，大麥(Hordeum vulgare，ZDM09906，〔京〕306)種子購自中國農(nóng)業(yè)科學院。

儀器：RXZ-430B型培養(yǎng)箱(寧波東南儀器有限公司)，AR224CN型萬分之一天平(OHAUS公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 預備實驗

稱取100 g風干土，直接取配置成0、0.1、1、5、10、50 mg·mL-16個不同濃度梯度的酚類化合物的丙酮溶液1 mL先與少量土壤混合，通過遞增土壤、多次混合的方法以達到均勻染毒的效果。將染毒后的土壤放于通風櫥，至溶劑揮發(fā)完全[15]。

將染毒后的土壤依次加入直徑為15 cm的培養(yǎng)皿中，調(diào)節(jié)水土比為1∶5[15]。取200粒種子，先用10%的H2O2消毒10 min，再用去離子水沖洗干凈，然后放入25 ℃人工氣候箱中催芽24 h，挑選出發(fā)芽一致的種子，用鑷子將其均勻播種于土壤中，在恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃黑暗培養(yǎng)3 d[16]，實驗結果用名義濃度表示，為了防止水分流失和揮發(fā)損失，培養(yǎng)過程中用封口膜密封培養(yǎng)皿，實驗設3個重復。確定根伸長抑制濃度(IC)達到0%～60%抑制率的區(qū)間后，開始正式試驗。

表1 土壤理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of soil

注：C/N表示碳氮比，CEC表示陽離子交換量，WHC表示土壤持水量。

Note: C/N is the ratio of total carbon and total nitrogen, CEC is short for cation exchange capacity, WHC is short for water holding capacity.

1.2.2 正式實驗

根據(jù)預備試驗結果，設置至少6個不同處理濃度，每個處理放入10粒種子。在與預備試驗相同的溫度、水分等條件下，培養(yǎng)3 d。實驗結束時，記錄下各處理土壤中種子根伸長(根長的測定以胚軸與根之間的過度點開始)，實驗設3個重復。各化合物正式實驗設置濃度列于表2，其中苯酚對小麥的毒性效應實驗加設了200 mgkg-1濃度。

表2 12種酚類化合物植物毒性正式試驗濃度設置Table 2 Test concentrations of 12 phenols

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Sigma Plot 10.0對各評價指標抑制率與供試污染物濃度進行擬合，SPSS 13.0對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和相關分析，并且所有數(shù)據(jù)顯著性差異水平設置為P<0.05。

2 結果(Results)

2.1 酚類對植物根伸長的毒性

實驗中發(fā)現(xiàn)酚類物質(zhì)在低濃度時對作物根伸長影響不顯著甚至促進根伸長，高濃度時則存在抑制作用。隨著濃度的進一步升高，抑制作用逐漸增強。例如壬基酚，在其濃度為1、10、50 mg·kg-1時，對大麥根伸長的抑制率分別為-5.42%、-7.51%、-3.29%，當其濃度高于50 mg·kg-1時，對大麥根伸長抑制率隨濃度升高，抑制作用也越強，在最高設定濃度500 mg·kg-1，抑制率達到75.72%。與相關文獻中酚類對植物生長影響作用趨勢結論一致[17]。

將小麥和大麥根伸長抑制率與酚類化合物設定的濃度進行擬合，得到酚類化合物對小麥(表3)和大麥(表4)根伸長抑制的IC50值。對比不同酚類化合物作用于同種作物的IC50值，發(fā)現(xiàn)除雙酚A、2-萘酚和2,4-二甲基酚外，酚類化合物對兩種作物的毒性趨勢一致，均是2,4,6-三氯酚>2,4二氯酚> 4-硝基酚>2-氯酚>3-甲基酚>苯酚>間苯二酚>壬基酚>鄰苯二酚。并且由回歸方程及其相關系數(shù)(R)可以看出酚類對小麥和大麥毒性存在明顯劑量-效應關系。

12種酚類化合物中3-甲基酚、壬基酚、2-萘酚和雙酚A共4種化合物對小麥的IC50值分別為62.40、38.83、63.59、175.70 mg·kg-1，低于大麥相應的IC50值，可見小麥對這4種物質(zhì)相對敏感，而其它8種化合物則是大麥相對更敏感。

3 討論(Discussion)

