宮頸癌患者外周血髓源性抑制細胞的比例及其臨床意義＊

韓凌斐，郭曉青，胡家昌，孔繁飛，何拉曼，李 芳，朱建龍，孫 靜

同濟大學附屬第一婦嬰保健院婦科，上海 200040

宮頸癌患者外周血髓源性抑制細胞的比例及其臨床意義＊

韓凌斐，郭曉青，胡家昌，孔繁飛，何拉曼，李 芳，朱建龍△，孫 靜△

同濟大學附屬第一婦嬰保健院婦科，上海 200040

目的 比較分析髓源性抑制細胞（myeloid－derived suppressor cells，MDSCs）在健康人、宮頸上皮內瘤變患者、宮頸癌患者及其術后外周血中的比例，初步探討其臨床意義。方法 采用流式細胞術檢測36例宮頸癌患者、52例宮頸上皮內瘤變患者及20例健康志愿者外周血中MDSCs、調節(jié)性T細胞（Treg）的比例。檢測20例宮頸癌患者術前術后外周血中MDSCs、Treg的比例及MDSCs產生的精氨酸酶和一氧化氮（NO）的變化情況。結果 宮頸癌組外周血中MDSCs、Treg的比例最高，分別為［（3.85±0.85）%，（7.82±1.04）%］，其次是宮頸上皮內瘤變組［（1.52±0.53）%，（3.32± 0.48）%］，健康對照組最低［（0.61±0.17）%，（2.02±0.26）%］，各組間差異均有統計學意義（均P＜0.05）；手術后，患者外周血中MDSCs、Treg的比例明顯下降，MDSCs產生的精氨酸酶和NO下降，與術前比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）。結論 外周血MDSCs比例的升高可能與腫瘤免疫功能低下及宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關。

髓源性抑制細胞； 腫瘤逃逸； 宮頸腫瘤

全球范圍內宮頸癌發(fā)病率在女性惡性腫瘤中居第2位，僅次于乳腺癌，占所有女性惡性腫瘤發(fā)病的13%。據世界衛(wèi)生組織（WHO）報道，全世界每年大約有50萬宮頸癌新發(fā)病例，其中80%的病例發(fā)生在發(fā)展中國家［1］。我國每年新發(fā)病例14萬，約占世界宮頸癌新發(fā)病例的28.8%，為我國婦女生殖道惡性腫瘤的第1位［2］。目前美國食品與藥品管理局（FDA）批準的宮頸癌預防性疫苗已經上市，但該疫苗對宮頸癌前病變和患有宮頸癌的婦女無效，其中重要的原因就是腫瘤抗原產生的免疫逃避現象抑制了機體免疫功能，使腫瘤免疫治療效果欠佳。因此，如何重新激活機體免疫系統，是目前眾多研究者們關注的重點。

髓系來源的抑制細胞（myeloid－derived suppressor cells，MDSCs）是近年研究發(fā)現的一類具有免疫調節(jié)功能的免疫細胞亞群，是參與腫瘤免疫逃逸和免疫耐受的重要機制之一。許多研究表明，多種腫瘤患者外周血和腫瘤組織內出現MDSCs的聚集，這群細胞在腫瘤的免疫逃逸機制中發(fā)揮重要作用［3］。但目前國內外尚缺乏宮頸癌患者MDSCs的研究報道，本研究以健康志愿者、宮頸上皮內瘤變及宮頸癌患者外周血為樣本，觀測MDSCs、Treg比例變化，初步探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集2013年11月至2014年8月期間宮頸癌、宮頸上皮內瘤變患者及健康志愿者外周血標本共108份。根據受試者病理學檢查結果，宮頸癌組36例（31例鱗癌，5例腺癌），宮頸上皮內瘤變組52例（CINⅠ16例，CINⅡ15例，CINⅢ21例），健康組20例。所有受試對象均為首次診斷且未行治療，并已排除伴有其他疾病及服用過特殊藥物。

1.2 主要試劑

PE標記的鼠抗人CD33抗體購自BD公司；FITC標記的鼠抗人CD11b抗體、PECy5標記的鼠抗人HLA－DR抗體、人Treg染色試劑盒及同型對照抗體均購自美國eBioscience公司。精氨酸檢測試劑盒、一氧化氮（Nitric Oxide，NO）檢測試劑盒購自美國BioAssay Systems公司。

