絡(luò)合銅宮內(nèi)節(jié)育器對大鼠子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)的影響＊

彭祥熾，楊瑞峰，孟天慶，劉 燕，胡珊珊，索進平，熊承良△

1華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院計劃生育研究所，武漢 430030

2華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院生殖醫(yī)學(xué)中心，武漢 430022

3華中科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，武漢 430074

絡(luò)合銅宮內(nèi)節(jié)育器對大鼠子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)的影響＊

彭祥熾1，2，楊瑞峰2，孟天慶2，劉 燕2，胡珊珊1，索進平3，熊承良1，2△

1華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院計劃生育研究所，武漢 430030

2華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院生殖醫(yī)學(xué)中心，武漢 430022

3華中科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，武漢 430074

目的 研究絡(luò)合銅生物高分子復(fù)合材料宮內(nèi)節(jié)育器（CuCl2／SiO2／PVA IUD）對大鼠子宮內(nèi)膜及重要臟器的形態(tài)學(xué)影響，以初步探討絡(luò)合銅宮內(nèi)節(jié)育器的安全性。方法 50只性成熟SPF級雌性SD大鼠，10～12周齡，隨機分為5組，每組10只:金屬裸銅組（Cu組）、生物基體材料組（SiO2／PVA組）、絡(luò)合銅低劑量組［CuCl2／SiO2／PVAⅠ，Cu2＋釋放率為5～10μg／（220mm2·d）］、絡(luò)合銅高劑量組［CuCl2／SiO2／PVAⅡ，Cu2＋釋放率為10～20μg／（220mm2·d）］和空白對照組（NC組）。在大鼠左側(cè)子宮近陰道段作一切口，朝卵巢方向置入不同材料，分別于置器30d和60d后取置器側(cè)子宮內(nèi)膜、卵巢及心、肝、脾、肺、腎組織，采用蘇木精－伊紅染色在光鏡下觀察其組織病理的形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果 各組大鼠心、肝、脾、肺、腎、子宮及卵巢組織的大體觀察均正常；置器后30d和60d后大鼠子宮內(nèi)膜均可見上皮細胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，但未見全身其他重要臟器病理改變；與裸銅組比較絡(luò)合銅組炎癥反應(yīng)輕，其中絡(luò)合銅低劑量組在置器后30d和60d均呈現(xiàn)輕度炎癥反應(yīng)。結(jié)論 與裸銅宮內(nèi)節(jié)育器相比，置低劑量絡(luò)合銅生物高分子復(fù)合材料宮內(nèi)節(jié)育器（CuCl2／SiO2／PVA IUD）大鼠子宮內(nèi)膜組織病理的形態(tài)學(xué)改變較小，證明其對子宮內(nèi)膜的刺激作用較輕微，因而可能減少置器初期的不良反應(yīng)。