本研究以小麥和大麥根伸長為評價指標，分析了12種酚類化合物的生態(tài)毒性。結果表明，酚類化合物毒性整體趨勢為氯酚>甲基酚>苯酚>二元酚，4-硝基酚毒性介于2,4-二氯酚和2-氯酚之間，壬基酚毒性介于間苯二酚和鄰苯二酚之間，雙酚A和2-萘酚因其對2種作物的IC50值有顯著不同，故不適用此規(guī)律。 本研究發(fā)現(xiàn)在最低設定濃度下，2,4二氯酚、2-氯酚、雙酚A、2,4-二甲基酚、間苯二酚和2-萘酚化合物對作物根伸長影響與空白對照沒有顯著差異；2,4,6-三氯酚表現(xiàn)出顯著抑制作用；3-甲基酚、苯酚、壬基酚、4-硝基酚、鄰苯二酚均表現(xiàn)刺激根伸長效應。

表3 酚類化合物濃度對小麥根伸長抑制率的回歸方程和IC50值Table 3 Regression equation between phenols concentration and inhibition rate of root elongation for wheat and the calculated IC50 values

表4 酚類化合物濃度對大麥根伸長抑制率的回歸方程和IC50值Table 4 Regression equation between phenols concentration and inhibition rate of root elongation for barley and the calculated IC50 values

而在在高濃度范圍內(nèi)所有酚類均表現(xiàn)出顯著抑制作用。這種毒物在較低的濃度下表現(xiàn)出對植物生長的刺激作用，在高濃度時則表現(xiàn)出對植物生長的抑制作用的雙相劑量-效應關系被稱為毒物刺激效應(hormesis效應)，又稱毒物興奮效應。有研究認為化學興奮效應廣泛存在于不同種屬、不同結構的化學物質(zhì)中以及各種生命終點[18-19]。Calabrese等[18]統(tǒng)計了1 450篇文獻中約5 600個劑量效應關系，建立了毒物刺激效應庫，發(fā)現(xiàn)在重金屬、抗生素、有機物等化學物質(zhì)中均存在這種刺激效應。關于毒物刺激效應機制也引起廣泛關注，在少有的相關研究報道中，普遍認為低濃度范圍內(nèi)自由基(活性氧)含量升高，可以激活蛋白酶，調(diào)節(jié)合成以及誘導基因表達等，進而導致細胞增殖，表現(xiàn)為生長刺激效應[20-21]。

4-硝基酚是一種重要的有機合成原料，還是醫(yī)藥工業(yè)和染料工業(yè)的重要中間體。酚類化合物對枯草芽孢桿菌[22]和大鼠肝細胞[23]的毒性研究比較發(fā)現(xiàn)：2,4-二氯酚>4-硝基酚>2-氯酚，本研究以小麥和大麥根伸長的IC50值為評價指標，測得3種化合物對2種作物的毒性大小順序同樣為：2,4-二氯酚>4-硝基酚>2-氯酚，與上述結論相符。

氯酚化合物是芳香族化合物中用途最廣、毒性較大、污染較嚴重的一類化合物，通常包括一個羥基和不同數(shù)目的氯原子取代苯環(huán)上的氫原子。有研究指出，氯酚的分子結構如氯化的程度以及氯原子和羥基基團的位置對毒性都有較大影響[24]。董克虞等[25]研究了氯代酚類污染物結構與冬小麥、蘿卜、油菜等作物毒性的關系，結果表明氯代酚毒性都大于苯酚，其毒性隨苯環(huán)上氫原子被氯取代個數(shù)的增加而增大，且取代個數(shù)相同時，不同取代部位的毒性不同，鄰位取代毒性最大，與本研究趨勢一致。

甲基酚化合物被廣泛用作染料、表面活性劑、殺蟲劑、農(nóng)藥、酚醛樹脂和黏合劑等。目前，國內(nèi)外已利用魚類、細菌和海藻等實驗生物[26-27]的不同指標，對不同的甲基酚類化合物進行了毒性實驗，然而涉及其植物毒性的研究較少。有研究采用月牙藻對苯酚、氯酚和甲基酚類化合物毒性進行分析，發(fā)現(xiàn)氯酚和甲基酚毒性均高于苯酚，且相同取代位置上氯酚毒性均高于甲基酚[26]，與本研究結論相符。劉征濤等[27]研究甲基酚類化合物對發(fā)光菌的毒性，結果表明甲基酚毒性排序為：2,4-二甲基酚>2,6-二甲基酚>2-甲基酚>3-甲基酚。本實驗反而是3-甲基酚高于2,4-二甲基酚，可能是因為采用不同生物，小麥及大麥對兩種化合物敏感程度和月牙藻不同。

間苯二酚與鄰苯二酚作為重要的精細化工中間體，被廣泛應用于塑料、農(nóng)藥、抗氧化劑、染料、涂料等精細化工產(chǎn)品的生產(chǎn)中。研究表明，間苯二酚對黃瓜的毒性比苯酚低[28]，本研究也得出相同結果。王洪斌等[29]研究間苯二酚對3種海洋微藻的毒性發(fā)現(xiàn)隨其濃度的升高對藻類的毒性增強，本實驗間苯二酚對小麥和大麥的毒性趨勢與之一致，且間苯二酚毒性高于鄰苯二酚。

