CYP2C9及VKORC1基因多態(tài)性對(duì)華法林穩(wěn)態(tài)劑量和模型預(yù)測(cè)劑量的相關(guān)性研究＊

陳曉英，彭 齊，胡大清，何 蕾

武漢亞洲心臟病醫(yī)院心外科，武漢 430022

CYP2C9及VKORC1基因多態(tài)性對(duì)華法林穩(wěn)態(tài)劑量和模型預(yù)測(cè)劑量的相關(guān)性研究＊

陳曉英，彭 齊△，胡大清，何 蕾

武漢亞洲心臟病醫(yī)院心外科，武漢 430022

目的 研究湖北地區(qū)漢族人性別、年齡、身高、體重、細(xì)胞色素P450酶2C9基因（CYP2C9）和維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合體亞單位1（VKORC1）基因型與華法林穩(wěn)態(tài)劑量及計(jì)算機(jī)模型預(yù)測(cè)劑量的相關(guān)性。方法 收集湖北地區(qū)漢族人群臨床使用華法林的患者，采用聚合酶鏈反應(yīng)－限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR－RFLP）技術(shù)檢測(cè)CYP2C9和VKORC1基因型，同時(shí)記錄患者的年齡、性別、體重、身高、國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值（INR）、華法林穩(wěn)態(tài)劑量和計(jì)算機(jī)模型預(yù)測(cè)劑量等臨床資料，并對(duì)這些臨床資料進(jìn)行相關(guān)分析及多元回歸分析。結(jié)果 435例患者的CYP2C9基因型檢測(cè)顯示402例為＊1／＊1型（92.41%）、30例為＊1／＊3型（6.90%）、3例＊3／＊3型（0.69%）。前兩型患者華法林劑量分別為（2.91 ±1.12）mg／d、（1.91±0.85）mg／d，＊1／＊3型較＊1／＊1型華法林需求量少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（CYP2C9基因型＊3／＊3型樣本量太少，未參與組間比較）；VKORC1基因型檢測(cè)顯示354例為AA型（81.4%）、77例為雜合子GA型（17.7%）、4例為純合子GG型（0.9%）。患者華法林劑量分別為（2.58±0.94）mg／d、（3.82±1.52）mg／d、（5.62± 1.77）mg／d，AA型較GA型華法林需求量少，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（VKORC1基因型GG型樣本量太少，未參與組間比較）。同時(shí)對(duì)患者的年齡、身高、體重、兩種基因型、穩(wěn)態(tài)劑量以及計(jì)算機(jī)模型預(yù)測(cè)劑量均分別行相關(guān)分析及多元回歸分析，提示華法林劑量與患者的年齡、身高、體重及不同的基因型均有關(guān)，且相關(guān)分析提示計(jì)算機(jī)模型預(yù)測(cè)劑量與穩(wěn)態(tài)劑量的相關(guān)系數(shù)為0.611，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；行穩(wěn)態(tài)劑量的多元回歸分析顯示CYP2C9、VKORC1基因型、年齡、體重與穩(wěn)態(tài)劑量相關(guān)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 在湖北地區(qū)漢族人群中，存在CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性，且不同基因型患者間華法林用量存在差異，同時(shí)華法林劑量與年齡、體重及不同的基因型有關(guān)，計(jì)算機(jī)模型預(yù)測(cè)劑量與穩(wěn)態(tài)劑量存在相關(guān)性且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