絡(luò)合銅； 宮內(nèi)節(jié)育器； 子宮內(nèi)膜； 形態(tài)學(xué)； 大鼠

前期我們團隊研究結(jié)果表明:絡(luò)合銅宮內(nèi)節(jié)育器（intrauterine device，IUD）對大鼠具有與TCu380A同樣可逆的避孕效果且無銅離子的爆釋行為，但絡(luò)合銅高劑量組在取器后未能完全恢復(fù)生育力，生物材料組不含銅其避孕效果及生育力恢復(fù)都未達到TCu380A的水平［1］，這給我們一個啟示，不能單一用銅離子來解釋其避孕機制及對大鼠子宮內(nèi)膜的損傷。傳統(tǒng)觀點認為，含銅IUD通過在宮腔長期緩慢釋放銅離子造成對子宮內(nèi)膜局部組織的損傷，刺激子宮內(nèi)膜產(chǎn)生以大量的白細胞、中性粒細胞、巨噬細胞滲出為特征的子宮內(nèi)膜局部異物反應(yīng)，引起子宮內(nèi)膜的無菌性炎癥，使精子和胚胎中毒并吞噬精子和受精卵，干擾子宮內(nèi)膜的代謝，改變宮腔環(huán)境使之不適合胚胎的發(fā)育和著床從而達到避孕目的［25］。大量的證據(jù)表明任何組織和細胞遭受不能耐受的有害因子刺激后都會引起細胞及其間質(zhì)的物質(zhì)代謝、組織化學(xué)、超微結(jié)構(gòu)乃至光鏡和肉眼可見的異常變化［67］，所有有害因素都首先在分子水平上發(fā)揮作用，能否辨別出細胞適應(yīng)、可逆性或不可逆損傷的形態(tài)學(xué)變化取決于細胞病變的性質(zhì)和觀察方法的敏感度。為了進一步探討絡(luò)合銅IUD避孕及副反應(yīng)發(fā)生機制，開發(fā)高效、可逆、安全的IUD，有必要利用動物模型，對置器后大鼠重要器官、子宮內(nèi)膜的組織結(jié)構(gòu)進行病理觀察，從細胞水平揭示其避孕及子宮內(nèi)膜損傷的發(fā)生機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF（specific pathogen free animals，SPF）級雌性SD（Sprague－Dawley，SD）大鼠50只，10～12周齡，均有生殖能力，由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物學(xué)部提供。湖北省實驗動物質(zhì)量合格證No.00012251，許可證號SCXK（鄂）SCXK 2008－0004。

1.1.2 實驗材料 絡(luò)合銅IUD及生物基體材料IUD由華中科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院提供，金屬裸銅IUD材料取自于TCu380A的銅管部分，由武漢衛(wèi)民醫(yī)療器械有限責(zé)任公司提供，以上的所有材料均為直徑2mm、長5mm的圓柱體。

1.1.3 主要試劑與儀器 主要試劑:4%多聚甲醛，2.5%戊二醛，蘇木精－伊紅（Hematoxylin and eosin，HE）染色試劑盒，環(huán)氧樹脂，枸櫞酸鉛。實驗儀器和器械:超薄切片機（LEICA ULTRACUT UCT，德國）；低溫冰箱（MDF－382E，日本三洋）；電子天平（ScoutⅡ型，加拿大梅特勒托力多公司）。

1.1.4 實驗分組 按體重分層計算機隨機數(shù)字化分組。將實驗分為5組，每組10只，包括金屬裸銅組（簡稱裸銅組）、不含銅的絡(luò)合高分子生物基體材料組（簡稱生物材料組）、絡(luò)合銅低劑量組、絡(luò)合銅高劑量組和空白對照組。

1.2 實驗方法

1.2.1 置器 3%戊巴比妥鈉（45mg／kg）行腹腔麻醉；無菌操作逐層開腹，暴露子宮，于左側(cè)子宮近陰道端剪開，朝卵巢方向?qū)UD向子宮中段置入，并用4－0不可吸收手術(shù)縫線固定于子宮壁，然后縫合切口；另一側(cè)子宮作為自身對照側(cè)?？瞻讓φ战M，不做任何手術(shù)。所有手術(shù)動物在關(guān)腹前腹腔給予慶大霉素抗感染，術(shù)后1周內(nèi)每天活力碘涂擦腹部傷口，加強護理。

1.2.2 子宮內(nèi)膜及全身重要臟器組織學(xué)檢查 于置器后30d和60d時取材:活體心臟灌流法，每組隨機選取3只動物，3%戊巴比妥鈉（45mg／kg）行腹腔麻醉，無菌操作打開胸腹腔，暴露心臟，用10號針頭從左心刺入升主動脈處，同時剪開左心耳，快速推注生理鹽水，待全身血液排盡即主要臟器變白時快速推注4%多聚甲醛，固定后取出置器段子宮（對照組取相應(yīng)部位）、同側(cè)卵巢、心、肝、脾、肺及腎組織。4%多聚甲醛24h充分固定后，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片（4～5μm），60℃烤片3h，逐級脫蠟至水，行蘇木精－伊紅（HE）染色，最后脫水，透明，中性樹脂封片。風(fēng)干后在光學(xué)顯微鏡下觀察組織學(xué)改變。特別說明:其中的子宮因需觀察的是置器對子宮內(nèi)膜的損傷情況，取材的部位為IUD所在的部位，包埋成功后定位于子宮內(nèi)膜面，分別切片行HE染色。

