兩親性聚乙烯亞胺修飾量子點(diǎn)構(gòu)建功能性光學(xué)探針用于干細(xì)胞治療的示蹤研究＊

溫 清，劉人愷，王志勇

1廣東醫(yī)學(xué)院附屬南山醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，深圳 518052

2中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院，保羅·C·勞特伯生物醫(yī)學(xué)成像研究中心，深圳 518055

兩親性聚乙烯亞胺修飾量子點(diǎn)構(gòu)建功能性光學(xué)探針用于干細(xì)胞治療的示蹤研究＊

溫 清1，劉人愷1，王志勇2△

1廣東醫(yī)學(xué)院附屬南山醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，深圳 518052

2中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院，保羅·C·勞特伯生物醫(yī)學(xué)成像研究中心，深圳 518055

目的 制備新型分子影像探針標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞熒光成像。方法 應(yīng)用1－碘十二烷修飾聚乙烯亞胺，構(gòu)建兩親性大分子。利用大分子自組裝性能，包裹疏水性核殼結(jié)構(gòu)CdSe／CdS量子點(diǎn)構(gòu)建納米探針。結(jié)果 該探針在630nm處呈現(xiàn)出較強(qiáng)的熒光信號，能夠促使間充質(zhì)干細(xì)胞高效內(nèi)吞。體內(nèi)成像結(jié)果顯示，與空白對照細(xì)胞相比，被標(biāo)記細(xì)胞呈現(xiàn)出顯著的光學(xué)信號，空白組信號值為1.47e8［p／s／cm2／sr］／［μW／cm2］，實(shí)驗(yàn)組信號值為2.78e8［p／s／cm2／sr］／［μW／cm2］。結(jié)論 該納米探針具有良好光學(xué)成像性能，可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞標(biāo)記。

聚乙烯亞胺； 量子點(diǎn)； 熒光成像； 干細(xì)胞治療

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是老年期臨床常見病和多發(fā)病，表現(xiàn)為執(zhí)行功能障礙、記憶力衰退、認(rèn)知功能缺陷等癥狀。其病理改變，主要以神經(jīng)炎性斑、神經(jīng)元纖維纏結(jié)和神經(jīng)元的缺失、死亡為主［1］。目前，臨床用于治療的藥物主要包括膽堿酯酶抑制劑、抗自由基藥物、能量代謝促進(jìn)劑或促智藥物等，雖然藥物能夠延緩病變發(fā)展，但無法彌補(bǔ)腦實(shí)質(zhì)性損傷，因此對于中晚期患者難以取得有效的病理恢復(fù)［2］。近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞（stem cell）表現(xiàn)出低免疫原性、多潛能分化、自我更新以及定向遷移等生物學(xué)特性，能夠?qū)C(jī)體各組織器官的損傷進(jìn)行修復(fù)，這使得干細(xì)胞成為AD治療的新希望［3］。有報(bào)道顯示，干細(xì)胞植入阿爾茨海默病模型大鼠后，模型鼠的海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)目增多，并且移植的干細(xì)胞修復(fù)了原有損傷和壞死的神經(jīng)元細(xì)胞，同時(shí)重建了神經(jīng)通路，結(jié)果表明干細(xì)胞治療后患病大鼠的記憶和學(xué)習(xí)能力均有顯著提高［45］。

雖然干細(xì)胞移植備受矚目，然而觀測細(xì)胞體內(nèi)分布規(guī)律非常困難，這對于疾病的治療評價(jià)造成困擾［5］。隨著分子影像（molecular imaging）技術(shù)的發(fā)展，研究人員采用影像方法，結(jié)合分子探針實(shí)現(xiàn)了對活體狀態(tài)下的組織、細(xì)胞與分子水平的信號采集，完成了針對被檢測目標(biāo)的定性和定量信息分析［6］。其中，運(yùn)用光學(xué)分子影像技術(shù)，通過構(gòu)建光學(xué)分子探針對干細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，能夠?qū)崿F(xiàn)對移植干細(xì)胞的實(shí)時(shí)示蹤，進(jìn)而完成對體內(nèi)干細(xì)胞生物學(xué)行為的無創(chuàng)性高效評估。光學(xué)分子影像需要制備高效的光學(xué)探針，半導(dǎo)體量子點(diǎn)（quantum dots，QDs）是近幾年興起的一種由Ⅱ～Ⅵ族或Ⅲ～Ⅴ族元素組成的準(zhǔn)零維半導(dǎo)體納米晶體，具備特殊的尺寸和界面效應(yīng)，表現(xiàn)出獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)［7］。本研究將使用聚乙烯亞胺（polyethyleneimine，PEI）修飾量子點(diǎn)，構(gòu)建高性能納米探針，實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 Dodecyl－PEI／QDs納米復(fù)合物的制備

