單側(cè)迷走神經(jīng)干刺激對心力衰竭犬心室肌自主神經(jīng)分布和功能失衡的改善研究

阿不都熱合曼·米吉提 戴曉燕 阿地力江·托合提

·論 著·

單側(cè)迷走神經(jīng)干刺激對心力衰竭犬心室肌自主神經(jīng)分布和功能失衡的改善研究

阿不都熱合曼·米吉提 戴曉燕 阿地力江·托合提

目的 探討單側(cè)迷走神經(jīng)干刺激增加迷走神經(jīng)活性，對心力衰竭（心衰）犬自主神經(jīng)分布和功能及心功能的影響。 方法 雜種犬18只，隨機分為假手術(shù)組、心衰組和迷走刺激組，每組6只。假手術(shù)組置入起搏器不行起搏，心衰組及迷走刺激組建立心衰模型，心衰組右心室置入起搏器行250次／min快速起搏37 d，迷走刺激組置入起搏器起搏30 d后給予右側(cè)迷走神經(jīng)干20 Hz刺激7 d。行超聲心動圖檢查平均動脈壓（MAP）和左室射血分數(shù)（LVEF），并行電生理儀監(jiān)測靜息心率（HR）變化。采用免疫組織化學法檢測酪氨酸羥化酶（TH）和乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶（ChAT）陽性纖維表達情況。

慢性心力衰竭；迷走神經(jīng)干刺激；酪氨酸羥化酶；乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶

慢性心力衰竭（心衰）是各種器質(zhì)性心臟病的主要并發(fā)癥，死亡率高，而室性心律失常致死占心衰總死亡數(shù)的40%～50%［1］。國內(nèi)外大量研究顯示：自主神經(jīng)功能失衡在心衰的發(fā)病中占有重要地位，與心衰時心律失常、心室重構(gòu)及猝死密切相關(guān)［2］。已有大量基礎(chǔ)研究和臨床證據(jù)表明迷走神經(jīng)活性與心衰的結(jié)局之間存在相關(guān)性，但利用其活性治療心衰的研究尚處于初始階段［3?5］。2個潛在的治療方向己經(jīng)被發(fā)現(xiàn)：一是使用慢性電刺激迷走神經(jīng)，另一個是使用苯并噻氮類藥物（鈣離子拮抗劑）。本研究在快速起搏犬右心室誘發(fā)心衰模型的基礎(chǔ)上，探討刺激單側(cè)迷走神經(jīng)逆轉(zhuǎn)心衰犬心室肌自主神經(jīng)重構(gòu)的機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 成年健康雜種犬18只，雌雄不限，體質(zhì)量（18.00±2.66）kg，由新疆醫(yī)科大學動物中心提供，動物質(zhì)量屬于一級標準。隨機分為假手術(shù)組：雌性2只，雄性4只，平均體質(zhì)量（18.29±3.54）kg；心衰組：雌性3只，雄性3只，平均體質(zhì)量（18.09±2.14）kg；心衰＋迷走神經(jīng)刺激組（迷走刺激組）：雌性2只，雄性4只，平均體質(zhì)量（17.85±2.86）kg。假手術(shù)組分離右側(cè)頸外靜脈和迷走神經(jīng)干，置入起搏器不行起搏刺激；心衰組給予起搏器刺激30 d后，分離迷走神經(jīng)干后繼續(xù)起搏7 d；迷走刺激組給予起搏器刺激30 d后，分離迷走神經(jīng)干置入電極刺激神經(jīng)同時繼續(xù)起搏7 d。實驗設計及實施均經(jīng)武漢大學人民醫(yī)院動物倫理委員會審核批準。

1.2 雜種犬慢性心衰模型制作［6］3%戊巴比妥鈉按

30 mg／kg靜脈注射麻醉犬，術(shù)中4 mg／次靜脈注射維持。建立氣管插管。犬右側(cè)頸部去毛，常規(guī)消毒鋪巾，在右頸部做一5 cm切口，分離出右側(cè)頸外靜脈，仔細剝離靜脈鞘后結(jié)扎遠心端，用眼科剪剪開靜脈直徑的1／4～1／3，靜脈提鉤提起靜脈壁時將電極頭小心送入靜脈，將起搏電極沿靜脈系統(tǒng)送入右心室尖，LEAD2000心內(nèi)電生理儀（錦江電子）顯示aVR導聯(lián)呈大R波。連接并開啟起搏器（250次／min），縫合皮膚，打開起搏器開關(guān)實行起搏心律。術(shù)中及術(shù)后3 d均給予160萬U青霉素2次／d肌肉注射，預防切口及囊袋感染。30 d后，犬出現(xiàn)不同程度的食欲下降、活動減少、呼吸加快等心衰癥狀，平均動脈壓（mean artery pressure，MAP）＜60 mmHg，左室射血分數(shù)（LVEF）＜50%證實心衰模型建立成功。犬在起搏器關(guān)閉和麻醉狀態(tài)下，完成右側(cè)迷走神經(jīng)刺激器安裝后更換起搏器，以190次／min起搏頻率維持心衰7 d。

