神經(jīng)元損傷度對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞表型的影響＊

羅振釗，王 靜，孔 曼，胡 繪，盧忠心，施 靜

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，武漢 430014

2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系，武漢 430030

神經(jīng)元損傷度對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞表型的影響＊

羅振釗1，王 靜1，孔 曼1，胡 繪1，盧忠心1，施 靜2△

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，武漢 430014

2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系，武漢 430030

目的 探討不同的神經(jīng)元損傷度對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞表型的影響。方法 將原代培養(yǎng)的神經(jīng)元進(jìn)行缺氧處理，不同的時(shí)長(zhǎng)（0.5、1、2、4h）后，復(fù)氧處理24h，收集神經(jīng)元條件培養(yǎng)液（neuron－conditioned media，NCM），然后將NCM刺激原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞24h（NCM∶小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液＝1∶1，V／V）。采用Western blot法檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的M2表型標(biāo)記物精氨酸酶－1（arginase－1）和激活標(biāo)記物離子鈣結(jié)合銜接分子－1（Iba－1）的表達(dá)變化規(guī)律，采用免疫熒光法檢測(cè)arginase－1的表達(dá)變化規(guī)律。同時(shí)，采用ELISA法檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的營(yíng)養(yǎng)因子，如腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF）和炎性因子，如腫瘤壞死因子－α（TNF－α）、白細(xì)胞介素－1β（IL－1β）、白細(xì)胞介素－6（IL－6）的分泌變化規(guī)律。最后，將不同損傷度的NCM誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞形成不同表型，將小膠質(zhì)細(xì)胞和缺氧處理2h后的神經(jīng)元共培養(yǎng)24h，MTT法檢測(cè)神經(jīng)元的活力。結(jié)果 輕微損傷（缺氧0.5、1h）的NCM明顯下調(diào)M2型標(biāo)記物arginase－1的表達(dá)水平，中度（缺氧2h）和重度（缺氧4h）損傷的NCM能夠上調(diào)arginase－1的表達(dá)，各種損傷度的NCM都能上調(diào)Iba－1的表達(dá)水平，提示其在一定程度上激活小膠質(zhì)細(xì)胞。同時(shí)，輕微損傷的NCM明顯上調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞TNF－α、IL－1β和IL－6的分泌，而中度和重度損傷的NCM對(duì)這些促炎因子的釋放沒(méi)有影響，各種損傷度的NCM都能明顯上調(diào)營(yíng)養(yǎng)因子的分泌。MTT法檢測(cè)表明，輕微和重度損傷處理的NCM刺激的小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)一步加重缺氧處理的神經(jīng)元損傷，而中度損傷的NCM對(duì)缺氧處理后的神經(jīng)元具有保護(hù)作用。結(jié)論 神經(jīng)元損傷度是決定小膠質(zhì)細(xì)胞表型的重要因素，進(jìn)而使小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)揮神經(jīng)毒性或保護(hù)作用。

小膠質(zhì)細(xì)胞； 細(xì)胞因子； 神經(jīng)元損傷度； 表型

越來(lái)越多的研究證據(jù)表明，神經(jīng)炎癥參與了腦缺血再灌注損傷的預(yù)后過(guò)程［1］。小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的免疫細(xì)胞，持續(xù)不斷地監(jiān)控著大腦微環(huán)境［2］。當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷，例如感染、腦外傷、缺血性損傷時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞迅速地被激活，從苧麻狀的靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)換為阿米巴狀，遷移到受損部位，通過(guò)吞噬清除細(xì)胞碎片和毒性物質(zhì)，同時(shí)釋放一系列的炎性因子，例如腫瘤壞死因子－α（TNF－α）、白細(xì)胞介素－1β（IL－1β）、活性氧簇、活性氮簇、前列腺素等，進(jìn)一步加重炎癥損傷［34］。另一方面，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)分泌白細(xì)胞介素－10、干擾素－γ、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－β、胰島素樣生長(zhǎng)因子1和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，支持神經(jīng)元的存活，促進(jìn)基質(zhì)重建，避免繼發(fā)性的炎癥損傷［5］。因此，小膠質(zhì)細(xì)胞在腦損傷后具有促炎和抗炎的雙重作用，由于小膠質(zhì)細(xì)胞在腦損傷后，能夠感受受損神經(jīng)元釋放的信號(hào)分子，那么，不同的神經(jīng)元損傷度是否對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的表型有影響，目前仍不清楚。

