MiRNA－106a通過作用RUNX3基因誘導(dǎo)胃癌細胞多藥耐受

張 翌，蔡 遜，金煒東

廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院普通外科，武漢 430070

MiRNA－106a通過作用RUNX3基因誘導(dǎo)胃癌細胞多藥耐受

張 翌，蔡 遜△，金煒東

廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院普通外科，武漢 430070

目的 探討胃癌細胞中人類相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3（RUNX3）對miRNA－106a（miR－106a）表達的影響以及與多藥耐藥的關(guān)系。方法 采用免疫印跡法及細胞凋亡檢測來觀察miR－106a在兩個人類胃癌細胞多藥耐藥細胞系上的表達情況。運用免疫印跡及多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測miR－106a的表達來觀察癌細胞對抗癌藥物的敏感性。通過熒光素酶活性測定觀察miR－106a與RUNX3的關(guān)系。結(jié)果 miR－106a在多藥耐藥胃癌細胞中表達增加，并抑制胃癌細胞對抗癌藥物的敏感性；通過作用于RUNX3調(diào)節(jié)多藥耐藥。結(jié)論 通過作用于RUNX3基因，miR－106a誘導(dǎo)胃癌多藥耐藥性。

胃癌； 多藥耐藥性； miRNA－106a； 人類相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3

胃癌（gastric cancer，GC）是世界上致死率第2高的癌癥［1］，化療是目前臨床治療胃癌的最常用的方法，但是治療過程中出現(xiàn)的多藥耐藥性（MDR）限制了治療效果［2］，MDR的作用機制仍未明確［34］。近些年研究發(fā)現(xiàn)在MDR的發(fā)生機制中miRNAs發(fā)揮重要作用［5］。有報道已證明miRNA－106a（miR－106a）在胃癌中的表達具有臨床意義［6］；但是，miR－106a在胃癌MDR中的確切機制尚不明確。

本實驗擬觀察miR－106a在兩個人類胃癌細胞多藥耐藥細胞系上的表達情況，檢測miR－106a抑制胃癌細胞對抗癌藥物的敏感性，觀察miR－106a是否能增加胃癌細胞的多藥耐受。最后觀察miR－106a是否作用于RUNX3基因而在胃癌細胞多藥耐受過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

SGC7901人類胃腺癌細胞株（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院）；miRNA萃取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］；Trizol試劑、脂質(zhì)體2000（Invitrogen公司）；TOYOBO試劑［東洋紡（上海）生物科技有限公司］；廣州銳博生物制劑；膜聯(lián)蛋白Ⅴ－FITC凋亡檢測試劑盒（BD Biosciences公司，NY，USA）；裂解緩沖液（碧云天生物技術(shù)公司）；阿霉素（ADR）、長春新堿（VCR）及氟尿嘧啶等化療藥物（浙江海正制藥公司）。

1.2 實驗方法

SGC7901人類胃腺癌細胞株保持在含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液中，為維持藥物抗性表型，分別加入ADR和VCR。使用miRNA萃取試劑盒將miRNA單獨分離；從復(fù)能基因中獲得miR－106a和U6的引物。通過Trizol試劑萃取RNA中的miRNA，以及使用TOYOBO試劑將miRNAs轉(zhuǎn)錄成cDNA以檢測RUNX3基因。通過實時熒光定量系統(tǒng)分析miRNA和RUNX3的表達。應(yīng)用廣州銳博生物制劑獲得miR－106a的模擬／抑制劑以及進行相應(yīng)的控制。將靶細胞和miR－106a中的模擬／抑制劑一起轉(zhuǎn)染，或使用脂質(zhì)體2000進行相應(yīng)的控制，并收集細胞在48h后轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后24h，將細胞和化療藥物順鉑（CDDP）和5－氟尿嘧啶（5－FU）一起培養(yǎng)48h。然后，收集細胞，通過膜聯(lián)蛋白Ⅴ－FITC凋亡檢測試劑盒進行細胞凋亡檢測。使用ModFit軟件（BD Biosciences公司）對數(shù)據(jù)進行分析。

