不同訓(xùn)練方式建立大鼠空間記憶后海馬結(jié)構(gòu)中BDNF表達(dá)的變化＊

于 瑋，謝 雯，羅 禹，張 莉，△

1西安醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，西安 710021

2西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系，西安 710061

3西安交通大學(xué)環(huán)境與疾病相關(guān)基因教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安 710061

不同訓(xùn)練方式建立大鼠空間記憶后海馬結(jié)構(gòu)中BDNF表達(dá)的變化＊

于 瑋1，謝 雯2，羅 禹3，張 莉2，3△

1西安醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，西安 710021

2西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系，西安 710061

3西安交通大學(xué)環(huán)境與疾病相關(guān)基因教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安 710061

目的 研究短期強(qiáng)化訓(xùn)練能否建立可靠的空間長(zhǎng)時(shí)記憶；用不同訓(xùn)練方式建立空間記憶后，大鼠海馬結(jié)構(gòu)中腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）的表達(dá)是否會(huì)發(fā)生變化。方法 利用Morris水迷宮建立大鼠空間短期記憶、長(zhǎng)期記憶和短期強(qiáng)化訓(xùn)練形成的長(zhǎng)期記憶3種模型，用激光共聚焦顯微鏡觀察正常（NC）組、短期記憶（ST）組、長(zhǎng)期記憶組（LT）和短期強(qiáng)化訓(xùn)練形成的長(zhǎng)期記憶（SRT）組大鼠海馬各亞區(qū)的BDNF的分布情況。結(jié)果 Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)中LT組和SRT組間尋找站臺(tái)平均潛伏期和策略差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；記憶檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，LT組大鼠除了在站臺(tái)所在象限的停留時(shí)間明顯長(zhǎng)于SRT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）外，兩組大鼠尋找站臺(tái)潛伏期和策略以及穿越站臺(tái)次數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LT組與NC組及ST組比較，海馬齒狀回和CA1區(qū)的BDNF免疫熒光反應(yīng)明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；SRT組與NC組以及ST組比較，海馬齒狀回和CA1區(qū)的BDNF免疫熒光反應(yīng)明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。LT組與SRT組之間，NC組與ST組之間，海馬各區(qū)的BDNF表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 短期強(qiáng)化訓(xùn)練可建立與長(zhǎng)期訓(xùn)練基本相同的長(zhǎng)期記憶。BDNF與空間長(zhǎng)期記憶的形成密切相關(guān)，其可能不參與空間短期記憶的形成或調(diào)節(jié)。

腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子； 海馬； 學(xué)習(xí)記憶

腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子（brain－derived neurotrophic factor，BDNF）是一個(gè)小的二聚體蛋白質(zhì)，是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族的一員，由其前體蛋白在細(xì)胞內(nèi)高爾基體和（或）非成熟囊泡內(nèi)裂解N端而成為成熟的BDNF［1］，在中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的生存、維持和生長(zhǎng)中起重要的作用［2］。越來越多的證據(jù)表明，BDNF可以調(diào)節(jié)短期突觸功能和活動(dòng)依賴的突觸可塑性，如長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（long－term potentiation，LTP），BDNF還可快速增強(qiáng)海馬神經(jīng)元突觸的傳遞和遞質(zhì)釋放，從而影響學(xué)習(xí)記憶［3］。許多體外實(shí)驗(yàn)已表明，BDNF在海馬LTP的誘導(dǎo)和維持中具有重要作用，提示BDNF在學(xué)習(xí)與記憶中也具有重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，在大腦內(nèi)注入反義BDNF寡核苷酸可以破壞某些形式的長(zhǎng)期記憶的形成［45］；而大腦過度表達(dá)BDNF的轉(zhuǎn)基因小鼠在長(zhǎng)期記憶中也表現(xiàn)出缺陷［6］。也有研究報(bào)道，BDNF突變小鼠在復(fù)合空間任務(wù)訓(xùn)練中表現(xiàn)出學(xué)習(xí)障礙，而在記憶保持上無障礙［7］，因?yàn)榧毙曰蚵源竽X內(nèi)注入BDNF在記憶保持上無任何作用。盡管目前關(guān)于BDNF在學(xué)習(xí)與記憶中的作用尚無統(tǒng)一結(jié)論，但普遍認(rèn)為，BDNF可能參與學(xué)習(xí)和記憶的過程。本研究擬在不同訓(xùn)練方法建立空間記憶的基礎(chǔ)上，研究大鼠海馬結(jié)構(gòu)中BDNF的分布情況，探討其在空間短期記憶、長(zhǎng)期記憶中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 空間記憶模型的建立 利用Morris水迷宮建立記憶模型。水迷宮為一直徑120cm、高55cm的圓形水池，水池內(nèi)壁被漆為黑色，池內(nèi)水深42 cm，水溫保持在（22±1）℃，房間內(nèi)光照恒定，并保證無光線反射在水池內(nèi)。池壁上以4個(gè)等距離點(diǎn)東（E）、南（S）、西（W）、北（N）將水池分為4個(gè)象限，分別稱SW、NW、SE及NE象限，在NE象限正中，距離池壁35cm處放有一個(gè)直徑為8cm，高40cm的圓形透明站臺(tái)，站臺(tái)低于水面2cm。迷宮上方安置著連接顯示系統(tǒng)的攝像機(jī)。大鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡及測(cè)試結(jié)果的顯示和處理均采用中國(guó)科學(xué)院心理研究所研制開發(fā)的動(dòng)物行為學(xué)軟件。訓(xùn)練期間迷宮外參照物保持不變。