本研究利用不同時(shí)長(zhǎng)缺氧處理的神經(jīng)元條件培養(yǎng)液（neuron－conditioned media，NCM）刺激小膠質(zhì)細(xì)胞，檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和炎性因子的釋放水平，同時(shí)采用Western blot法和免疫熒光法檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞M2表型標(biāo)記物精氨酸酶－1（arginase－1）和激活標(biāo)記物離子鈣結(jié)合銜接分子－1（Iba－1）的表達(dá)變化規(guī)律，旨在探討神經(jīng)元損傷度對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞表型的影響。

1 材料與方法

1.1 原代小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)

采用出生后1～3d的SD新生大鼠，將全腦置于預(yù)冷的D－Hank’s平衡鹽溶液中，在解剖顯微鏡下用精細(xì)尖鑷剝?nèi)バ崆?、腦膜、端腦、腦干等，然后將大腦皮質(zhì)用手術(shù)刀切成1mm3的小塊，加入0.125%胰酶37℃消化5min，加入1／10消化液體積的胎牛血清（FBS）終止消化，用10mL刻度吸管將組織塊吹打成單細(xì)胞懸液，然后用篩網(wǎng)直徑為70 mm的細(xì)胞篩過(guò)濾，將細(xì)胞懸液以800r／min、4℃離心5min，細(xì)胞沉淀重懸于DMEM＋10%FBS的培養(yǎng)液，計(jì)數(shù)，將細(xì)胞按照（1.0～1.2）×105／cm2的密度種植于用50mg／mL多聚賴氨酸包被過(guò)夜處理的75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，此后每隔3d換液1次，體外培養(yǎng)14d以后，可見(jiàn)許多貼壁不牢的，折光率很強(qiáng)的小膠質(zhì)細(xì)胞漂浮在星形膠質(zhì)細(xì)胞上面。純化小膠質(zhì)細(xì)胞采用振搖法，將培養(yǎng)瓶置于37℃水平搖床，瓶口密封，150r／min振搖6h，將細(xì)胞懸液用50mL離心管收集，1 000r／min、4℃離心7min，將其沉淀重懸于DMEM＋10%FBS，計(jì)數(shù)，接種于培養(yǎng)皿或Transwell插件，培養(yǎng)1d后用于下游實(shí)驗(yàn)。小膠質(zhì)細(xì)胞的純度通過(guò)標(biāo)記Iba－1鑒定，純度＞95%，在和神經(jīng)元共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液在共培養(yǎng)之前24h換成Neurobasal培養(yǎng)液，用于匹配神經(jīng)元的培養(yǎng)液。

1.2 原代皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)

原代皮質(zhì)神經(jīng)元采用孕16～18d的SD大鼠的胚胎鼠，將全腦置于預(yù)冷的D－Hank’s平衡鹽溶液中，在解剖顯微鏡下用精細(xì)尖鑷剝?nèi)バ崆?、腦膜、端腦、腦干等，然后將大腦皮質(zhì)用手術(shù)刀切成1mm3的小塊，加入0.125%胰酶37℃消化5min，加入1／10消化液體積的胎牛血清（FBS）終止消化，用10mL刻度吸管將組織塊吹打成單細(xì)胞懸液，然后用篩網(wǎng)直徑為70mm的細(xì)胞篩過(guò)濾，將細(xì)胞懸液以800r／min，4℃離心5min，細(xì)胞沉淀用DMEM＋10% FBS的培養(yǎng)液重懸，計(jì)數(shù)，將細(xì)胞按照1×106／mL的密度種植于用50mg／mL多聚賴氨酸過(guò)夜包被處理的24孔板或者35mm培養(yǎng)皿中。細(xì)胞貼壁3h后換成Neurobasal＋2%B27＋0.5mmol／L谷氨酰胺＋25mmol／L谷氨酸＋1%青霉素－鏈霉素的培養(yǎng)液，以后每隔2d半量換液，體外培養(yǎng)7～10d用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 神經(jīng)元和神經(jīng)元－小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)缺氧處理