2 結(jié)果

2.1 大鼠重要器官及子宮卵巢的大體改變

對大鼠心、肝、脾、肺、腎、子宮及卵巢的形狀、大小、重量、色澤、質(zhì)地、表面及切面形態(tài)、與周圍組織和器官的關(guān)系進行細致地解剖、觀察、測量、取材和記錄，其大體結(jié)構(gòu)均無明顯的異常變化。

2.2 大鼠全身主要臟器組織形態(tài)學(xué)改變

置器60d后，金屬裸銅組、絡(luò)合銅高劑量組與空白對照組相比較，大鼠心、肝、脾、肺、腎及卵巢組織均未見明顯異常（圖1）。

2.3 大鼠子宮內(nèi)膜組織形態(tài)學(xué)改變

2.3.1 空白對照組 腺上皮呈單層立方狀，無增生，無炎性細胞浸潤，無淤血，間質(zhì)無水腫，基底膜完整（圖2）。

圖1 絡(luò)合銅高劑量組（CuCl2／SiO2／PVAⅡ）大鼠主要臟器組織切片圖（蘇木精－伊紅染色，×400）Fig.1 Histopathological images of major organ tissues of rats in high－dose complexing copper－containing IUD group（CuCl2／SiO2／PVAⅡ）（HE staining，×400）

圖2 空白對照組大鼠子宮內(nèi)膜組織病理切片圖（蘇木精－伊紅染色，×400）Fig.2 Histopathological images of endometrial tissues of rats in the normal control group（HE staining，×400）

2.3.2 金屬裸銅組 血管高度擴張淤血，伴中性粒細胞炎性浸潤（置器30d，圖3A）；炎性細胞浸潤以淋巴細胞和少量嗜中性粒細胞為主，有假復(fù)層柱狀上皮增生，但基底膜完整（置器60d，圖3B）。

2.3.3 生物材料組 30d時間質(zhì)水腫，毛細血管高度擴張（置器30d，圖3C）；60d時上皮呈灶性增生，間質(zhì)細胞炎性浸潤，以中性粒細胞為主，基底膜不完整，部分缺失（置器60d，圖3D）。

2.3.4 絡(luò)合銅低劑量組 30d時腺體輕度擴張，腔內(nèi)外有嗜中性粒細胞和淋巴細胞浸潤，呈輕度炎癥反應(yīng)（置器30d，圖3E）；60d時有輕度炎性細胞浸潤，腺上皮呈單層立方狀，無增生，基底膜完整（置器60d，圖3F）。

2.3.5 絡(luò)合銅高劑量組 30d時腺體擴張，呈中度炎性細胞浸潤（以中性粒細胞和淋巴細胞為主）（置器30d，圖3G）；60d時血管擴張淤血，灶性腺上皮增生呈假復(fù)層（伴出芽），可見核分裂象（過度增生的表現(xiàn)），基底膜基本完整（置器60d，圖3H）。