Morris水迷宮的測(cè)試主要包括定位航行實(shí)驗(yàn)（Place navigation）和空間探索實(shí)驗(yàn)（Spatial probe test）兩個(gè)部分。定位航行實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)大鼠對(duì)水迷宮學(xué)習(xí)的能力?？臻g探索實(shí)驗(yàn)用于測(cè)試大鼠學(xué)會(huì)尋找站臺(tái)后，對(duì)站臺(tái)空間位置記憶的能力。根據(jù)大鼠在Morris水迷宮中搜索站臺(tái)的游泳軌跡，可判斷其尋找水下站臺(tái)的搜索策略。一般有4種策略方式:直線式（straight）、趨向式（tendency）、邊緣式（marginal）及隨機(jī)式（random）［810］。

直線式以大鼠入水后找到的第1個(gè)點(diǎn)與站臺(tái)之間的連線為中軸，如果大鼠的所有運(yùn)動(dòng)軌跡點(diǎn)與中軸的距離均不超過半徑的15%范圍，且在設(shè)定區(qū)域中運(yùn)動(dòng)的時(shí)間至少占運(yùn)動(dòng)總時(shí)間的70%，則認(rèn)定該運(yùn)動(dòng)策略為直線式。趨向式與直線式的策略相似，但范圍為半徑的50%。邊緣式是以大鼠的運(yùn)動(dòng)區(qū)域中心為圓心，取半徑的75%作一個(gè)圓，如果大鼠70%以上的時(shí)間均在該圓外活動(dòng)，軟件系統(tǒng)則判斷大鼠此次的運(yùn)動(dòng)為邊緣式策略。若大鼠的運(yùn)動(dòng)策略不能歸為以上3種，則系統(tǒng)判定是隨機(jī)式。

本實(shí)驗(yàn)參照Ramirez－Amaya［11］和Meiri［12］等的Morris水迷宮訓(xùn)練方法建立了短期記憶、長(zhǎng)期記憶和短期強(qiáng)化訓(xùn)練3種訓(xùn)練模型。①ST組的訓(xùn)練:即定位航行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)歷時(shí)1d，分2個(gè)時(shí)間段，中間間隔1h，每個(gè)時(shí)間段訓(xùn)練5次，共訓(xùn)練10次，訓(xùn)練時(shí)將大鼠面向池壁放入水中，入水點(diǎn)是假性隨機(jī)的，10次訓(xùn)練將大鼠依次從4個(gè)不同的入水點(diǎn)入水，每次潛伏期的值作為該訓(xùn)練時(shí)段的成績(jī)，記為平均潛伏期，以便和其他兩組進(jìn)行比較。②LT組的訓(xùn)練:即定位航行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)歷時(shí)5d，每天分上、下午兩個(gè)訓(xùn)練段，每段訓(xùn)練5次，共50次。每訓(xùn)練段5次潛伏期的平均值作為該訓(xùn)練段的平均潛伏期。每只大鼠的單次訓(xùn)練操作同ST組。③SRT組的訓(xùn)練:即定位航行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)歷時(shí)1d，與ST組相同。分上、下午兩個(gè)訓(xùn)練段，每段訓(xùn)練25次，共50次。訓(xùn)練總次數(shù)與LT組相同。每相鄰5次訓(xùn)練潛伏期的平均值作為該訓(xùn)練時(shí)段的成績(jī)，記為平均潛伏期，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。每只大鼠的單次訓(xùn)練操作同ST組。以上3組訓(xùn)練中，如果大鼠在60s內(nèi)未找到站臺(tái)，則將其引至站臺(tái)，停留10s，這時(shí)潛伏期記為60s。訓(xùn)練采用大循環(huán)方式，找到站臺(tái)者停留5s。每2次訓(xùn)練的最短間隔時(shí)間為10min。觀察潛伏期，游泳速度，搜索策略。