華法林； 劑量； 基因多態(tài)性； CYP2C9； VKORC1

為防止心臟瓣膜置換手術(shù)后血栓形成或栓塞發(fā)生需口服華法林抗凝治療［12］，但口服華法林抗凝需要監(jiān)測(cè)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值（INR），由于個(gè)體間細(xì)胞色素P450酶2C9基因（CYP2C9）和維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合體亞單位1基因（VKORC1）多態(tài)性的存在［12］，使華法林劑量個(gè)體差異明顯，要達(dá)到相同的抗凝效果，劑量差別極大［2］，即使INR值在目標(biāo)范圍內(nèi)仍有部分患者出現(xiàn)出血并發(fā)癥。目前新型的、抗凝作用肯定、劑量固定、無需監(jiān)測(cè)凝血指標(biāo)的口服抗凝劑達(dá)比加群酯在非瓣膜病心房顫動(dòng)患者的抗凝治療中逐漸被認(rèn)可［34］。但在心臟機(jī)械瓣膜置換術(shù)后患者中的應(yīng)用尚未見研究報(bào)道，因此，目前口服華法林仍然是心臟瓣膜置換術(shù)后抗凝的標(biāo)準(zhǔn)治療。本文旨在研究湖北地區(qū)漢族人群中CYP2C9和VKORC1的基因多態(tài)性、患者的臨床特征和不同的基因型對(duì)華法林劑量的影響及華法林穩(wěn)態(tài)劑量與模型預(yù)測(cè)劑量的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2012年3月至2013年6月在武漢亞洲心臟病醫(yī)院心外科行心臟瓣膜置換術(shù)患者435例。入選標(biāo)準(zhǔn):湖北省內(nèi)18歲以上漢族人（相互間無血緣關(guān)系及異族通婚史）、術(shù)后口服華法林抗凝、INR控制在2.0～3.0之間。剔除標(biāo)準(zhǔn):肝、腎及甲狀腺功能異常；服用利福平及巴比妥等影響華法林藥動(dòng)學(xué)效果的藥物；服用阿司匹林、氯吡格雷、肝素及維生素K等影響INR的藥物。

1.2 研究方法

1.2.1 資料采集收集 取入選受試者的靜脈血（枸櫞酸鈉抗凝）3mL用于檢測(cè)INR值、CYP2C9以及VKORC1基因型。同時(shí)記錄患者的年齡、性別、體重、身高、INR、華法林穩(wěn)態(tài)劑量和計(jì)算機(jī)模型預(yù)測(cè)劑量等臨床資料。

1.2.2 方法 從血液中提取患者DNA，擴(kuò)增目的片段，再進(jìn)行測(cè)序。DNA提取采用TIANGEN血液基因組提取試劑盒，測(cè)序儀為美國(guó)ABI 3500Genetic Analyzer。采用國(guó)際華法林藥理學(xué)聯(lián)盟（IWPC:International Warfarin Pharmacogenetics Consortium）建立的華法林劑量預(yù)測(cè)模型來預(yù)測(cè)華法林劑量，該模型是聯(lián)合9個(gè)國(guó)家的21個(gè)研究小組，收集了用華法林治療的超過4 000例患者（亞洲人種1 200余例）的臨床和遺傳學(xué)數(shù)據(jù)而建立，模型中納入了遺傳因素以及臨床因素。這個(gè)模型是目前最權(quán)威的兩個(gè)華法林劑量預(yù)測(cè)模型之一［5］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，Pearsonχ2檢驗(yàn)用于檢查基因型頻率是否符合Hardy－Weinberg遺傳平衡定律。分析華法林劑量與年齡、身高、體重以及INR值的關(guān)系及CYP2C9、VKORC1基因型之間華法林劑量的比較使用兩樣本t檢驗(yàn)。多元線性回歸用于分析華法林劑量與各變量之間的關(guān)系。采用雙側(cè)檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同基因型患者的臨床資料及穩(wěn)態(tài)劑量的比較