將神經(jīng)元從正常培養(yǎng)箱中取出，置于含有95% N2、5%CO2的厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)不同時(shí)長(zhǎng)（箱內(nèi)氧濃度低于1%），處理完畢后，將培養(yǎng)物置于正常的培養(yǎng)箱進(jìn)行復(fù)氧培養(yǎng)24h，然后用于實(shí)驗(yàn)。神經(jīng)元－小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)如下:將小膠質(zhì)細(xì)胞純化后種植于Transwell小室內(nèi)，先將神經(jīng)元單獨(dú)缺氧不同時(shí)長(zhǎng)后復(fù)氧24h的NCM按照與小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液1∶1的比例刺激小膠質(zhì)細(xì)胞24h，然后將小膠質(zhì)細(xì)胞與缺氧處理2h后的神經(jīng)元共培養(yǎng)24h，最后采用MTT法檢測(cè)神經(jīng)元活力。

1.4 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子

細(xì)胞培養(yǎng)上清中的TNF－α、IL－1β、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF）的含量采用商業(yè)化的ELISA試劑盒按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。TNF－α、IL－1β、IL－6檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)R＆D公司，BDNF檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，GDNF檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Abnova公司。細(xì)胞培養(yǎng)上清收集于高壓過(guò)的干凈EP管中，2 000r／min，4℃，離心10min，取上清，按照250mL每管分裝，保存于－20℃冰箱，待樣品收集齊全后，再進(jìn)行檢測(cè)。ELISA檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)限如下:TNF－α為5pg／mL，IL－1β為5pg／mL，IL－6為5pg／mL，BDNF為7.8pg／mL，GDNF為3.9pg／mL。

1.5 Western blot檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞的arginase－1和Iba－1的表達(dá)

小膠質(zhì)細(xì)胞的總蛋白提取物經(jīng)12%或15%分離膠濃度的SDS－PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，TBST漂洗3次，然后采用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1h，TBST充分洗滌后，加入一抗4℃冰箱孵育過(guò)夜。各種抗體來(lái)源和孵育濃度如下: arginase－1（Abcam，UK），Iba－1（Abcam，UK），β－actin（Santa Cruz，USA）。一抗孵育完成后TBST漂洗3次，辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的二抗常溫孵育l h，TBST充分洗滌后以ECL法顯色并拍照。NIH圖像軟件分析各條帶吸光度（A）值，結(jié)果以與正常對(duì)照組的A值的百分比表示。

1.6 免疫熒光法檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞的arginase－1的表達(dá)

將不同損傷度的NCM刺激小膠質(zhì)細(xì)胞24h后，PBS漂洗小膠質(zhì)細(xì)胞3次，將其用4%的多聚甲醛室溫固定30min，然后用PBS漂洗3次，采用含0.3%Triton－X100的PBS破膜15min，然后將其用含3%BSA的PBS室溫封閉0.5h，采用arginase－1（Abcam，UK）一抗4℃孵育過(guò)夜。然后PBS漂洗3次，孵育帶有綠色熒光的兔二抗，熒光顯微鏡下拍照。

1.7 細(xì)胞活力檢測(cè)