以上3組大鼠訓(xùn)練結(jié)束后，均進(jìn)行記憶的測(cè)試。ST組在訓(xùn)練結(jié)束后1.5h檢測(cè)其短時(shí)記憶，LT和SRT組在訓(xùn)練結(jié)束后第7天檢測(cè)其長(zhǎng)時(shí)記憶［11］，檢測(cè)內(nèi)容包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)兩部分。定位航行實(shí)驗(yàn):選擇離站臺(tái)最遠(yuǎn)的SW象限為入水點(diǎn)，將大鼠面向池壁放入水中，檢測(cè)其尋找站臺(tái)的潛伏期及搜索策略?？臻g探索實(shí)驗(yàn):在定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束最少10min后進(jìn)行此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。將站臺(tái)撤掉后，選擇SW象限為入水點(diǎn)，將大鼠面向池壁放入水中，觀察并記錄60s內(nèi)動(dòng)物在原站臺(tái)所在象限的停留時(shí)間、穿越原站臺(tái)次數(shù)以及搜索策略。

1.2.2 BDNF的免疫熒光染色 在記憶模型建立好之后，即刻挑選學(xué)習(xí)成績(jī)好的大鼠4只，進(jìn)行免疫熒光染色。動(dòng)物用200g／L氨基甲酸乙酯按9.5 mL／kg進(jìn)行腹腔麻醉，40g／L多聚甲醛灌注固定，取全腦，修塊，入20%蔗糖溶液4℃過夜。次日，冠狀冰凍連續(xù)切片，片厚40μm，采用間接免疫熒光法進(jìn)行BDNF的免疫熒光漂浮染色:0.3%Triton室溫孵育30min；正常羊血清封閉1h；兔抗BDNF抗體（1∶50）孵育72h，4℃；FITC標(biāo)記羊抗兔抗體孵育24h，4℃；甘油碳酸鹽緩沖液封片。封片后立即用Leica激光共聚焦顯微鏡觀察并攝片，全程避光。陰性對(duì)照用PBS替代一抗孵育，其它步驟相同。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

第二年春，將甲樹與乙樹相連處右甲樹的枝鋸掉。（兩棵樹都只有小指粗），（如今，甲樹的新枝（丙）和乙樹都長(zhǎng)到圍粗20cm多了。）本年歲末，發(fā)現(xiàn)甲樹B段接近乙樹的地方長(zhǎng)得很粗，而甲樹B段中點(diǎn)以左部分一點(diǎn)也沒長(zhǎng)粗。

所有數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，ST、LT和SRT組間潛伏期的比較采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)方差分析，站臺(tái)所在象限停留時(shí)間的比較及積分光密度值組間比較采用單因素方差分析，兩組大鼠尋找站臺(tái)所用策略百分?jǐn)?shù)采用Mann－Whitney秩和檢驗(yàn)比較組間差異。數(shù)據(jù)處理應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠空間學(xué)習(xí)能力的比較