壬基酚是非離子表面活性劑壬基酚聚氧乙烯醚的主要的生物代謝產(chǎn)物。目前，研究人員就壬基酚對魚類、藻類、哺乳動物的毒害作過大量的研究[30-31]，但有關其對陸生植物的毒性效應的研究相對很少。Domene等[32]以油菜和黑麥草的發(fā)芽率及生物量鮮重為評價指標，對壬基酚毒性進行分析，發(fā)現(xiàn)黑麥草的生物量鮮重對其毒性最敏感，IC50值為1 449.1 mg·kg-1。比本實驗小麥和大麥根伸長IC50值175.70 mg·kg-1和181.75 mg·kg-1高出8倍之多。

雙酚A作為環(huán)境激素類物質(zhì)，在眾多工業(yè)產(chǎn)品中被廣泛使用。有研究以大豆幼苗地上部各組織為評價指標對雙酚A毒性進行分析，發(fā)現(xiàn)其濃度為1.5 mg·L-1時，對各指標均有促進作用，在濃度為7.0～50 mg·L-1時，隨濃度升高，抑制作用增強[33]，與本實驗結果一致。

2-萘酚是一種典型的酚類化合物，主要用于有機合成原料及染料中間體，也是橡膠防老劑、選礦劑、殺菌劑、防霉劑、防腐劑、防治寄生蟲和驅(qū)蟲藥物等的原料。本研究獲得2-萘酚對小麥和大麥根伸長IC50值分別為63.59 mg·kg-1和139.71 mg·kg-1。有報道2-萘酚對黃瓜根伸長抑制的IC50值為69.2 mg·L-1[28]。

綜上所述，可以得到以下結論：(1)低濃度酚類物質(zhì)對小麥和大麥苗期生長影響不顯著甚至促進根伸長，高濃度酚類物質(zhì)對其生長存在抑制作用。(2)酚類化合物取代基的種類影響其對小麥和大麥的毒性，整體表現(xiàn)為：氯酚>甲基酚>苯酚>二元酚。氯酚對小麥和大麥的毒性隨其氯化程度的增加而增大。(3)小麥對3-甲基酚、雙酚A、2-萘酚和壬基酚4種化合物污染較敏感，而對于其他受試化合物則是大麥更敏感。

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Effect of Short-term Exposure of Phenols on Root Elongation of Wheat and Barley

Wang Shan1,2, Su Yuhong1,*, Qiao Min2

1. College of Chemistry and Chemical Engineering, Xinjiang University, Urumqi 830046, China 2. Research Center for Eco-environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China

7 March 2014 accepted 9 May 2014

To evaluate the toxic effects of 12 phenols, the root elongation of wheat and barley after exposure to different concentrations of phenols were investigated. Results showed that root elongation was significantly inhibited with the increasing of phenol concentration. The IC50(half maximal inhibitory concentration of root elongation) was used as an indicator. The IC50values ranged from 12.92 to 231.76 mg·kg-1for wheat and between 7.15 and 478.31 mg·kg-1for barley. For pyrocatechol, significant inhibition of root elongation for wheat was observed only under the highest concentration of 500 mg·kg-1. Wheat was relatively more sensitive to 3-cresol, bisphenol A, 2-naphthol and nonylphenol, while barley was more sensitive to other phenols. In general, the rank of phenols toxicity on wheat was similar to that of barley.

phenols; wheat; barley; root elongation; phytotoxicity

國家高技術研究發(fā)展計劃(863)項目(2012AA06302)；國家自然科學基金(21377154)

王珊(1989-)，女，碩士，研究方向為毒理學，E-mail: wangshan870325@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: yuhong_su2010@sina.com

10.7524/AJE.1673-5897.20140307001

2014-03-07 錄用日期：2014-05-09

1673-5897(2015)2-283-07

X171.5

A

蘇玉紅(1973-)，女，博士，教授，主要研究方向為有機污染物在植物體內(nèi)的遷移、轉(zhuǎn)化、過程及機制，發(fā)表學術論文40余篇。

王珊, 蘇玉紅, 喬敏. 酚類化合物短期暴露對小麥和大麥苗期根伸長的影響[J]. 生態(tài)毒理學報, 2015, 10(2): 283-289

Wang S, Su Y H, Qiao M. Effect of short-term exposure of phenols on root elongation of wheat and barley [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(2): 283-289 (in Chinese)