依據(jù)文獻(xiàn)合成量子點(diǎn)納米晶體［8］，方法如下:首先制備CdSe核部，而后利用層層晶體生長法構(gòu)建CdSe／CdS核殼結(jié)構(gòu)納米QDs晶體。將制備的QDs分散在三氯甲烷溶液中避光保存。依照項(xiàng)目組先前文獻(xiàn)報(bào)道［9］，應(yīng)用1－碘十二烷（1－iodododecane）對聚乙烯亞胺（PEI）進(jìn)行修飾，構(gòu)建成Dodecyl－PEI大分子。待大分子合成后，取一定量分散在三氯甲烷中的QDs納米晶體，按照QDs與大分子質(zhì)量比1∶2.5的比例，加入所需1－碘十二烷修飾的聚乙烯亞胺（Dodecyl－PEI），將混合物在超聲條件下滴加到水中，利用親疏水作用力自發(fā)形成納米顆粒。將構(gòu)建的納米復(fù)合物溶液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)方法移除三氯甲烷溶劑，得到Dodecyl－PEI／QDs納米探針溶液。針對制得的Dodecyl－PEI／QDs納米探針應(yīng)用動(dòng)態(tài)光散射（Malvern公司，zetasizer NanoZS儀器）、熒光分光光度計(jì)（HITACHI公司，F(xiàn)L7000儀器）、紫外－可見光分光光度計(jì)（Perkin Elmer公司，Lambda儀器）進(jìn)行檢測。

1.2 細(xì)胞標(biāo)記與細(xì)胞影像學(xué)分析

取小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs），應(yīng)用含10%胎牛血清、100U／mL青霉素和100U／mL鏈霉素的α－MEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。待干細(xì)胞傳至第3代時(shí)用于實(shí)驗(yàn)研究。以細(xì)胞密度1×105個(gè)／mL接種到培養(yǎng)瓶中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。24h后換入新鮮培養(yǎng)液，加入Dodecyl－PEI／QDs納米探針（其中QDs濃度20mg／mL），探針與細(xì)胞孵育2h后更換培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)22h后使用PBS緩沖液清洗，應(yīng)用4’，6－二脒基－2－苯基吲哚（4’，6－diamidino－2－phenylindole，DAPI）對細(xì)胞核進(jìn)行染色，將被標(biāo)記細(xì)胞置于激光共聚焦掃描顯微鏡下，對量子點(diǎn)標(biāo)記的MSCs進(jìn)行觀測。

1.3 細(xì)胞標(biāo)記與細(xì)胞影像學(xué)分析

將探針標(biāo)記的MSCs在BALB／c小鼠背部皮下右側(cè)注入；小鼠左側(cè)背部對照組注射空白MSCs。細(xì)胞注射數(shù)目為106個(gè)。細(xì)胞注射后24h應(yīng)用Xenogen IVIS－100系統(tǒng)進(jìn)行小動(dòng)物體內(nèi)熒光成像檢測，成像參數(shù):Ex＝500nm，Em＝620nm。

2 結(jié)果

2.1 QDs納米探針性能分析

疏水性量子點(diǎn)由于其納米尺寸效應(yīng)呈現(xiàn)出特殊的紫外吸收峰和熒光光譜。如圖1所示，QDs具有約6nm尺寸且在可見光光譜圖上613nm處呈現(xiàn)第一吸收峰（圖1A），并且經(jīng)由488nm激發(fā)光激發(fā)于630nm處呈現(xiàn)出顯著的熒光光譜（圖1B）。然而，這些有機(jī)相合成的QDs由于分散在弱極性的三氯甲烷中無法滿足生物學(xué)需求，需要經(jīng)由化學(xué)修飾將有機(jī)相QDs轉(zhuǎn)移至水相中。兩親性Dodecyl－PEI具有極性溶劑（水溶液）中的自組裝效應(yīng)，可以自發(fā)形成以長鏈烷烴構(gòu)建的中心疏水區(qū)域，周圍為親水性氨基的納米膠束結(jié)構(gòu)。在核心的疏水區(qū)域可以有效裝載疏水性QDs，構(gòu)建Dodecyl－PEI／QDs納米探針，該探針的紫外、熒光光譜和原始有機(jī)相中的QDs光譜幾乎相重合，由于兩親性分子的包裹效應(yīng)造成粒度增加到約為8nm（圖1C），且在水溶液中呈現(xiàn)出約＋40mV電壓。利用小動(dòng)物熒光成像檢測，該納米探針具有優(yōu)良的成像性能，即使在QDs濃度為0.001 5mg／mL，仍表現(xiàn)出顯著的光學(xué)信號值（圖1D）。