2.1.1 大鼠在訓(xùn)練時(shí)逃逸潛伏期的比較 3組動(dòng)物在訓(xùn)練中，均隨著訓(xùn)練時(shí)段的增加，在水中逃逸、尋找平臺(tái)的潛伏期越來越短，整體曲線呈下降趨勢(shì)，直至達(dá)到穩(wěn)定水平。表明接受訓(xùn)練的3組大鼠通過學(xué)習(xí)，均可對(duì)水下的安全逃逸站臺(tái)產(chǎn)生空間定位記憶。各組動(dòng)物在不同訓(xùn)練時(shí)段的潛伏期見圖1A。3組間的平均潛伏期總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），在1、2、3、8、10這5個(gè)時(shí)間段，ST組的潛伏期明顯長(zhǎng)于LT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；在1、2、8、10這4個(gè)時(shí)間段，ST組的潛伏期明顯長(zhǎng)于SRT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05或P＜0.01）；LT組和SRT組間的平均潛伏期差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.1.2 搜索策略的比較 ST組、LT組和SRT組的動(dòng)物在訓(xùn)練中均較多地采用了趨向式和直線式的有效策略。各組動(dòng)物在訓(xùn)練時(shí)的平均搜索策略見圖1B。LT組和ST組相比，4種策略差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），LT組采用趨向式策略和直線式策略較ST組多，而ST組采用邊緣式策略和隨機(jī)式策略較LT組多。ST組和SRT組相比除趨向式策略差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義以外，邊緣式、隨機(jī)式和直線式策略差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），SRT組采用直線式策略較ST組多，而ST組采用邊緣式策略和隨機(jī)式策略較SRT組多。LT組和SRT組相比，4種策略差異均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 各組大鼠訓(xùn)練時(shí)逃逸潛伏期的變化及采用不同搜索策略的百分比Fig.1 Changes of escape latency and the percentage of different target－seeking strategies during training in each group

2.2 各組大鼠空間記憶能力的比較

2.2.1 大鼠搜索站臺(tái)的潛伏期及搜索策略 在訓(xùn)練結(jié)束后1.5h檢測(cè)ST組大鼠的搜索站臺(tái)的潛伏期及搜索策略；在訓(xùn)練結(jié)束后第7天檢測(cè)LT組和SRT組大鼠搜索站臺(tái)的潛伏期及搜索策略，結(jié)果發(fā)現(xiàn):3組動(dòng)物搜索站臺(tái)的平均潛伏期相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）（圖2A），ST組與SRT組比較，其搜索站臺(tái)的平均潛伏期和搜索策略差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）（圖2B），SRT組搜索站臺(tái)的平均潛伏期短，且多使用直線式和趨向式的搜索策略；ST組與LT組比較，其搜索站臺(tái)平均潛伏期和搜索策略差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），LT組搜索站臺(tái)的平均潛伏期短，且多使用直線式和趨向式的有效搜索策略；LT組與SRT組比較，其搜索站臺(tái)的平均潛伏期和搜索策略差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2.2 大鼠穿越站臺(tái)次數(shù)以及在原站臺(tái)所在象限的停留時(shí)間 在訓(xùn)練結(jié)束1.5h后檢測(cè)ST組大鼠穿越站臺(tái)次數(shù)以及在原站臺(tái)所在象限的停留時(shí)間，在訓(xùn)練結(jié)束后第7天檢測(cè)LT組和SRT組大鼠穿越站臺(tái)次數(shù)以及在原站臺(tái)所在象限的停留時(shí)間。結(jié)果發(fā)現(xiàn):3組相比，大鼠穿越站臺(tái)次數(shù)以及在原站臺(tái)所在象限的停留時(shí)間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；ST組和LT組大鼠比較，穿越站臺(tái)次數(shù)以及在原站臺(tái)所在象限的停留時(shí)間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），ST組比LT組大鼠穿越站臺(tái)次數(shù)以及在原站臺(tái)所在象限的停留時(shí)間均少；ST組和SRT組大鼠比較穿越站臺(tái)次數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），但兩組站臺(tái)所在象限停留時(shí)間相比差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LT組比SRT組在站臺(tái)所在象限停留時(shí)間長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），比較兩組間站臺(tái)穿越次數(shù)，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2 C、D）。

圖2 各組大鼠檢測(cè)時(shí)的平均潛伏期、采用不同搜索策略的百分比、穿越站臺(tái)次數(shù)以及站臺(tái)所在象限停留時(shí)間Fig.2 Average latency，percentage of different target－seeking strategies and times of crossing target area and length of stay in each quadrant during detection in each group