435例患者的CYP2C9基因型檢測(cè)顯示402例為＊1／＊1型（92.41%）、30例為＊1／＊3型（6.90%）、3例＊3／＊3型（0.69%）?；颊呷A法林劑量分別為（2.91±1.12）mg／d、（1.91±0.85）mg／d，＊1／＊3型較＊1／＊1型華法林需求量少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（表1，CYP2C9基因型＊3／＊3型樣本量太少，未參與組間比較）；VKORC1基因型檢測(cè)顯示354例為AA型（81.4%）、77例為雜合子GA型（17.7%）、4例為純合子GG型（0.9%）?；颊呷A法林劑量分別為（2.58±0.94）mg／d、（3.82± 1.52）mg／d、（5.62±1.77）mg／d，AA型較GA型華法林需求量少，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（表1，VKORC1基因型GG型樣本量太少，未參與組間比較）。

2.2 患者穩(wěn)態(tài)劑量的相關(guān)因素分析

分別對(duì)年齡、性別、身高、體重、兩種基因型與穩(wěn)態(tài)劑量進(jìn)行直線相關(guān)分析，顯示華法林劑量與患者的年齡、身高、體重及VKORC1與CYP2C9基因型有關(guān)（其相關(guān)系數(shù)分別為－0.266，0.232，0.228，0.450，－0.227），且相關(guān)分析同時(shí)提示模型預(yù)測(cè)劑量與穩(wěn)態(tài)劑量的相關(guān)系數(shù)為0.611，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同時(shí)納入患者年齡、身高、體重、2種基因型，行穩(wěn)態(tài)劑量的多元回歸分析顯示CYP2C9、 VKORC1基因型、年齡、體重有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

表1 CYP2C9與VKORC1基因型患者的臨床資料及穩(wěn)態(tài)劑量的比較（）Table1 Comparison of clinical data and stable warfarin dose between patients with different CYP2C9and VKORC1genotypes

表1 CYP2C9與VKORC1基因型患者的臨床資料及穩(wěn)態(tài)劑量的比較（）Table1 Comparison of clinical data and stable warfarin dose between patients with different CYP2C9and VKORC1genotypes

與＊1／＊1比較，△△P＜0.01；與AA比較，＃＃P＜0.01

?

表2 患者穩(wěn)態(tài)劑量多元回歸分析Table2 Multivariate regression analysis on the factors related to stable warfarin dose in patients

3 討論

口服華法林抗凝臨床適用范圍廣，目前主要用于瓣膜病合并房顫或者瓣膜置換手術(shù)后患者、深靜脈血栓形成患者、肺栓塞患者、腦梗死患者、房顫患者、心肌梗死后心尖部血栓形成患者等。但其劑量在不同種族間及個(gè)體間存在較大差異，影響華法林劑量的因素中，個(gè)體因素包括種族、遺傳、性別、年齡、身高、體重等；臨床因素主要表現(xiàn)在藥物間相互作用，例如:胺碘酮、利福平及巴比妥等藥物影響華法林藥代動(dòng)力學(xué)；阿司匹林、氯吡格雷、肝素及維生素K等藥物影響凝血功能［6］。其中遺傳因素可解釋約40%～74%的個(gè)體劑量差異［7］。目前研究發(fā)現(xiàn)，VKORC1和CYP2C9基因與華法林藥效學(xué)和藥代學(xué)相關(guān)。在藥效學(xué)方面，VKORC1基因啟動(dòng)子區(qū)－1 639位基因G突變?yōu)锳后轉(zhuǎn)錄活性下降，其基因多態(tài)性影響華法林臨床用藥劑量；在藥代學(xué)方面，CYP2C9是CYP2C亞家族中的一種同功酶，也是許多藥物的重要代謝酶，約占肝微粒體中CYP總量的20%，其基因多態(tài)性會(huì)影響代謝酶活性，特別是存在基因突變的個(gè)體藥物不良反應(yīng)的發(fā)生率更高［8－9］。

本研究探討了湖北地區(qū)漢族人群中CYP2C9和VKORC1的基因多態(tài)性、患者的臨床特征和不同的基因型對(duì)華法林劑量的影響及華法林穩(wěn)態(tài)劑量與模型預(yù)測(cè)劑量的相關(guān)性。