通過流式細胞儀檢測細胞內(nèi)ADR濃度。在裂解緩沖液中對細胞進行轉(zhuǎn)染和均質(zhì)化48h后收獲細胞。用ECL試劑盒檢測條帶。使用psiCHECK－2－RUNX3和miR－106a變種DNA轉(zhuǎn)染SGC7901細胞。使用非熒光素酶作為對照。采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)（普洛麥格）檢測海腎和螢火蟲熒光素酶的活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

統(tǒng)計分析采用SPSS 16.0軟件。計量資料以ˉx ±s表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR－106a在多藥耐藥胃癌細胞中表達增加

為確定miR－106a是否參與了胃癌細胞的多藥耐藥過程，我們對胃癌細胞多藥耐藥SGC7901／ADR，SGC7901／VCR及其親本細胞株SGC7901進行了實時熒光定量PCR檢測。我們發(fā)現(xiàn)與SGC7901細胞相比較（圖1A），SGC7901／ADR和SGC7901／VCR細胞中的miR－106a（miR－106a mimic）有增加。SGC7901細胞中的miR－106a變種DNA起了作用，miR－106a表達顯著增加（圖1B）。miR－106a抑制劑的作用也很顯著（圖1C）。我們的研究結(jié)果表明miR－106a可能參與了胃癌細胞的多藥耐藥性發(fā)展。

圖1 miR－106a在多藥耐藥胃癌細胞中表達增加Fig.1 miR－106awas increased in GC cells with MDR

2.2 miR－106a抑制胃癌細胞對抗癌藥物的敏感性

為探索miR－106a是否對胃癌細胞的多藥耐藥有直接作用，我們研究了由miR－106a變種DNA或抑制劑轉(zhuǎn)染的SGC7901或SGC7901／VCR細胞。MTT法檢測發(fā)現(xiàn)，miR－106a變種DNA轉(zhuǎn)染了的SGC7901細胞對ADR、CDDP和5－FU的敏感度大大降低，IC50值大幅增加（圖2A）。與此相反，在SGC7901／VCR細胞抑制miR－106a水平導(dǎo)致了對ADR、CDDP和5－FU（圖2B）的敏感性提高。這些數(shù)據(jù)表明，調(diào)節(jié)miR－106a的表達改變了胃癌細胞對化療藥物的敏感性。

圖2 miR－106a抑制胃癌細胞對抗癌藥物的敏感性Fig.2 miR－106asuppressed the sensitivity of GC cells to anticancer drugs

2.3 miR－106a通過上調(diào)P－gp促進ADR外排

為探索miR－106a在胃癌細胞藥物外排中的作用，我們檢測了被miR－106a變種DNA轉(zhuǎn)染的SGC7901胃癌細胞中的ADR指數(shù)權(quán)。miR－106a變種DNA轉(zhuǎn)染后的ADR流出明顯增加（圖3A）。與ADR釋放指數(shù)一致的是，實時熒光定量PCR結(jié)果顯示多藥耐藥相關(guān)蛋白1（MDR1）mRNA水平（圖3B）和高架P－糖蛋白（P－gp）的蛋白水平也在增加，它們都是由MDR1基因編碼的，在miR－106a變種DNA轉(zhuǎn)染的胃癌細胞內(nèi)表達增強（圖3C、D）。為進一步研究miR－106a是否通過增加P－gp水平，促進藥物外排來增強胃癌細胞的多藥耐藥，我們使用了P－gp抑制劑維拉帕米來處理轉(zhuǎn)染的SGC7901細胞。加入維拉帕米減少了miR－106a變種DNA轉(zhuǎn)染的SGC7901／ADR細胞（圖3E）的ADR釋放指數(shù)。與此相反，與抑制劑轉(zhuǎn)染的SGC7901／ADR細胞（圖3F）相比，miR－106a變種DNA轉(zhuǎn)染的SGC7901／ADR細胞轉(zhuǎn)染的ADR指數(shù)權(quán)顯著降低。這些結(jié)果表明了miR－106a可能通過上調(diào)P－gp促進ADR外排。

圖3 miR－106a通過上調(diào)P－gp促進ADR的外排Fig.3 miR－106apromoted the efflux of ADR by upregulating P－gp