2.3 空間記憶對(duì)BDNF表達(dá)的影響

LT組與NC組以及ST組比較，LT組在齒狀回和CA1區(qū)的BDNF的積分光密度明顯增強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；CA3區(qū)的BDNF積分光密度雖有增強(qiáng)，但與NC組及ST組相比差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；SRT組與NC組以及ST組比較，其在齒狀回和CA1區(qū)的BDNF積分光密度明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），CA3區(qū)的BDNF積分光密度雖有增強(qiáng)，但與NC組及ST組相比差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LT組與SRT組比較，海馬各個(gè)亞區(qū)的BDNF積分光密度差異均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；NC組與ST組比較，海馬各個(gè)區(qū)的BDNF積分光密度差異也均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1，圖3～5。

表1 各組大鼠海馬結(jié)構(gòu)BDNF積分光密度（IOD）比較s，n＝4）Table1 The integral absorbance value of BDNF in rat hippocampus in each group（s，n＝4）

表1 各組大鼠海馬結(jié)構(gòu)BDNF積分光密度（IOD）比較s，n＝4）Table1 The integral absorbance value of BDNF in rat hippocampus in each group（s，n＝4）

與NC組比較，＊P＜0.05＊＊P＜0.01；與ST組比較，＃P＜0.05＃＃P＜0.01

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圖3 各組大鼠齒狀回BDNF的免疫熒光染色（標(biāo)尺＝40μm）Fig.3 Immunofluorescence staining for BDNF expression in the dentate gyrus of hippocampus in different groups（Scale bar＝40μm）

圖4 各組大鼠CA1區(qū)BDNF的免疫熒光染色（標(biāo)尺＝40μm）Fig.4 Immunofluorescence staining for BDNF expression in the CA1area of hippocampus in different groups（Scale bar＝40μm）

圖5 各組大鼠CA3區(qū)BDNF的免疫熒光染色（標(biāo)尺＝40μm）Fig.5 Immunofluorescence staining for BDNF expression in the CA3area of hippocampus in different groups（Scale bar＝40μm）

3 討論

3.1 短期強(qiáng)化訓(xùn)練可建立動(dòng)物空間長(zhǎng)時(shí)記憶

經(jīng)典的Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)一般采用4～6個(gè)訓(xùn)練日，訓(xùn)練后可建立空間長(zhǎng)時(shí)記憶［13］。本研究參照Ramirez－Amaya［11］和Meiri等［12］的Morris水迷宮訓(xùn)練方法分別建立大鼠空間長(zhǎng)時(shí)記憶和空間短時(shí)記憶；并使用短時(shí)程、高頻率的短期強(qiáng)化訓(xùn)練方法，試圖建立大鼠的空間長(zhǎng)時(shí)記憶。即在1個(gè)訓(xùn)練日的10個(gè)訓(xùn)練段內(nèi)完成50次訓(xùn)練，然后間隔7d檢測(cè)動(dòng)物對(duì)原站臺(tái)空間位置的記憶能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1個(gè)訓(xùn)練日的短期強(qiáng)化訓(xùn)練可使大鼠建立起與經(jīng)典訓(xùn)練模式中5個(gè)訓(xùn)練日所建立的空間記憶基本相同的長(zhǎng)時(shí)記憶。比較兩組動(dòng)物長(zhǎng)時(shí)記憶的測(cè)試結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩組大鼠的定位航行實(shí)驗(yàn)的潛伏期、搜索策略以及空間探索實(shí)驗(yàn)的穿越原站臺(tái)次數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但LT組大鼠在原站臺(tái)所在象限的停留時(shí)間明顯長(zhǎng)于SRT組。這表明LT組動(dòng)物所建立的空間長(zhǎng)時(shí)記憶略優(yōu)于SRT組。該研究結(jié)果表明，對(duì)大鼠進(jìn)行Morris水迷宮短期強(qiáng)化訓(xùn)練可以建立空間長(zhǎng)時(shí)記憶。提示增加訓(xùn)練頻率可以提高學(xué)習(xí)效率，1個(gè)訓(xùn)練日的強(qiáng)化訓(xùn)練可以用作建立動(dòng)物空間長(zhǎng)時(shí)記憶的訓(xùn)練模式［14］。在學(xué)習(xí)的過程中，訓(xùn)練時(shí)間分布的方式起重要作用，訓(xùn)練的最小時(shí)間間隔對(duì)于所獲得的信息的完全整合是必需的。學(xué)習(xí)后儲(chǔ)存的信息，如不經(jīng)常提取和再鞏固，大部分信息會(huì)隨著時(shí)間而漸漸消失［15］。一定的訓(xùn)練次數(shù)和訓(xùn)練間隔對(duì)于長(zhǎng)期記憶的形成是必需的，本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⑦^程中，各組大鼠每次訓(xùn)練的時(shí)間間隔至少10min，這對(duì)記憶的形成是有效的［1617］。