3 討論

大體和顯微鏡水平上的形態(tài)學(xué)觀察技術(shù)是病理學(xué)研究和學(xué)習(xí)的最傳統(tǒng)技術(shù)，也是診斷和研究疾病的最基本方法。50多年來，以Noyes和他的合作者的形態(tài)學(xué)觀察為基礎(chǔ)的子宮內(nèi)膜的組織學(xué)評價一直是臨床診斷的金標準［8］。IUD是目前最常用的一種可逆的避孕方法之一，但其確切的避孕機制也不完全清楚［910］。子宮內(nèi)膜的形態(tài)及生物化學(xué)成分在生殖過程中起著非常重要的作用；這些因素的改變通過干擾精子的獲能和子宮內(nèi)膜的容受性而影響生殖過程［11］。傳統(tǒng)觀點認為，宮內(nèi)節(jié)育器的構(gòu)成材料是影響使用效果的重要因素［12］。含銅IUD置入宮腔后直接接觸子宮內(nèi)膜，一方面對子宮內(nèi)膜局部產(chǎn)生機械性壓迫，另一方面因大量銅離子及其它腐蝕產(chǎn)物釋放入宮腔，可損傷子宮內(nèi)膜，影響局部組織細胞代謝功能，引起的無菌性炎癥反應(yīng)比惰性IUD嚴重［12］。特別是在置器初期，由于銅離子的爆釋，對子宮內(nèi)膜的刺激最為明顯。隨著帶器時間的延長，機體的適應(yīng)而逐漸減輕。Timonen和Kosonen［1314］對TCu IUD分別在宮腔內(nèi)銅離子的釋放與腐蝕壽命進行了觀察，其結(jié)果表明TCu IUD具有低的妊娠率并且在其有效期內(nèi)銅離子一直保持釋放，體外實驗表明銅還可以通過干擾精子的遷移、精子活力及精子的頂體反應(yīng)來影響精子的受精能力［1519］。有研究表明IUD帶器者與非IUD帶器者相比到達受精部位的有受精能力的精子是要少一些，而且僅精子的遷移能力的障礙也減少了其受精的機會。Chang等［20］研究了大鼠宮腔銅離子對鼠囊胚著床的影響，他們將暴露在含銅宮腔里的囊胚移植到正常宮腔結(jié)果鼠囊胚正常著床，反之則著床失敗，其結(jié)果表明宮腔環(huán)境的改變參與了避孕機制。受影響的細胞和由其構(gòu)成的組織、器官在內(nèi)外環(huán)境中的有害因子的刺激作用下首先表現(xiàn)為適應(yīng)性反應(yīng)，在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為萎縮、肥大、增生和化生。

結(jié)合臨床上含銅IUD的不良反應(yīng)多見于置器后最初3個月，本實驗以置器大鼠為研究模型，選擇了置器后30d和60d兩個時間點，即子宮內(nèi)膜受IUD直接影響最明顯時為觀察時機。根據(jù)前期體外實驗的結(jié)果，理論上來說，絡(luò)合銅生物高分子復(fù)合材料因避免了裸銅與子宮內(nèi)膜的直接接觸，無置入初期銅離子的爆釋且無腐蝕產(chǎn)物沉積在金屬表面，因而對子宮內(nèi)膜損傷應(yīng)該比金屬裸銅材料輕，本實驗結(jié)果證實了這一點。實驗各組均表現(xiàn)出以子宮內(nèi)膜為中心環(huán)節(jié)的損傷與機體抗損傷的過程，表現(xiàn)為細胞及亞細胞的水腫、變性、血管擴張及液體的滲出，子宮內(nèi)膜腺上皮及其血管內(nèi)皮細胞的再生等炎癥反應(yīng)。絡(luò)合銅低劑量組無論在大體還是在光鏡下形態(tài)學(xué)改變都比裸銅組輕。而生物材料組及高劑量組仍然表現(xiàn)了不同程度的組織內(nèi)膜的炎性損傷，其原因還有待進一步的研究。

置器60d后，大鼠心、肝、脾、肺、腎和卵巢組織均未見明顯異常，但子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)的變化隨各組材料釋放的銅離子量增加而遞增。組織病理學(xué)檢查顯示絡(luò)合銅低劑量組的表現(xiàn)最為輕微，僅表現(xiàn)為腺體輕度擴張，和輕度炎癥反應(yīng)，腺上皮呈單層立方狀，無增生，基底膜完整。已知無菌性炎癥反應(yīng)是含銅IUD的避孕機制之一［2122］，但過度的炎癥反應(yīng)可能是引起子宮異常出血及疼痛等副反應(yīng)產(chǎn)生的重要因素之一［23］。有研究表明，置Cu－IUD后子宮內(nèi)膜微血管普遍存在結(jié)構(gòu)和功能的異常改變，且這些血管的變化在置器后出現(xiàn)異常出血者的子宮內(nèi)膜表現(xiàn)得更為顯著［24］。