本研究選取2012年3月至2013年6月在我院心外科行心臟機(jī)械瓣膜置換術(shù)的湖北地區(qū)漢族患者435例，CYP2C9基因型檢測(cè)顯示402例為＊1／＊1型、30例為＊1／＊3型、3例＊3／＊3型，以等位基因A為主，其基因型頻率分別為92.41%、6.90%、0.69%，與文獻(xiàn)報(bào)道的國(guó)人的基因型頻率一致［1011］。Aquilante等［12］的研究提示在西方人群中CYP2C9的等位基因同樣是以A為主（其基因型頻率為79.80%～95.30%），說明其等位基因分布未顯示存在人種差異。本研究中VKORC1基因型檢測(cè)354例為AA型、77例為雜合子GA型、4例為純合子GG型，以AA型居多，其基因型頻率分別為81.4%、17.7%、0.9%，與文獻(xiàn)報(bào)道的國(guó)人的基因型頻率一致［1011］。同時(shí)有文獻(xiàn)報(bào)道，在高加索人和非洲裔美國(guó)人中VKORC1基因以GG、GA型占大多數(shù)（GG型的基因型頻率為38.44%～79.57%，GA型的基因型頻率為19.27%～47.12%）［13］，提示在不同種族間VKORC1基因多態(tài)性分布存在人種差異。

在湖北地區(qū)漢族人群中，存在CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性，且本研究同樣提示CYP2C9和VKORC1的基因多態(tài)性是造成個(gè)體間華法林穩(wěn)態(tài)劑量差異的主要原因［1112］。具體表現(xiàn)為CYP2C9＊1／＊3型較＊1／＊1型華法林需求量少，這與突變型的CYP2C9＊1／＊3型比野生型＊1／＊1型對(duì)華法林的代謝能力下降有關(guān)［12］。VKORC1基因位于16號(hào)染色體，含3個(gè)外顯子，編碼163個(gè)氨基酸的18kD內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白，此蛋白質(zhì)主導(dǎo)維生素K依賴性凝血因子的生成，是華法林的作用靶點(diǎn)。VKORC1基因啟動(dòng)子區(qū)－1 639G＞A多態(tài)性與華法林臨床用藥劑量相關(guān)，AA基因型華法林需求較GA型和GG型低［13］。

影響華法林劑量的因素主要有遺傳因素以及身高、體重、年齡、性別、種族、藥物相互作用等［14］。本研究中，對(duì)患者的年齡、身高、體重、兩種基因型、穩(wěn)態(tài)劑量以及計(jì)算機(jī)模型預(yù)測(cè)劑量均分別行相關(guān)分析，結(jié)果提示華法林劑量與患者的年齡、身高、體重及不同的基因型均有關(guān)，行多元回歸分析顯示穩(wěn)態(tài)劑量與CYP2C9、VKORC1基因型、年齡、體重均有關(guān)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究中性別未顯示出相關(guān)性，可能與樣本量有關(guān)，我們將在以后的研究中進(jìn)一步關(guān)注此問題。

我們采用的預(yù)測(cè)模型中納入了遺傳因素以及臨床因素。其計(jì)算機(jī)模型中包含患者年齡、身高、體重、不同類型的CYP2C9和VKORC1基因型（包括未知基因型）、不同人種、酶誘導(dǎo)劑狀況和胺碘酮用藥狀況等因素，能夠準(zhǔn)確地估計(jì)華法林的劑量。本研究相關(guān)分析提示此計(jì)算機(jī)模型預(yù)測(cè)劑量與實(shí)際穩(wěn)態(tài)劑量的相關(guān)系數(shù)為0.611，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明該模型應(yīng)用于湖北地區(qū)漢族人群的華法林劑量預(yù)測(cè)是準(zhǔn)確可行的，可以降低治療引導(dǎo)階段華法林過量的風(fēng)險(xiǎn)，并縮短華法林達(dá)到穩(wěn)定治療的時(shí)間。