本研究選用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的活力，神經(jīng)元種植于24孔板中，處理完畢后，每孔加入80mL MTT（5mg／mL）在37℃的CO2培養(yǎng)箱孵育4h，讓活細(xì)胞的琥珀酸脫氫酶將MTT充分形成甲臉瞅肝臜，然后盡量吸盡孔中的培養(yǎng)液，加入500mL二甲基亞砜（DMSO）在37℃水平搖床上充分溶解結(jié)晶物，用酶標(biāo)儀在560nm處檢測(cè)樣品的A值，并在630nm處測(cè)定參考波長(zhǎng)，將測(cè)定波長(zhǎng)的A值減去參考波長(zhǎng)的A值，以A值的大小反映細(xì)胞活力。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 缺氧時(shí)長(zhǎng)對(duì)神經(jīng)元活力的影響

細(xì)胞的存活率常用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞的損傷水平。對(duì)培養(yǎng)的神經(jīng)元進(jìn)行不同時(shí)長(zhǎng)（0.5、1、2、4h）缺氧處理，然后再?gòu)?fù)氧培養(yǎng)24h，采用MTT法檢測(cè)神經(jīng)元活力，不同的處理時(shí)長(zhǎng)對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生不同程度的損傷，且隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)，損傷逐級(jí)加重，根據(jù)損傷后的神經(jīng)元活力，將其分為以下3種情況:輕度損傷（死亡率＜40%，0.5、1h缺氧），中度損傷（40%～70%死亡率，2h缺氧），重度損傷（死亡率＞70%，4 h缺氧）（圖1）。

圖1 不同缺氧時(shí)長(zhǎng)處理對(duì)神經(jīng)元活力的影響Fig.1 Effect of different time of hypoxia treatment on neuronal viability

2.2 不同損傷度的神經(jīng)元條件培養(yǎng)液（NCM）對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞表型的影響

由于小膠質(zhì)細(xì)胞具有促炎和抗炎的雙重屬性，近期的研究將小膠質(zhì)細(xì)胞劃分為經(jīng)典激活的促炎型（M1型）和選擇性激活的抗炎型（M2型）。本實(shí)驗(yàn)采用M2型的標(biāo)記蛋白精氨酸酶－1（arginase－1）來(lái)標(biāo)記M2型，采用Iba－1來(lái)檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活程度。采用缺氧處理之后的神經(jīng)元條件培養(yǎng)液（按照NCM∶小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液＝1∶1，V／V）刺激小膠質(zhì)細(xì)胞，然后檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞的arginase－1和Iba－1的表達(dá)情況。結(jié)果表明:輕度損傷的NCM明顯下調(diào)arginase－1的表達(dá)水平，而中度和重度損傷的NCM能夠上調(diào)arginase－1的表達(dá)水平；同時(shí)，各種損傷度的NCM都能夠上調(diào)Iba－1的表達(dá)水平，說(shuō)明其能在一定程度上激活小膠質(zhì)細(xì)胞，其中輕度損傷的NCM對(duì)Iba－1的上調(diào)最為明顯；采用免疫熒光染色法對(duì)上述處理的小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行arginase－1染色，結(jié)果與蛋白表達(dá)水平一致（圖2）。

ELISA法檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，結(jié)果與Western blot的結(jié)果具有一致性，缺氧處理0.5h和1h的NCM明顯地上調(diào)促炎因子TNF－α、IL－1β和IL－6的釋放，缺氧處理2h和4h的NCM對(duì)促炎因子的分泌沒(méi)有影響。由于小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的兩種營(yíng)養(yǎng)因子為BDNF和GDNF［4］，因此我們檢測(cè)了各種損傷度的NCM對(duì)這兩種營(yíng)養(yǎng)因子釋放的影響，結(jié)果表明，各種損傷度的NCM都能明顯上調(diào)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF和GDNF的釋放，但是不同神經(jīng)損傷度NCM之間對(duì)于營(yíng)養(yǎng)因子的影響沒(méi)有差異（圖3）。