1.3 流式細胞術檢測

患者于治療前后分別用抗凝管留取靜脈血4 mL用于流式細胞術檢測。MDSCs檢測:取靜脈血100μL置于流式管中。每管加入熒光標記抗體HLA－DR－PECy5、CD33－PE、CD11b－FITC各2μL，2～8℃孵育30～60min。加入2mL紅細胞裂解液，避光4℃孵育30min，PBS洗滌后適量流式染色緩沖液重懸染色細胞并行流式細胞術分析。Treg檢測:取2mL靜脈血用淋巴細胞分離液收集單核細胞，取100μL細胞懸液，細胞數約為l×106個，按人Treg染色試劑盒說明步驟操作，透化緩沖液洗滌后適量流式染色緩沖液重懸染色細胞并行流式細胞術分析。

1.4 分選CD11 b＋CD33＋HLA－DR－的MDSCs

收集患者靜脈血30mL，分離外周血單個核細胞后用CD11b－FITC，CD33－PE，HLA－DR－PECy5標記染色，BD InfluxTM流式細胞分選儀分選CD11b＋CD33＋HLA－DR－的MDSCs。

1.5 精氨酸酶活性測定

收集分選的2組MDSCs，離心，去上清，加入100μL的細胞裂解液裂解細胞，將裂解液12 000r／min，4℃離心10min，取上清進行精氨酸酶（Arginase）活性的測定，按試劑盒說明步驟操作后，562 nm測定各組反應的吸光度值（A）。按照公式精氨酸酶活性（U／L）＝（A樣本－A對照）／（A尿素－A空白）× 10.4計算樣品精氨酸酶活性。

1.6 一氧化氮濃度測定

收集分選的2組MDSCs于1.5mL離心管中，置于冰上，于4℃預冷的PBS液洗滌2次，收集細胞沉淀，置于冰上。向細胞沉淀中加入150μL細胞裂解液，冰上裂解30min。按試劑盒說明操作后，540 nm測定各組的吸光度值（A）。繪制標準曲線，按照公式c（μmol／L）＝（A樣本－A空白）／0.003計算樣品NO濃度。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 各組MDSCs占外周血單個核細胞（PBMC）比例的變化

如圖1所示，術前宮頸癌組MDSCs比例為（3.85±0.85）%，高于宮頸上皮內瘤變組（1.52± 0.53）%及健康對照組（0.61±0.17）%，而宮頸上皮內瘤變組MDSCs比例又高于健康對照組，各組間差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。

2.2 各組Treg占PBMC比例的變化

如圖2所示，術前宮頸癌組Treg比例為（7.82 ±1.04）%，明顯高于宮頸上皮內瘤變組（3.32± 0.48）%及健康對照組（2.02±0.26）%，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01），而宮頸上皮內瘤變組Treg比例高于健康對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 外周血MDSCs比例與Treg比例的關系

采用Pearson相關分析發(fā)現，外周血中MDSCs比例與Treg比例呈正相關（r＝0.748，P＜0.01）。

2.4 手術治療對宮頸癌患者外周血MDSCs及Treg的影響

圖1 宮頸上皮內瘤變、宮頸癌患者及健康對照者外周血MDSCs比例的比較Fig.1 Comparison of the proportion of MDSCs in the peripheral blood among CIN patients，cervical cancer patients and healthy volunteers

圖2 宮頸上皮內瘤變、宮頸癌患者及健康對照者外周血Treg比例的比較Fig.2 Comparison of the proportion of Treg in the peripheral blood among CIN patients，cervical cancer patients and healthy volunteers

如圖3所示，本研究檢測了20例宮頸癌患者術前及術后30d左右外周血MDSCs及Treg的比例變化。手術前該20例患者MDSCs及Treg細胞占PBMC的比例分別為（3.34±0.52）%，（5.74± 0.13）%，而手術后MDSCs及Treg比例分別下降為（0.73±0.16）%和（2.33±0.45）%，差異均具有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。

圖3 宮頸癌患者術前術后外周血MDSCs、Treg比例的比較Fig.3 Comparison of the proportions of MDSCs and Treg in the peripheral blood in cervical patients before and after operation

2.5 精氨酸酶活性及NO濃度檢測結果

精氨酸酶活性及NO濃度是體現腫瘤相關MDSCs免疫抑制功能的重要指標。如圖4所示，精氨酸酶活性檢測結果顯示，術前宮頸癌組MDSCs所產生的精氨酸酶為（28.48±4.38）U／L，術后組MDSCs精氨酸酶為（8.42±1.92）U／L，較前者顯著降低，兩組間比較差異有統計學意義（P＜0.05）。NO檢測結果顯示術前宮頸癌組MDSCs中NO濃度為（132.45±27.00）μmol／L，術后組MDSCs中NO濃度為（34.78±9.54）μmol／L，兩組間差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖4 宮頸癌患者術前術后外周血MDSCs精氨酸酶活性及NO濃度比較Fig.4 Comparison of argininase activity and nitric oxide production in MDSCs in the peripheral blood in cervical patients before and after operation