華法林的應(yīng)用范圍不只限于心臟瓣膜置換術(shù)后，在肺栓塞、持續(xù)性心房顫動(dòng)及反復(fù)靜脈血栓形成、心肌梗死后心尖部血栓形成的患者中亦需要口服華法林抗凝，同時(shí)需要控制INR在目標(biāo)范圍，而反復(fù)的抽血檢測(cè)及調(diào)整亦帶來諸多不便。我院目前對(duì)臨床需要口服華法林的患者進(jìn)行基因型檢測(cè)，通過基因分型及計(jì)算機(jī)劑量模型預(yù)測(cè)華法林劑量，以指導(dǎo)臨床選擇合適的華法林劑量并盡量縮短藥物劑量的調(diào)整周期，希望能藉此減少對(duì)患者反復(fù)抽血檢測(cè)以及降低患者血栓和出血的風(fēng)險(xiǎn)。

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（2014－10－10 收稿）

Correlation of CYP2C9 and VKORC1 Polymorphisms with Warfarin Stable Dose and Computer Model－predicted Dose

Chen Xiaoying，Peng Qi△，Hu Daqing et al
Department of Cardiac Surgery，Wuhan Asia Heart Hospital，Wuhan 430022，China

Objective To investigate the association of gender，age，height，body weight，cytochrome P450 2C9（CYP2C9）and vitamin K epoxide reductase complex 1（VKORC1）genotypes with warfarin stable dose and computer model－predicted dose in Han population in Hubei province of China.Methods CYP2C9and VKORC1genotypes were determined by polymerase chain reaction－restriction fragment length polymorphism（PCR－RFLP）technique in patients who were Han Chinese and administered with stable warfarin dose.Their clinical data including age，gender，body weight，height，international normalised ratio（INR），warfarin stable dose and computer model－predicted dose were recorded and analyzed by correlation analysis and multivariate regression analysis.Results CYP2C9genotyping showed that there were 402cases of＊1／＊1type，30of＊1／＊3type and 3of＊3／＊3type.The required warfarin dose was much lower in patients with CYP2C9＊1／＊3type than those with＊1／＊1type［（1.91±0.85）mg／d vs.（2.91±1.12）mg／d］with significant difference found（P＜0.01）.Comparison between groups didn＇t include patients with＊3／＊3type due to the limited samples.VKORC1genotyping showed that the frequencies of AA，GA，GG were 81.4%（354／435），17.7%（77／435）and 0.9%（4／435），respectively.The required warfarin dose in VKORC1 AA patients was significantly lower than that in GA patients［（2.58±0.94）mg／d vs.（3.82±1.52）mg／d］，with statistically significant difference found（P＜0.01）.VKORC1GG patients［warfarin dose:（5.62±1.77）mg／d］failed to enter the statistical analysis because of less sample size.Correlation analysis and multivariate regression analysis showed that age，body weight，CYP2C9and VKORC1genotypes were related to warfarin dose.The correlation coefficient of warfarin stable dose and predicteddose was 0.611，and these was statistically significant difference（P＜0.01）.Multivariate regression analysis showed that there was statistical association between the warfarin stable dose and CYP2C9genotype，VKORC1genotype，age or body weight.Conclusion There are CYP2C9and VKORC1polymorphisms in Han Chinese in Hubei province.There is a significant difference in daily mean warfarin dose between patients with different genotypes of CYP2C9and VKORC1.The warfarin dose is related to age，body weight，CYP2C9and VKORC1genotypes.There is a statistical correlation between warfarin stable dose and computer model－predicted dose.

warfarin； dosing regimen； gene polymorphism； CYP2C9； VKORC1

R969

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.01.018

＊武漢市衛(wèi)計(jì)委臨床醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目（No.WX13B28）

陳曉英，女，1975年生，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，E－mail:908230364＠qq.com△

，Corresponding author，E－mail:pq＿0511＠163.com