2.4 miR－106a抑制藥物誘導(dǎo)的細胞凋亡

我們進一步研究了miR－106a對胃癌細胞藥物誘導(dǎo)細胞凋亡的影響。在使用順鉑和5－FU孵化后，檢測了miR－106a變種DNA轉(zhuǎn)染的胃癌細胞凋亡情況。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明在使用順鉑孵育后，miR－106a變種DNA轉(zhuǎn)染的胃癌細胞凋亡百分比（圖4A）顯著下降。使用5－FU孵育的細胞中也有類似的結(jié)果（圖4B）。此外，蛋白質(zhì)印跡（圖4C）表明在miR－106a變種DNA轉(zhuǎn)染的胃癌細胞中，Bcl－2蛋白升高，Bax得到了抑制。這些結(jié)果表明miR－106a能降低SGC7901細胞對藥物誘導(dǎo)的細胞凋亡的敏感度。

2.5 miR－106a通過指向RUNX3調(diào)節(jié)多藥耐藥

我們使用了miRNA靶標(biāo)分析工具Target Scan6.2來篩選miR－106a的潛在目標(biāo)。預(yù)測RUNX3基因是miR－106a的目標(biāo)（圖5A）。為了驗證RUNX3基因是miR－106a的目標(biāo)，我們進行了熒光素酶活性測定。在SGC7901中，使用miR－106a變種DNA或控制變種DNA共轉(zhuǎn)染了野生型RUNX3 3′非編碼區(qū)（WT）的熒光素酶報告質(zhì)?；蛲蛔儯∕ut）。與控制變種DNA對照組相比，使用WT和miR－106a變種DNA共轉(zhuǎn)染的SGC7901細胞中熒光素酶的活性顯著降低，但Mut熒光素酶活性沒有變化（圖5B）。SGC7901細胞中的miR－106a變種DNA轉(zhuǎn)染顯著降低了RUNX3的蛋白水平（圖5C）。這些結(jié)果表明了miR－106a抑制了RUNX3表達。

為探討RUNX3是否調(diào)節(jié)了miR－106a的功能，我們檢測了多藥耐藥胃癌細胞SGC7901／ADR和SGC7901／VCR以及親代細胞系SGC7901中的RUNX3蛋白水平。發(fā)現(xiàn)與SGC7901相比，SGC7901／ADR和SGC7901／VCR細胞中的RUNX3表達顯著降低（圖5D）。此外，我們發(fā)現(xiàn)，RUNX3基因的過度表達可以逆轉(zhuǎn)miR－106a降低胃癌細胞對抗癌藥物敏感性的作用（圖5E）。這些結(jié)果表明了miR－106a可能通過抑制RUNX3表達來誘導(dǎo)胃癌細胞的多藥耐藥。

圖4 miR－106a抑制藥物誘導(dǎo)的細胞凋亡Fig.4 miR－106asuppressed drug－induced cell apoptosis

圖5 miR－106a指向RUNX3調(diào)節(jié)多藥耐藥Fig.5 miR－106amodulated MDR by targeting RUNX3

3 討論

多藥耐藥是胃癌化療失敗最常見的原因之一。最近，一些研究已經(jīng)確定大量miRNA參與了胃癌細胞的多藥耐藥發(fā)展［711］。目前已有數(shù)據(jù)也證明了miR－106a是miR－106a～363群［1213］中最重要的促致癌成分之一，可以通過靶向RUNX3調(diào)節(jié)人類胃癌細胞的多藥耐藥。

人類多藥耐藥細胞系SGC7901／ADR和SGC7901／VCR被廣泛用作胃癌細胞多藥耐藥研究的體外模型，它們是從人類胃腺癌細胞株SGC7901中逐步篩選而來的。mRNA和蛋白表達譜已經(jīng)在SGC7901／VCR及其親本細胞系［1415］之間得到了證實。通過本研究發(fā)現(xiàn)，與SGC7901細胞相比，SGC7901／ADR和SGC7901／VCR細胞中的miR－106a表達增加。此外，受miR－106a變種DNA或抑制劑調(diào)節(jié)的miR－106a可以改變胃癌細胞對化療藥物，如ADR、CDDP和5－FU的敏感性。