1.3 迷走神經(jīng)刺激方法 分離右側(cè)頸部迷走神經(jīng)，植入迷走神經(jīng)刺激電極，電極的另一側(cè)連接神經(jīng)刺激器。刺激參數(shù)為：電壓4～8 V、脈寬1 ms、頻率20 Hz。刺激時心率降低＞30%為刺激有效，刺激效果不達標時調(diào)整刺激電壓、頻率和刺激部位。置入神經(jīng)刺激儀調(diào)試后縫合切口，持續(xù)刺激7 d。

1.4 心臟超聲檢查 采用DESAOTE超聲儀和10 S探頭，頻率10 MHz，掃查深度5 cm，檢查前關(guān)閉起搏器。測量LVEF、MAP，并行電生理儀監(jiān)測靜息心率（heart rate，HR）變化。

1.5 酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）和乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶（cholineacetyl?transferase，ChAT）免疫組化檢測 各實驗組于在體實驗結(jié)束后取左心室前壁組織進行石蠟包埋，切片。采用SP免疫染色法染色。陰性對照以PBS代替一抗，應用計算機輔助圖像分析系統(tǒng)（motic images 3000）計算神經(jīng)密度。TH和ChAT著色表現(xiàn)為胞漿染成棕黃色為陽性結(jié)果。依顯色程度分為：陰性無顯色，淺棕黃色為陽性，棕褐色為強陽性。神經(jīng)密度以神經(jīng)纖維面積與總檢測面積比值表示（μm2／mm2），切片全部面積被分割成連續(xù)的1024 μm2×768 mm2大小的獨立視野，所有視野神經(jīng)密度的平均值為該切片平均神經(jīng)密度，每個切片中選擇5個神經(jīng)密度最大和5個神經(jīng)密度最小的視野，神經(jīng)密度均值之差為局部神經(jīng)分布的不均一性。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（ˉx±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 快速起搏心室誘發(fā)心衰模型完成情況 快速右心室起搏30 d后，心衰組和迷走刺激組MAP＜60 mm?Hg，LVEF＜50%，結(jié)合犬呼吸加快，心率加速，食欲下降等癥狀，心衰模型建立成功。

2.2 3組MAP、LVEF和HR比較 基礎(chǔ)狀態(tài)各組MAP、LVEF和HR比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。實驗30 d后，心衰組和迷走刺激組MAP和LVEF值比假手術(shù)組減小，HR比假手術(shù)組增快，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。心衰組MAP、LVEF和HR與迷走刺激組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。實驗37 d后，心衰組MAP和LVEF值比假手術(shù)組和迷走刺激組顯著減小，HR比假手術(shù)組和迷走刺激組顯著增快，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），迷走刺激組MAP、LVEF和HR與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 3組犬MAP、HR及LVEF比較（ˉx±s，n＝6）

2.3 實驗37 d各組犬心室肌神經(jīng)分布不均一性比較

與假手術(shù)組比較，心衰組TH和ChAT陽性神經(jīng)密度不均一明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），迷走刺激組TH和ChAT陽性神經(jīng)密度不均一未見明顯改變，差異無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。假手術(shù)組TH和ChAT神經(jīng)纖維特染棕色條索狀陽性染色表達；心衰組TH棕色和ChAT淺棕色條索狀蛋白表達減少；迷走刺激組可見淺棕色條索狀TH表達和大量深棕色條索狀ChAT陽性染色表達。見表2和圖1，2。