2.2 QDs納米探針標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞體外檢測

應(yīng)用該納米探針對MSCs進(jìn)行標(biāo)記，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡檢測如圖2所示，通過DAPI對細(xì)胞進(jìn)行染色后細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色光，量子點(diǎn)呈現(xiàn)出紅色光，結(jié)果顯示納米探針主要集中在干細(xì)胞的胞質(zhì)中。

2.3 QDs納米探針標(biāo)記MSCs體內(nèi)檢測

應(yīng)用小動(dòng)物光學(xué)成像儀對注射有MSCs的小鼠進(jìn)行光學(xué)成像，如圖3所示。小鼠皮下雙側(cè)注射有干細(xì)胞，左側(cè)為未標(biāo)記的干細(xì)胞，右側(cè)為使用QDs探針標(biāo)記的干細(xì)胞。成像顯示，被標(biāo)記的干細(xì)胞仍具有有效的光學(xué)效應(yīng)，其成像信號值約為左側(cè)對照組的2倍，空白細(xì)胞光學(xué)數(shù)值為1.47e8［p／s／cm2／sr］／［μW／cm2］，而標(biāo)記細(xì)胞注入部位光信號有所增高，其光學(xué)數(shù)值為2.78e8［p／s／cm2／sr］／［μW／cm2］。

圖1 Dodecyl－PEI／QDs納米探針的光學(xué)性能Fig.1 Optical properties of Dodecyl－PEI／QDs nanoprobes

圖2 被探針標(biāo)記的MSCs激光共聚焦成像Fig.2 Confocal scanning laser microscopy of mesenchymal stem cells labeled with the probes（bar＝25μm）

3 討論

以往研究人員主要依靠活體采樣并結(jié)合組織切片檢測干細(xì)胞治療中細(xì)胞遷移效率和細(xì)胞功能［10］，但是受制于采樣范圍的局限性難以獲取全面而可靠的信息。分子影像技術(shù)的出現(xiàn)，有望對干細(xì)胞治療進(jìn)行無創(chuàng)性探測，并對細(xì)胞的活動(dòng)情況實(shí)時(shí)監(jiān)控。在眾多的分子影像技術(shù)中，熒光分子成像技術(shù)（fluorescence molecular tomography，F(xiàn)MT）具備非電離、無輻射、高通量、高靈敏度及低成本等優(yōu)點(diǎn)。針對干細(xì)胞的熒光成像，需要利用外部光源激發(fā)生物體內(nèi)的熒光標(biāo)記物，能夠獲得成像信號［7］。

目前，實(shí)驗(yàn)中常見熒光標(biāo)記物主要為有機(jī)小分子，然而，由于這些小分子存在激發(fā)光譜窄并且光漂白抗性差，無法滿足細(xì)胞治療的長時(shí)間與高穩(wěn)定性的監(jiān)測要求。相比而言，QDs具有較強(qiáng)的光穩(wěn)定性、寬的激發(fā)譜和窄的發(fā)射譜，并擁有較大的斯托克斯位移和較長的熒光壽命。這些優(yōu)良的光學(xué)成像性能使得QDs在細(xì)胞標(biāo)記與示蹤研究上備受人們關(guān)注。在QDs的應(yīng)用研究中，保持納米粒子的單分散性是制備過程中的一個(gè)難題。利用PEI陽離子高分子對納米晶體進(jìn)行修飾，已經(jīng)在可視化基因／藥物遞送應(yīng)用中得到了廣泛應(yīng)用。PEI是生物學(xué)領(lǐng)域中廣泛使用的陽離子大分子。由于具備伯、仲、叔氨基結(jié)構(gòu)，PEI在水溶液中呈現(xiàn)出正電性，這能夠促進(jìn)與呈負(fù)電的細(xì)胞膜實(shí)現(xiàn)吸附，進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)吞。然而，分子量高的PEI具有較強(qiáng)的正電性可以有效附著在細(xì)胞膜上，但卻具有高細(xì)胞毒性，制約了其臨床應(yīng)用潛能。相比而言，低分子量的PEI細(xì)胞毒性小。