圖2 不同損傷度的NCM刺激對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的M2型標(biāo)記物arginase－1和激活標(biāo)記物Iba－1表達(dá)水平的影響Fig.2 Effect of NCM of different severities on the expression levels of the microglial M2marker arginase－1and the activation marker Iba－1

圖3 不同損傷度的NCM刺激對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞因子釋放的影響Fig.3 Effect of NCM of different severities on the release of microglial cytokines

2.3 不同損傷度的NCM誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞表型對(duì)缺氧損傷后的神經(jīng)元存活率的影響

將不同損傷度的NCM刺激小膠質(zhì)細(xì)胞24h，然后將小膠質(zhì)細(xì)胞和缺氧處理2h后的神經(jīng)元共培養(yǎng)24h，最后檢測(cè)神經(jīng)元的活力。結(jié)果表明，中度損傷的NCM刺激后的小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)缺氧損傷后的神經(jīng)元發(fā)揮保護(hù)作用，而輕度和重度損傷的NCM刺激后的小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)一步加重缺氧處理神經(jīng)元的損傷（圖4）。

圖4 不同損傷度NCM刺激的小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)缺氧處理神經(jīng)元活力的影響Fig.4 Effect of microglia treated with NCM of different severities on neuronal viability

3 討論

許多學(xué)者認(rèn)為，小膠質(zhì)細(xì)胞的活化狀態(tài)是多樣的［6］，有可能是促炎型的、抗炎型的，或者營(yíng)養(yǎng)型的。隨著研究的深入，近期有學(xué)者基于轉(zhuǎn)錄特點(diǎn)、蛋白組學(xué)和功能分析，提議將小膠質(zhì)細(xì)胞劃分為經(jīng)典激活的M1型和選擇性激活的M2型［78］。M1型的小膠質(zhì)細(xì)胞，主要通過(guò)Toll樣受體和干擾素－γ激活，產(chǎn)生促炎因子和氧化代謝物發(fā)揮促炎和組織損傷作用［910］。相反地，M2型巨噬細(xì)胞主要由白細(xì)胞介素－4或者白細(xì)胞介素－13誘導(dǎo)，通過(guò)清道夫受體和基質(zhì)降解酶發(fā)揮抗炎作用和促進(jìn)吞噬以及損傷組織修復(fù)重建，同時(shí)，它們還能促進(jìn)血管再生和基質(zhì)重建并且抑制過(guò)度炎癥反應(yīng)。本研究將神經(jīng)元經(jīng)缺氧處理后的條件培養(yǎng)液刺激小膠質(zhì)細(xì)胞，然后檢測(cè)與小膠質(zhì)細(xì)胞表型有關(guān)的指標(biāo)，結(jié)果表明小膠質(zhì)細(xì)胞的抗炎和促炎表型轉(zhuǎn)換依賴于神經(jīng)元的損傷度，小膠質(zhì)細(xì)胞能夠?qū)Σ煌瑩p傷度作出相應(yīng)的反應(yīng)。