表2 實驗37 d后各組犬心室自主神經(jīng)分布不均一性（ˉx±s，μm2／mm2，n＝6）

3 討論

圖1 實驗37 d各組犬左心室前壁TH陽性神經(jīng)纖維表達（×400）

圖2 實驗37 d各組犬左心室前壁ChAT陽性神經(jīng)纖維表達（×400）

目前慢性心衰動物模型的制作方法較多，有壓力或者容量負荷誘導心衰模型、缺血性心肌病模型、心臟快速起搏心衰模型、藥物誘導的心肌病模型、心肌肥厚和心衰轉(zhuǎn)基因動物模型等［7］。心衰動物模型的建立對研究心衰的發(fā)病機制、病理生理及疾病預防和治療起重要作用。長期快速右心室起搏（＞200次／min）導致的心衰模型酷似擴張性心肌病，本研究此種模型的優(yōu)點是制作模型的方法較簡單并且創(chuàng)傷小，起搏誘導的心衰血流動力學，神經(jīng)內(nèi)分泌水平與人的心衰相似，可以用來研究慢性心衰不同階段的病理生理和分子生物學特征。本實驗結(jié)果顯示，快速右心室起搏30 d后，心衰組和迷走刺激組犬MAP＜60 mmHg，LVEF＜50%，心衰犬模型建立成功，并且心衰組30 d和37 d時MAP和LVEF值比假手術(shù)組持續(xù)減小，提示心衰的嚴重程度隨起搏時間延長呈逐步進展的趨勢。實驗37 d時，迷走刺激組MAP和LVEF值比心衰組增加，與假手術(shù)組比較，差異無統(tǒng)計學意義，提示迷走神經(jīng)干刺激可以改善心衰心功能和血流動力學。

臨床上評價心衰患者迷走神經(jīng)活性是很困難的，目前僅能通過觀察HR加快，心率變異性降低尤其是高頻成分降低，或者低頻高頻降低間接實現(xiàn)［8］。HR可以反映迷走神經(jīng)功能，粗略評估自主神經(jīng)平衡。大規(guī)模臨床實驗表明，靜息HR＞90次／min比HR＜60次／min人群的心血管死亡率高2倍［9］。本研究顯示，實驗30 d時心衰組HR比假手術(shù)組明顯增加。實驗結(jié)果提示，心衰后自主神經(jīng)功能失衡，迷走神經(jīng)功能下降，導致HR增加。

在收縮性心衰時，神經(jīng)和體液系統(tǒng)均被激活，以維持心功能。已有較充分的證據(jù)顯示，心衰患者的迷走神經(jīng)調(diào)控亦出現(xiàn)異常。目前，已有多種藥物對心衰患者交感神經(jīng)的過度激活有抑制作用，如β受體阻滯劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑等。但迷走神經(jīng)調(diào)節(jié)異常的改善尚無有效藥物，因此，本研究將研究方向轉(zhuǎn)向了迷走神經(jīng)調(diào)節(jié)的器械治療。本研究結(jié)果顯示，心衰是與迷走神經(jīng)活動減弱密切相關(guān)的。迷走神經(jīng)刺激可能會成為另一種有效治療心衰的方法。有研究表示超過3月的迷走神經(jīng)刺激可以顯著減少心室體積，增加心室射血分數(shù)［10］。有研究利用迷走神經(jīng)刺激器，對32例心衰患者進行長期刺激后發(fā)現(xiàn)：大多數(shù)患者的NYHA心功能分級至少提高一個級別，HR明顯下降，且隨時間延長而易于維持，生活質(zhì)量、6 min步行距離和心臟彩超指標明顯好轉(zhuǎn)［11］。本研究證實，心衰組犬出現(xiàn)自主神經(jīng)分布的不均一性，心衰組TH和ChAT陽性神經(jīng)密度不均一均明顯增加，TH纖維蛋白表達增加和ChAT纖維蛋白表達下降；經(jīng)迷走神經(jīng)干刺激后，心室肌自主神經(jīng)分布的失衡改善，ChAT纖維蛋白表達增加，同時血流動力學指標，射血分數(shù)及HR均恢復。本研究結(jié)果提示，慢性迷走神經(jīng)刺激可以作為臨床潛在的逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)的治療方向，并為迷走神經(jīng)刺激作為治療心衰的臨床前期基礎(chǔ)研究提供理論依據(jù)。

［1］ Hunt SA，Abraham WT，Chin MH，et al.2009 focused up?date incorporated into the ACC／AHA guidelines for the diag?nosis and management of heart failure in adults：a report of the American college of cardiology foundation／American heart association task force on practice guidelines.Developed in collaboration with the international society for heart and lung transplantation［J］.J Am Coll Cardiol，2009，53（15）：e1?e90.

［2］ Ogawa M，Zhou S，Tan AY，et al.Left stellate ganglion and vagal nerve activity and cardiac arrhythmias in ambulatory dogs with pacing?induced congestive heart failure［J］.J Am Coll Cardiol，2007，50（4）：335?343.

［3］ La Rovere MT，Pinna GD，Maestri R，et al.Prognostic im?plications of baroreflex sensitivity in heart failure patients in the beta?blocking era［J］.J Am Coll Cardiol，2009，53（2）：193.

［4］ Dunlap ME，Bibevski S，Rosenberry TL，et al.Mechanisms of altered vagal control in heart failure：influence of musca?rinic receptors and acetylcholinesterase activity［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2003，285（4）：H1632?H1640.

［5］ 孫艷俠，王國干.心力衰竭動物模型研究進展［J］.中國比較醫(yī)學雜志，2011，21（7）：73?78.

［6］ 惠杰，沈振亞，焦鵬，等.快速右室起搏建立動物心力衰竭模型［J］.中國心臟起搏與心電生理雜志，2004，18（6）：470?472.