3 討論

雖然機體的免疫系統能對某些腫瘤抗原產生免疫應答，并消除部分腫瘤細胞，但仍有一部分原發(fā)性腫瘤在宿主體內生長，并易于轉移和復發(fā)，這些腫瘤能通過多種途徑抑制機體的免疫應答，逃避機體免疫系統的攻擊，實現腫瘤免疫逃逸［4］。近年來的研究發(fā)現，MDSCs在腫瘤組織、淋巴結或血液循環(huán)中的聚集是腫瘤逃避免疫攻擊的一個重要機制［5］，為獲得有效的免疫治療效果，必須消除這些免疫抑制細胞的免疫抑制作用。

MDSCs來源于骨髓祖細胞和未成熟髓細胞，是一類未成熟、異質性的細胞群體，包括髓系前體細胞、不成熟的粒細胞、單核巨噬細胞、樹突狀細胞等，該群細胞約占髓系細胞的1%～5%，可以通過多種途徑抑制機體的獲得性和天然抗腫瘤免疫，使腫瘤細胞逃避機體的免疫監(jiān)視和攻擊，促進腫瘤發(fā)展［4，6］。MDSCs首先從骨髓募集到外周，并在外周被激活后才能發(fā)揮促腫瘤免疫逃逸功能。在腫瘤、炎性反應等病理情況下，均可以檢測到MDSCs在體內的擴增；在腫瘤患者的外周血及腫瘤組織中MDSCs比例均有大幅度的增加，貫穿腫瘤發(fā)生的整個過程，且與腫瘤的大小和惡性程度有一定的相關性［7］。

MDSCs可通過多種機制抑制免疫應答，包括產生精氨酸酶、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）和多種可溶性抑制因子，激活和擴增Treg，部分機制已在癌癥患者中得到證實?；罨腗DSCs能促進2種參與L－精氨酸代謝的酶的產生和增強其活性，這2種酶包括誘導NO產生的iNOS和分解微環(huán)境中精氨酸的精氨酸酶1（ARG－1），通過消耗L－精氨酸，造成精氨酸饑餓的內環(huán)境，從而抑制抗原提呈細胞、T淋巴細胞增殖，在免疫應答和T細胞功能調節(jié)上發(fā)揮作用。此外，MDSCs還能夠誘導Treg的產生，研究發(fā)現多種實體腫瘤和血液惡性腫瘤患者體內Treg比例皆明顯增高，且與患者腫瘤進展程度和預后呈負相關，是腫瘤免疫逃逸和抗腫瘤免疫治療難以成功的重要原因之一［89］。

在小鼠體內，MDSCs被定義為共同表達髓系抗原Gr－1和CD11b的細胞。根據Ly6C和Ly6G的表達，Gr－1＋CD11b＋細胞可進一步分為粒細胞樣MDSCs和單核細胞樣MDSCs兩種亞型［10］。人MDSCs缺少特異性標志物，沒有與小鼠Gr－1對等的抗原，通常采用各種表面分子（CD14、CD15、CD34、CD11b、CD33、Lin和HLA－DR等）的組合界定，因此在不同癌癥患者中得到了各種MDSCs表型［3］。目前普遍認為，人MDSCs表達共同髓系標志物CD33，但不表達成熟髓系標志物HLA－DR［11］。與小鼠一樣，人MDSCs也可分為粒細胞樣和單核細胞樣兩個主要亞群，單核細胞樣MDSCs表達CD14，而粒細胞樣MDSCs表達CD15，兩者都為HLA－DR－／lowCD33＋［1213］。

隨著對人MDSCs了解的增加，越來越多的注意力集中到檢測腫瘤患者外周血循環(huán)MDSCs的臨床意義上。但由于MDSCs在不同腫瘤患者體內的標志物并不完全相同，對機體免疫調節(jié)機制也不是十分清楚。而目前國內外尚缺乏關于宮頸癌MDSCs的研究報道。本研究嘗試采用較嚴格的人MDSCs標志物（HLA－DR－CD33＋CD11b＋），初步探討這群細胞在宮頸癌及癌前病變患者中誘導免疫逃逸的作用。本研究結果顯示，在宮頸上皮內瘤變、宮頸癌患者外周血中MDSCs比例較健康者均有大幅度的增加，可能是腫瘤細胞產生的細胞因子誘導MDSCs前體細胞大量進入外周血并且增殖、分化，抑制機體免疫功能，使機體不能有效地清除體內的腫瘤細胞。