本研究中，利用疏水性烷基基團(tuán)成分修飾低分子量PEI，以此構(gòu)建兩親性分子，借助親疏水自組裝性能，構(gòu)建了一種高電荷密度的納米結(jié)構(gòu)，利用疏水成分形成的內(nèi)核包裹疏水性的QDs。由于該組裝過程為熵驅(qū)動(dòng)下的物理自發(fā)過程，不會(huì)對QDs原有化學(xué)結(jié)構(gòu)造成破壞，因此，相轉(zhuǎn)移前后QDs的物理光學(xué)性質(zhì)未發(fā)生改變（圖1）。由于親水性氨基基團(tuán)暴露于探針表面，使得水溶液環(huán)境中該納米探針呈現(xiàn)出正電性，這有助于在細(xì)胞表面的吸附，促使細(xì)胞內(nèi)吞完成標(biāo)記工作。在激光共聚焦圖片中（圖2），大量的QDs探針出現(xiàn)在細(xì)胞胞質(zhì)中，呈彌散狀分布，被標(biāo)記干細(xì)胞并未表現(xiàn)出萎縮等病態(tài)。應(yīng)用該納米探針標(biāo)記的MSCs通過皮下注射注入小鼠體內(nèi)，經(jīng)小動(dòng)物光學(xué)成像儀掃描，小鼠背部被標(biāo)記MSCs注射部位呈現(xiàn)顯著光學(xué)信號。文獻(xiàn)報(bào)道的經(jīng)由PEI修飾的超順磁四氧化三鐵（SPIO）材料構(gòu)建的磁共振探針，通過標(biāo)記MSCs可以在磁共振下監(jiān)測細(xì)胞存在的部位［11］。

本研究所建立的QDs光學(xué)探針，以及前期報(bào)道的磁共振探針［12］，雖然能夠?qū)崿F(xiàn)被標(biāo)記細(xì)胞所在部位成像，然而，如何監(jiān)測細(xì)胞生存狀態(tài)仍然是個(gè)難題。加之，由于細(xì)胞自身凋亡、代謝、胞吐等生物學(xué)過程，極易造成探針與細(xì)胞的脫離，在圖像上極易形成假陽性結(jié)果。目前，能夠?qū)?xì)胞生存狀態(tài)進(jìn)行檢測的影像學(xué)方法，僅僅有生物發(fā)光成像（Bioluminescence）一種，該方法依據(jù)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的熒光素酶（Luciferase），利用氧和ATP并在外源性底物作用下形成光源［13］。但是，由于該方式需借助具備熒光素酶的細(xì)胞，才能夠?qū)?xì)胞生長及轉(zhuǎn)移等發(fā)展過程進(jìn)行定量、定性觀測。然而，哺乳動(dòng)物并不具備熒光素酶基因，實(shí)驗(yàn)中需要基因改造才能實(shí)現(xiàn)監(jiān)測目的，造成該成像模式的臨床應(yīng)用前景黯淡。未來，針對納米探針考慮利用生物活性成分進(jìn)行成像研究，或許是分子影像的重要發(fā)展方向［1415］。

綜上所述，本研究采用Dodecyl－PEI包裹QDs形成納米復(fù)合物，具有較高的細(xì)胞標(biāo)記效果，并且被標(biāo)記細(xì)胞能夠在小鼠皮下組織中形成光學(xué)成像示蹤效果。該納米顆?？勺鳛闈撛诘墓鈱W(xué)探針，并有望在細(xì)胞治療示蹤方面得到進(jìn)一步應(yīng)用與發(fā)展。

圖3 小動(dòng)物熒光成像Fig.3 Fluorescence imaging of small animals

［1］ Sugaya K，Alvarez A，Marutle A，et al.Stem cell strategies for Alzheimer’s disease therapy［J］.Panminerva Med，2006，48（2）:87－96.

［2］ Braak H，Braak E.Neuropathological staging of Alzheimer－related changes［J］.Acta Neuropathol，1991，82（4）:239－259.

［3］ Lee J K，Jin H K，Bae J S.Bone marrow－derived mesenchymal stem cells reduce brain amyloid－beta deposition and accelerate the activation of microglia in an acutely induced Alzheimer’s disease mouse model［J］.Neurosci Lett，2009，450（2）:136－141.