3.2 BDNF與空間長(zhǎng)期記憶密切相關(guān)

BDNF是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族的主要成員之一，在成年哺乳動(dòng)物大腦中含量較高，尤其是在參與學(xué)習(xí)、記憶、可塑性的腦區(qū)，如海馬和皮層等。藥理學(xué)和基因?qū)W的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)表明，BDNF和TrkB受體的結(jié)合是海馬LTP產(chǎn)生的基礎(chǔ)，BDNF參與海馬LTP的維持。在缺乏BDNF的轉(zhuǎn)基因小鼠，海馬LTP不易產(chǎn)生，在出生后腦前區(qū)缺乏TrkB受體的選擇性敲除小鼠，表現(xiàn)出海馬LTP的減弱和學(xué)習(xí)行為的損害。本研究結(jié)果表明:BDNF在海馬結(jié)構(gòu)的多個(gè)亞區(qū)廣泛表達(dá)，提示BDNF與海馬功能密切相關(guān)。

BDNF在學(xué)習(xí)和記憶中的作用可以通過應(yīng)用抗BDNF抗體等多種方法進(jìn)行研究。敲除年老大鼠BDNF基因后，其體內(nèi)BDNF mRNA的表達(dá)也降低，而且表現(xiàn)出嚴(yán)重的空間學(xué)習(xí)記憶損害，這些說明BDNF對(duì)于空間學(xué)習(xí)是必需的。本研究結(jié)果表明:形成長(zhǎng)期記憶的兩組大鼠盡管其訓(xùn)練方式不同，但海馬結(jié)構(gòu)的齒狀回及CA1區(qū)均有BDNF的顯著高水平表達(dá)，而在NC組和ST組，海馬各區(qū)BDNF的表達(dá)水平無明顯變化。因此本研究表明BDNF與空間長(zhǎng)期記憶的形成密切相關(guān)，可能不參與空間短期記憶的形成或調(diào)節(jié)。Mu等［4］報(bào)道，在水迷宮測(cè)試中，給大鼠腦內(nèi)注入抗BDNF的抗體可引起大鼠空間學(xué)習(xí)的損害，也有研究指出在被動(dòng)回避學(xué)習(xí)中，保持力表現(xiàn)良好的大鼠與保持力表現(xiàn)差的大鼠比較，海馬齒狀回的BDNF mRNA的水平顯著增加［18］。Alonso等［19］研究表明，在抑制性回避訓(xùn)練中，BDNF對(duì)于長(zhǎng)期記憶的形成是必需的。Linnarsson等［7］報(bào)道，用BDNF基因敲除小鼠進(jìn)行Morris水迷宮訓(xùn)練，結(jié)果表明基因敲除鼠與正常鼠相比學(xué)習(xí)能力明顯受損；也有實(shí)驗(yàn)表明，在水迷宮訓(xùn)練的第3天和第6天后，學(xué)習(xí)組和對(duì)照組相比，大鼠海馬的BDNF mRNA水平升高。這些研究結(jié)果均與本研究結(jié)果一致。也有研究表明，在抑制性回避訓(xùn)練中，于訓(xùn)練前給大鼠海馬CA1區(qū)注入抗BDNF抗體可阻斷短期記憶的形成［19］，這表明在該實(shí)驗(yàn)中，BDNF對(duì)于短期記憶的形成是必需的。這個(gè)研究結(jié)果與本研究結(jié)果不同，有可能是BDNF在不同形式的學(xué)習(xí)記憶過程中發(fā)揮作用的通路不相同，也可能與檢測(cè)BDNF水平的時(shí)間不同有關(guān)。

3.3 參與空間長(zhǎng)期記憶的腦區(qū)