MDSCs行使功能需要經歷兩個階段，第一個階段是MDSCs的擴增和集聚，第二個階段是在腫瘤因子的持續(xù)作用下MDSCs活化形成具有免疫抑制劑功能的細胞。MDSCs的擴增和活化主要受腫瘤細胞、腫瘤基質細胞分泌的多種因子的調節(jié)［1416］。本研究分析比較20例宮頸癌患者手術前后外周血MDSCs比例的變化發(fā)現，手術后患者外周血的MDSCs比例相比術前明顯降低，提示腫瘤負荷除去以后，促使MDSCs前體細胞進入外周血的誘導因素隨之減弱，MDSCs數量逐漸降低；進一步比較術前術后MDSCs細胞所產生的精氨酸酶活性及NO后發(fā)現，術后MDSCs產生的精氨酸酶活性及NO較術前顯著降低，提示宮頸癌患者的MDSCs可能同樣通過調控精氨酸酶活性及NO水平而發(fā)揮免疫抑制功能，這群細胞的免疫抑制功能受體內腫瘤負荷的影響顯著，當腫瘤負荷降低時，其免疫抑制功能隨之下降。

宮頸癌的發(fā)生發(fā)展是一個多階段、多步驟的復雜過程，而機體的免疫系統與這一過程密切相關，因此免疫治療是最有潛力的一種輔助治療措施。近年關于腫瘤免疫和免疫逃逸機制的深入探討發(fā)現，免疫逃逸可能是影響免疫治療療效的主要原因。由于MDSCs在機體免疫調控中的負向調控作用至關重要，我們有理由相信靶向MDSCs進行腫瘤免疫治療的新策略將會給宮頸腫瘤患者帶來福音。

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（2014－09－15 收稿）

High Proportion of Myeloid－derived Suppressor Cells in the Peripheral Blood of Patients with Cervical Cancer and Its Clinical Significance

Han Lingfei，Guo Xiaoqing，Hu Jiachang et al
Department of Gynecology，Shanghai First Maternity and Infant Hospital，Tongji University School of Medicine，Shanghai 200040，China

Objective To investigate the proportion of circulating myeloid－derived suppressor cells（MDSCs）in the peripheral blood of healthy volunteers，patients with cervical intraepithelial neoplasia，patients with cervical cancer before and after operation.Methods Flow cytometry was used to evaluate the proportion of MDSCs and Treg in the peripheral blood of 36patients with cervical cancer，52patients with intraepithelial neoplasia and 20healthy people.The proportions of MDSCs and Treg were evaluated in 20patients with cervical cancer before and after operation as well as the changes of argininase activity and nitric oxide（NO）production.Results The proportions of circulating MDSCs and Tregs were（3.85±0.85）%and（7.82±1.04）%，respectively，in patients with cervical cancer，which was highest among the subjects.Those in patients with cervical intraepithelial neoplasia were（1.52±0.53）%and（3.32±0.48）%，respectively，significantly lower than those in cervical cancer patients but much higher than in healthy volunteers［（0.61±0.17）%，（2.02±0.26）%］.The differences between groups were statistically significant（P＜0.05）.The proportions of MDSCs and Treg were conspicuously decreased，and the argininase activity and nitric oxide production were also reduced in patients with cervical cancer after the operation when compared with those before the operation.The differences were statistically significant（P＜0.05）.Conclusion The increased proportion of MDSCs in the peripheral blood of patients with cervical cancer may closely correlate with the poor antitumor immune function of patients and the development of cervical cancer.

myeloid－derived suppressor cells； tumor escape； cervical cancer

R737.33

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.01.006

＊國家自然科學基金資助項目（No.81001153，No.81372305）；上海市青年科技啟明星計劃資助項目（No.11QA1405200）；上海市衛(wèi)生局資助項目（No.2010Y150，No.20114150，No.20124111）；上海市自然科學基金資助項目（No.15ZR1433300）

韓凌斐，男，1979年生，主治醫(yī)師，E－mail:lingfeihan＠126.com

△通訊作者，Corresponding author，孫靜，E－mail:sunjing＠126.com；朱建龍，E－mail:zhujl999＠126.com