綜上所述，與傳統(tǒng)金屬裸銅IUD相比，放置低劑量絡(luò)合銅高分子復(fù)合材料IUD（CuCl2／SiO2／PVA IUD）大鼠子宮內(nèi)膜組織病理的形態(tài)學(xué)改變較小，證明其對子宮內(nèi)膜的刺激作用較輕微，因而可能減少置器初期的不良反應(yīng)。我們將進一步從亞細胞及分子水平去探討絡(luò)合銅IUD的避孕及與副反應(yīng)發(fā)生的可能機制，研發(fā)生物相容性更好的新型含銅IUD。

圖3 置IUD 30d和60d后各組大鼠子宮內(nèi)膜組織切片圖（蘇木精－伊紅染色，×400）Fig.3 Histopathological images of endometrial tissues of rats 30and 60days after implantation of IUD in each group（HE staining，×400）

［1］ Peng X，Hu S，Meng T，et al.The antifertility effectiveness of a novel copper－containing composite used in intrauterine contraceptive devices and the releasing behavior of cupric ions contained in the composite in rats［J］.Contraception，2012，86（4）:413－418.

［2］ Sandvei R，Wollen A L，F(xiàn)lood P R，et al.Mast cells in the tubal wall in women using an intrauterine contraceptive device［J］.Br J Obstet Gynaecol，1986，93（7）:758－764.

［3］ Cuadros A，Hirsch J G.Copper on intrauterine devices stimulates leukocyte exudation［J］.Science，1972，175（18）:175－176.

［4］ Salaverry G，Méndez Mdel C，Zipper J，et al.Copper determination and localization in different morphologic components of human endometrium during the menstrual cycle in copper intrauterine contraceptive device wearers［J］.Am J Obstet Gynecol，1973，115（2）:163－168.

［5］ Sheppard B L.Endometrial morphological changes in IUD users:A review［J］.Contraception，1987，36（1）:1－10.

［6］ Coskun E，Cakiroglu Y，Aygun B K，et al.Effect of copper intrauterine device on the cyclooxygenase and inducible nitric oxide synthase expression in the luteal phase endometrium［J］.Contraception，2011，84（6）:637－641.

［7］ Oderich C L，Wender M C，Lubianca J N，et al.Impact of etonogestrel－releasing implant and copper intrauterine device on carbohydrate metabolism:a comparative study［J］.Contraception，2012，85（2）:173－176.

［8］ Noyes R W，Hertig A T，Rock J.Dating the endometrial biospsy［J］.Am J Obstec Gynecol，1975，122（2）:262－263.

［9］ Bahamondes L，F(xiàn)aundes A，Sobreira－Lima B，et al.TCu 380A IUD:a reversible permanent contraceptive method in women over 35years of age［J］.Contraception，2005，72（5）:337－341.

［10］ Grimes D A，Lopez L M，Manion C，et al.Cochrane systematic reviews of IUD trials:lessons learned［J］.Contraception，2007，75（Suppl.6）:S55－S59.

［11］ Tetrault A M，Richman S M，F(xiàn)ei X，et al.Decreased endometrial HOXA10expression associated with use of the copper intrauterine－device［J］.Fertil Steril，2009，92（6）:1820－1824.

［12］ 韓永梅，王翠梅，王風(fēng)華，等.宮內(nèi)節(jié)育器的臨床研究進展［J］.實用醫(yī)藥雜志，2008，25（8）:1001－1003.

［13］ Timonen H.Copper release from Copper－T intrauterine devices［J］.Contraception，1976，14（1）:25－38.

［14］ Kosonen A.Corrosion of copper in utero［J］.Fertil Steril，1978，30（1）:59－65.

［15］ Tredway D R，Umezaki C U，Mishell D R，et al.Effect of intrauterine devices on sperm transport in the human being: preliminary report［J］.Am J Obstet Gynecol，1975，123（7）: 734－735.

［16］ Aref I，Kandil O，El－tagi A，et al.Effects of non－medicated and copper IUDs on sperm migration［J］.Contracept Deliv Syst，1983，4（3）:203－206.