本研究探討神經(jīng)損傷信號(hào)在沒(méi)有星形膠質(zhì)細(xì)胞和T細(xì)胞存在的情況下，它是如何影響小膠質(zhì)細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換。結(jié)果表明，輕度損傷的NCM刺激下調(diào)arginase－1表達(dá)水平，提示小膠質(zhì)細(xì)胞向促炎的M1型轉(zhuǎn)換，同時(shí)檢測(cè)到促炎因子上調(diào)；中、重度損傷的NCM上調(diào)arginase－1的表達(dá)水平，提示小膠質(zhì)細(xì)胞向抗炎的M2型轉(zhuǎn)換，同時(shí)檢測(cè)到促炎因子釋放無(wú)變化，輕中度損傷的NCM刺激小膠質(zhì)細(xì)胞后，小膠質(zhì)細(xì)胞分別對(duì)缺氧處理神經(jīng)元產(chǎn)生損傷和保護(hù)作用，這與小膠質(zhì)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)換一致。但是，重度損傷的NCM刺激小膠質(zhì)細(xì)胞后，小膠質(zhì)細(xì)胞亦加重了缺氧處理神經(jīng)元的損傷，提示還有其它因素決定小膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)損傷或保護(hù)作用，由于神經(jīng)元在損傷之后能夠釋放一系列的信號(hào)分子來(lái)激活小膠質(zhì)細(xì)胞，其中最重要的就是神經(jīng)遞質(zhì)，例如興奮性的神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸、ATP等，抑制性的遞質(zhì)γ－氨基丁酸和去甲腎上腺素等［11］，可能是重度損傷的神經(jīng)元大量釋放某些興奮性的遞質(zhì)分子，超過(guò)了小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)這些神經(jīng)毒性物質(zhì)的攝取能力，從而加重神經(jīng)損傷，所以仍需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

綜上所述，我們的研究從神經(jīng)損傷的角度證明了其對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞表型的影響作用。結(jié)果表明，小膠質(zhì)細(xì)胞的活化狀態(tài)是受多種因素影響的，例如依賴于它們作用于哪類(lèi)細(xì)胞，它們接受了神經(jīng)元哪種損傷程度的信號(hào)，然后作出相應(yīng)的活化反應(yīng)，從而呈現(xiàn)出不同的表型。

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（2014－10－15 收稿）

Effect of Neuronal Injury Severity on Microglial Phenotype

Luo Zhenzhao，Wang Jing，Kong Man et al
Department of Clinical Laboratory，Wuhan Central Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430014，China

Objective To explore the effects of different severities of neuronal injury on microglial phenotype.Methods Primary neurons were treated by hypoxia for 0.5，1，2，and 4h，and then reoxygenated for 24h.Neuron－conditioned media（NCM）were collected and added to microglial cultures（1∶1volume）.Twenty－four h later，Western blot was used to detect the expressions of the microglial M2phenotype marker arginase－1and the activation marker ionized calcium binding adapter molecule 1（Iba－1）.Immunofluorescence was performed to detect the expression of arginase－1.Additionally，microglial trophic molecules brain－derived neurotrophic factor（BDNF），glial cell line－derived neurotrophic factor（GDNF）and proinflammatory cytokines TNF－α，IL－1β，IL－6were determined by ELISA.Finally，different phenotypes of primary microglia were formed after cells were treated with different NCM.MTT assays were used to determine the viability of neurons which were treated by hypoxia for 2hand then co－cultured with microglia for 24h.Results NCM from mild injuries（treated by hypoxia for 0.5or 1h）significantly down－regulated the expression of the microglial M2phenotype marker arginase－1，and those from moderate and severe injuries up－regulated the arginase－1expression.Iba－1was upregulated in all injury conditions，suggesting that all the injury conditions can induce microglial activation to some degree.Moreover，NCM from mild injuries up－regulated the secretion of microglial TNF－α，IL－1βand IL－6，but NCM from moderate（hypoxia 2h）and severe（hypoxia 4h）injuries had no effects on these proinflammatory cytokines.NCM of different injury severities significantly up－regulated the release of these trophic molecules.MTT assays demonstrated that microglia incubated with NCM of mild and severe injuries further exacerbated the injury of neurons treated by hypoxia.Microglia incubated with NCM of moderate injuries protected neurons from hypoxia injury.Conclusion The severity of neuronal injury is an important factor in determining microglial phenotypes，which has neurotoxic or neuroprotective effects.

microglia； cytokine； severity of neuronal injury； phenotype

R322.85

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.01.009

＊國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.31171029）

羅振釗，男，1984年生，技師，醫(yī)學(xué)博士，E－mail:lzzbvy＠163.com

△通訊作者，Corresponding author，E－mail:sj＠m(xù)ails.tjmu.edu.cn