P－gp是ATP結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運體之一，由MDR1基因編碼，在胃癌細胞系和腫瘤中表達增加，并且通過增加毒性藥物的外排對胃癌細胞的多藥耐藥發(fā)展起到了至關(guān)重要的作用。抑制P－gp的表達可逆轉(zhuǎn)多藥耐藥［16］。本研究結(jié)果揭示了miR－106a的轉(zhuǎn)染能顯著提高P－gp的表達。此外，補充P－gp抑制劑維拉帕米逆轉(zhuǎn)了miR－106a誘導(dǎo)的ADR釋放指數(shù)的增加，表明P－gp的上調(diào)可能是miR－106a導(dǎo)致藥物外排的原因之一。

多藥耐藥也參加了胃癌細胞逃避凋亡的過程。細胞凋亡的改變可能會影響化療藥物的效率。本研究證實了miR－106a抑制了藥物誘導(dǎo)的胃癌細胞凋亡，在增加抗凋亡分子Bcl－2表達的同時抑制促凋亡分子Bax的表達。這些結(jié)果表明了miR－106a可能通過降低癌細胞對凋亡分子的敏感性來促進胃癌細胞的多藥耐藥。

RUNX3是TGF－β家族通路的下游效應(yīng)物，具有多種功能。RUNX3基因在細胞增殖、粘附和凋亡的調(diào)控中發(fā)揮了重要作用。RUNX3基因缺失的小鼠表現(xiàn)出胃黏膜增生的性狀。此外，在各種惡性腫瘤細胞，如乳腺癌、結(jié)腸直腸癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中觀察到RUNX3的表達降低［1719］。此外，在某些類型的人類中也觀察到了RUNX3的點突變［20］。這些觀察結(jié)果表明，RUNX3基因可能是多種人類腫瘤細胞的抑制因子。Guo等［2122］的報告中指出，RUNX3通過抑制Bcl－2蛋白、MDR1和多藥耐藥相關(guān)蛋白－1（MRP－1）的表達來實現(xiàn)抑癌和化療藥物對胃癌細胞的致敏。Horiguchi等［23］也發(fā)現(xiàn)RUNX3的下調(diào)也通過誘導(dǎo)MRP－1的表達導(dǎo)致胰腺腫瘤對吉西他濱的耐藥。本研究證實了miR－106a抑制RUNX3表達。RUNX3基因在胃癌細胞異位表達可以抑制miR－106a對胃癌細胞多藥耐藥的調(diào)節(jié)作用。這些數(shù)據(jù)表明了miR－106a可能通過指向RUNX3來調(diào)節(jié)胃癌細胞多藥耐藥。

本研究發(fā)現(xiàn)miR－106a在胃癌細胞株多藥耐藥中表達增加，通過加速藥物外排，減少細胞凋亡抑制胃癌細胞對化療藥物的敏感性。此外，本實驗驗證了RUNX3基因是miR－106a在胃癌細胞中的目標(biāo)，表明了miR－106a可能通過調(diào)節(jié)胃癌細胞中的RUNX3來調(diào)節(jié)多藥耐藥，為多藥耐藥機制研究及胃癌治療提供新思路。

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（2014－09－28 收稿）

MiRNA－106a Induces Multidrug Resistance of Gastric Cancer Cells by Targeting RUNX3

Zhang Yi，Cai Xun△，Jin Weidong
Department of General Surgery，Wuhan General Hospital of Guangzhou Military Command，Wuhan 430070，China

Objective To explore the effect of miRNA－106a（miR－106a）expression on multidrug resistance（MDR）of gastric cancer（GC）cells and the involvement of runt－related transcription factor 3RUNX3.Methods The expression of miR－106awas detected in two human gastric adenocarcinoma cell lines with MDR by immunoblotting and apoptosis assay.The sensitivity of GC cells to anticancer drugs was observed by detecting the expression of miR－106aby using immunoblotting and PCR，and the relationship between miR－106aand RUNX3was determined by luciferase activity assay.Results miR－106awas significantly increased in GC cells with MDR，and it suppressed the sensitivity of GC cells to anticancer drugs.It could modulate MDR by targeting RUNX3.Conclusion miR－106acan induce the MDR by targeting RUNX3in GC.

gastric cancer； multidrug resistance； miRNA－106a； runt－related transcription factor 3

R735.2

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.01.008

張 翌，男，1980年生，主治醫(yī)師，E－mail:50823363＠qq.com

△通訊作者，Corresponding author，E－mail:78228013＠qq.com