［17］ Ullmann G，Hammerstein J.Inhibition of sperm motility in vitro by copper wire［J］.Contraception，1972，6（1）:71－76.

［18］ Roblero L，Guadarrama A，Lopez T，et al.Effect of copper ion on the motility，viability，acrosome reaction and fertilizing capacity of human spermatozoa in vitro［J］.Reprod Fertil Dev，1996，8（5）:871－874.

［19］ Kadanali S，Varoglu E，Komec D，et al.Evaluation of active and passive transport mechanisms in genital tracts of IUD－bearing women with radionuclide hysterosalpingoscintigraphy［J］.Contraception，2001，63（1）:41－45.

［20］ Chang C C，Tatum H J，Kincl F A.The effect of intrauterine copper and other metals on implantation in rats and hamsters［J］.Fertil Steril，1970，21（3）:274－278.

［21］ 王洪，朱長虹.銅、銀和鋅作為宮內(nèi)節(jié)育器活性物質(zhì)的歷史回顧與發(fā)展前景［J］.華中科技大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2014，43（3）: 364－367，370.

［22］ Alvarez F，Schilardi P L，de Mele M F.Reduction of the“burst release”of copper ions from copper－based intrauterine devices by organic inhibitors［J］.Contraception，2012，85（1）: 91－98.

［23］ Boortz H E，Margolis D J，Ragavendra N，et al.Migration of intrauterine devices:radiologic findings and implications for patient care［J］.Radiographics，2012，32（2）:335－352.

［24］ Abulafia O，Sherer D M.Angionenesis of the endometrium［J］.Obstet Gynecol，1999，94（1）:148－153.

（2014－09－27 收稿）

Effects of A Novel Complexing Copper－containing IUD on Endometrial Morphology in Rats

Peng Xiangchi1，2，Yang Ruifeng2，Meng Tianqing2et al
1 Family Planning Research Institute，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China
2 Center of Reproductive Medicine，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430022，China

Objective To explore the effects of a novel complexing copper－containing intrauterine device（IUD）on the endometrial morphological changes in rats in order to evaluate the safety of the IUD.Methods Fifty female sexually mature Sprague－Dawley（SD）rats at the age of 10－12weeks were randomly divided into five groups:bulk copper group（Cu group，n＝10），SiO2／PVA group（n＝10），CuCl2／SiO2／PVA groupⅠ（copper ion released at 5－10μg／220mm2per day，n＝10）and CuCl2／SiO2／PVA groupⅡ（copper ion released at 10－20μg／220mm2per day，n＝10）and normal control group（NC group，n＝10）.Different IUDs were advanced towards the ovaries and implanted into the uterus through the incision in the left side of the uterus adjacent to the vagina.The endometrial tissues，ovaries，heart，liver，spleen，lungs and kidneys were removed 30and 60days after the implantation of IUD.The morphological changes were observed by using hematoxylin－eosin（HE）staining and light microscopy.Results Gross examination revealed the normal morphology of the heart，liver，spleen，lungs，kidneys，uterus and ovaries in each group.The morphology and structure of the epithelia of the endometrium changed 30and 60days after the implantation of IUD in each group and no obvious changes were found in other important organs.The inflammation was milder in CuCl2／SiO2／PVA groups than in Cu group.Mild inflammation was observed in CuCl2／SiO2／PVA groupⅠat 30and 60 days.Conclusion The morphological changes of the endometrium were less pronounced in the novel complexing copper－containing IUD（low dose）group than in bulk copper－containing IUD group，suggesting that the novel complexing copper－containing IUD induces minor endometrial damage，and it may reduce adverse effects in the initial period of IUD implantation.

complexing copper； intrauterine device； endometrium； morphology； rat

R169.41

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.01.013

＊武漢市科技局應(yīng)用性基礎(chǔ)研究項目（No.2014060101010044）

彭祥熾，女，1965年生，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，E－mail:121430668＠qq.com

△通訊作者，Corresponding author，E－mail:clxiong951＠sina.com