［7］ 季萌，周祁娜，侯月梅.心力衰竭中迷走神經(jīng)活性變化的研究進展［J］.中國心臟起搏與心電生理雜志，2012，26（6）：547?549.

［8］ Thayer JF，Lane RD.The role of vagal function in the risk for cardiovascular disease and mortality［J］.Biol Psychol，2007，74（2）：224?242.

［9］ Zhang Y，Popovic ZB，Bibevski S，et al.Chronic vagus nerve stimulation improves autonomic control and attenuates systemic inflammation and heart failure progression in a canine high?rate pacing model［J］.Circ Heart Fail，2009，2（6）：692.

［10］De Ferrari GM，Schwartz PJ.Vagus nerve stimulation：from pre?clinical to clinicalapplication：challenges and future di?rections［J］.Heart Fail Rev，2011，16（2）：195?203.

［11］Dibner?Dunlap ME，Thames MD.Baroreflex control of renal sympathetic nerveactivity is preserved in heart failure despite reduced arterial baroreceptor sensitivity［J］.Circ Res，1989，65（6）：1526?1535.

Effects of unilateral vagus nerve stimulation on the improvement of ventricular autonomic nerve distribution and functional imbalance in canine with heart failure

Objective To investigate the effects of unilateral vagus nerve stimulation on vagal activity，autonomic nerve distri?bution and function and cardiac function in canine with heart failure. Methods Eighteen dogs were randomly divided into sham op?eration group，heart failure group and vagal stimulation group，with 6 dogs in each group.Sham operation group received pacemaker implantation but no pacing；Heart failure group were implanted pacemaker at right ventricular and received 250 times／min pacing for 37 d to establish CHF model；Vagal stimulation group were implanted pacemaker and received 250 times／min pacing for 30 d，then the right vagus nerve was stimulated for 7 d（frequency：20 Hz）.Left ventricular ejection fraction（LVEF）and mean arterial pressure（MAP）were examined with ultrasonic apparatus.Resting heart rate（HR）was recorded with electrocardiogram monitor.The expres?sion of tyrosine hydroxylase（TH）and cholineacetyl?transferase（ChAT）protein were detected by immuno?histochemistry. Results After 30 d of right ventricular rapid pacing，MAP＜60 mmHg，and LVEF＜50%were defined as successful heart failure model.After 30 d，compared to sham operation group，MAP and LVEF decreased and resting HR increased significantly in heart failure group and vagal stimulation group（P＜0.05）.After 37 d，compared with the sham operation group and vagal stimulation group，MAP and LVEF was significantly reduced and resting HR significantly increased（P＜0.05）.TH and ChAT positive nerve density heterogeneity statisti?cally increased in heart failure group（P＜0.05）.The muscle fibers with positive expression of TH were increased and the muscle fi?bers with positive expression of ChAT were decreased in heart failure group.While the mucle fibers with postive TH expression or ChA T expression were increased in vagal stimutation group. Conclusions The unilateral vagus nerve stimulation increases vagus nerve activity，slows HR，recovers autonomic nerve homogeneous and function imbalance，improves heart function in heart failure canines.

chronic heart failure；vagus nerve stimula?tion；tyrosine hydroxylase；acetylcholine transferase

R 541.6

A

10.3969／j.issn.1003?9198.2015.04.006 Abudureheman·Mijiti．Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，China；DAI Xiao?yan，Adilijiang·Tuoheti．Department of Cardiology，Xinjiang Uygur Autonomous Region People's Hospital，Urumqi 830011，China

2014?05?05）

830054新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市，新疆醫(yī)科大學（阿不都熱合曼·米吉提），830011新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市，新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院（戴曉燕，阿地力江·托合提）

戴曉燕，Email：1961459521＠qq.com

結(jié)果 行犬右心室快速起搏30 d后，MAP＜60 mmHg，LVEF＜50%，心衰模型成功建立。實驗30 d后，心衰組和迷走刺激組MAP和LVEF值比假手術(shù)組減小，HR比假手術(shù)組增快，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。實驗37 d后，與假手術(shù)組和迷走刺激組比較，心衰組MAP和LVEF值顯著減小，HR顯著增快，TH和ChAT陽性神經(jīng)密度不均一明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。心衰組TH棕色條索狀陽性纖維表達增加，ChAT淺棕色條索狀陽性纖維表達減少；迷走刺激組可見淺棕色條索狀TH表達和大量深棕色條索狀ChAT陽性纖維表達。 結(jié)論 單側(cè)迷走神經(jīng)干刺激能增加心衰犬迷走神經(jīng)活性，減慢心率，恢復自主神經(jīng)不均一性分布和功能失衡，改善心功能。