Becker等［20］用損毀的方法觀察不同腦區(qū)在空間學(xué)習(xí)記憶中的作用，發(fā)現(xiàn)只要海馬系統(tǒng)完好，大鼠就可精確地完成空間迷宮任務(wù)，在靈長(zhǎng)類動(dòng)物身上也觀察到，海馬損害可以導(dǎo)致空間記憶受損［21］，所以海馬是與空間記憶能力密切相關(guān)的重要腦區(qū)。本研究結(jié)果顯示，形成空間長(zhǎng)期記憶的大鼠海馬齒狀回的顆粒細(xì)胞內(nèi)BDNF顯著高表達(dá)，海馬CA1區(qū)的錐體細(xì)胞內(nèi)BDNF也顯著高表達(dá)；海馬CA3區(qū)的錐體細(xì)胞內(nèi)BDNF未出現(xiàn)表達(dá)水平的改變。以上結(jié)果表明，海馬齒狀回可能是空間長(zhǎng)期記憶形成的關(guān)鍵腦區(qū)，海馬CA1區(qū)也可能參與了空間長(zhǎng)期記憶的形成，海馬齒狀回和CA1區(qū)可能與空間短期記憶關(guān)系不大；海馬CA3區(qū)可能未參與空間短期記憶和空間長(zhǎng)期記憶的形成。Okada等［22］和Nakao等［23］的研究表明，與空間學(xué)習(xí)能力密切相關(guān)的腦區(qū)主要是齒狀回。在被動(dòng)回避訓(xùn)練中，于記憶鞏固之前給大鼠海馬齒狀回內(nèi)連續(xù)5次注入反義BDNF寡核苷酸，可明顯損害大鼠的記憶保持力［19］，用原位雜交的方法發(fā)現(xiàn)，在依賴海馬的某些學(xué)習(xí)過程中，大鼠海馬CA1區(qū)的BDNF出現(xiàn)快速和選擇性表達(dá)［2425］。這些研究結(jié)果與我們的研究結(jié)果一致。但也有研究表明，在抑制性回避訓(xùn)練中，給大鼠海馬CA1區(qū)內(nèi)注入BDNF抗體可阻斷短期記憶的形成，提示海馬CA1區(qū)可能與短期記憶有關(guān)，這與本研究結(jié)果有矛盾，可能與記憶的形式不同有關(guān)。

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（2014－05－15 收稿）

Changes of BDNF Expression in Rat Hippocampus after Establishment of Spatial Memory by Different Trainings

Yu Wei1，Xie Wen2，Luo Yu3et al
1Department of Physiology，Xi’an Medical University，Xi’an 710021，China
2Department of Physiology and Pathophysiology；
3Key Laboratory of Environment and Gene Related Diseases of the Ministry of Education，Medical School of Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710061，China

Objective To investigate whether short reinforcing training can establish stable spatial long－term memory and how the brain－derived neurotrophic factor（BDNF）expression in the hippocampus changes after the establishment of spatial memory with different trainings.Methods Long－term memory was established by spatial short－term memory training（ST group），spatial long－term memory training（LT group）or short reinforcing training（SRT group）in Morris water maze.Laser scanning confocal microscopy was used to observe the distribution of BDNF in each area of the hippocampus in normal control group（NC），ST，LT and SRT groups.Results Morris water maze testing showed that there was no significant difference in the mean latency and the target－seeking strategies between the LT and SRT groups.The examination of the memories following different trainings indicated that the mean latency and the target－seeking strategies as well as the times of crossing the target in LT group were not significantly different from those in SRT group，except that the mean time remaining in the platform quadrant in LT group was significantly longer than that in SRT group（P＜0.05）.The integral absorbance（A）value of BDNF in the dentate gyrus（DG）and CA1area of the hippocampus was significantly increased in LT and SRT groups compared with that in NC and ST groups（P＜0.05or P＜0.01）.In addition，no significant difference in the integral Avalue of BDNF in CA1，CA3and DG of the hippocampus was observed between NC and ST groups or between LT and SRT groups.Conclusion The short reinforcing training can establish long－term spatial memory，which is almost the same as that established by the long－term training.BDNF is closely associated with spatial long－term memory formation and it may not be involved in the formation or regulation of spatial short－term memory.

brain－derived neurotrophic factor； hippocampus； learning and memory

G804.7，R49

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.01.003

＊教育部中國(guó)博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.2013M540760）

于 瑋，女，1978年生，碩士研究生，講師，E－mail:marine＿wei＠163.com

△通訊作者，Corresponding author，E－mail:zhangli1998＠m(xù)ail.xjtu.edu.cn