［4］ Zhan Y，Ma D H，Zhang Y.Effects of cotransplantated Schwann cells and neural stem cells in a rat model of Alzheimer’s disease［J］.Neural Regen Res，2011，6（4）:245－251.

［5］ Lee J K，Jin H K，Endo S，et al.Intracerebral transplantation of bone marrow－derived mesenchymal stem cells reduces amyloid－beta deposition and rescues memory deficits in Alzheimer’s disease mice by modulation of immune responses［J］.Stem Cells，2010，28（2）:329－343.

［6］ Weissleder R.Molecular imaging in cancer［J］.Science，2006，312（5777）:1168－1171.

［7］ Medintz I L，Uyeda H T，Goldman E R，et al.Quantum dot bioconjugates for imaging，labelling and sensing［J］.Nat Mater，2005，4（6）:435－446.

［8］ Li J J，Wang Y A，Guo W Z，et al.Large－scale synthesis of nearly monodisperse CdSe／CdS core／shell nanocrystals using air－stable reagents via successive ion layer adsorption and reaction［J］.J Am Chem Soc，2003，125（41）:12567－12575.

［9］ Liu G，Wang Z Y，Lu J，et al.Low molecular weight alkylpolycation wrapped magnetite nanoparticle clusters as MRI probes for stem cell labeling and in vivoimaging［J］.Biomaterials，2011，32（2）:528－537.

［10］ Kim H M，Qu T，Kriho V，et al.Reelin function in neural stem cell biology［J］.PNAS，2002，99（6）:4020－4025.

［11］ Liu J，Wang L，Cao J，et al.Functional investigations on embryonic stem cells labeled with clinically translatable iron oxide nanoparticles［J］.Nanoscale，2014，6（15）:9025－9033.

［12］ Wan Q，Xie L，Gao L，et al.Self－assembled magnetic theranostic nanoparticles for highly sensitive MRI of minicircle DNA delivery［J］.Nanoscale，2013，5（2）:744－752.

［13］ Wang X L，Rosol M，Ge S D，et al.Dynamic tracking of human hematopoietic stem cell engraftment using in vivo bioluminescence imaging［J］.Blood，2003，102（10）:3478－3482.

［14］ 曹丹，范恒，唐慶，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型體內(nèi)的示蹤研究［J］.華中科技大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2014，43（2）:142－147.

［15］ Kircher M F，Gambhir S S，Grimm J.Noninvasive cell－tracking methods［J］.Nat Rev Clin Oncol，2011，8（11）:677－688.

（2014－07－22 收稿）

Stem Cell Tracking with Amphiphilic Polyethyleneimine Modified Quantum Dots as Functional Optic Probes

Wen Qing1，Liu Renkai1，Wang Zhiyong2△1Department of Neurology，Nanshan Affiliated Hospital of Guangdong Medical College，Shenzhen 518052，China
2Shenzhen Institutes of Advanced Technology，Chinese Academy of Sciences，Paul.C.Lauterbur Research Center for Biomedical Imaging，Shenzhen 518055，China

Objective Stem cell therapy has been extensively used in clinical practice.However，the methods available are unable to non－invasively detect the distribution of cells in vivo.This study was aimed to establish a novel molecular imaging probe for stem cell labeling，which would monitor cells via fluorescence imaging.Methods 1－iodododecane was used to modify polyethyleneimine（PEI）to form amphiphilic macromolecules.These macromolecules encapsulated the hydrophobic quantum dots by self－assembly to form imaging probes.Results Strong fluorescence signals of the probe occurred at 630nm，and the probe could be effectively endocyted by mesenchyme stem cells.In vivo imaging showed that significant optic signals occurred in probe－labeled mesenchyme stem cells compared with the control cells（blank group:1.47e8［p／s／cm2／sr］／［μW／cm2］；test group:2.78e8［p／s／cm2／sr］／［μW／cm2］）.Conclusion The nanoprobes have good optic imaging effects，and can be used to label cells.

polyethyleneimine； quantum dots； fluorescence imaging； stem cell therapy

R329.28

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.01.005

＊深圳市科技計(jì)劃資助項(xiàng)目（No.201203213）

溫 清，男，1965年生，副主任醫(yī)師，E－mail:sznswq＠163.com

△通訊作者，Corresponding author，E－mail:zy.wang＠siat.ac.cn