腺苷酸活化蛋白激酶通過抑制mTOR信號通路緩解糖尿病大鼠腎臟細(xì)胞外基質(zhì)沉積＊

羅 霞，鄧玲艷，許文娟，程黎明

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，武漢 430030

腺苷酸活化蛋白激酶通過抑制mTOR信號通路緩解糖尿病大鼠腎臟細(xì)胞外基質(zhì)沉積＊

羅 霞，鄧玲艷，許文娟，程黎明△

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，武漢 430030

目的 高糖高脂飲食加小劑量鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）誘導(dǎo)大鼠糖尿病模型，尾靜脈注射人重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的截?cái)嗤蛔冃拖佘账峄罨鞍准っ富駻MPK－CA（AMPKα1312，T172D），觀察AMPK基因治療對糖尿病大鼠腎臟的保護(hù)作用并進(jìn)行相關(guān)機(jī)制研究。方法 24只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為糖尿病組（n＝16）和普通飲食組（n＝8），糖尿病組以高糖高脂飲食加小劑量STZ誘導(dǎo)糖尿病模型，8周后再將其隨機(jī)分為兩組，分別經(jīng)尾靜脈導(dǎo)入表達(dá)持續(xù)激活型AMPK－CA的重組腺相關(guān)病毒rAAV2－AMPK－CA和rAAV2－GFP作為對照，觀察12周后處死實(shí)驗(yàn)動物，留取腎臟組織。PAS染色觀察比較各組大鼠腎臟的病理改變，Real－time PCR法檢測各組細(xì)胞外基質(zhì)的mRNA水平變化，Western blot法檢測Ⅳ型膠原蛋白α1（Col4α1）、腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）及磷酸化AMPK、磷酸化的乙酰輔酶A羧化酶（p－ACC）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、磷酸化的mTOR及其下游分子磷酸化水平改變。結(jié)果 與正常對照組（C組）相比，轉(zhuǎn)染rAAV2－GFP組（GFP組）糖尿病大鼠腎臟內(nèi)p－AMPK和p－ACC蛋白水平顯著降低（均P＜0.05）；與rAAV2－GFP組相比，轉(zhuǎn)染rAAV2－AMPK－CA的糖尿病大鼠（CA組）體內(nèi)p－ACC表達(dá)活性顯著升高，腎重／體重、腎小球體積、腎小球系膜基質(zhì)增生等指標(biāo)有明顯改善，細(xì)胞外基質(zhì)纖維連接蛋白（FN）、Col4α1、Col4α5mRNA表達(dá)水平，以及Col4α1、信號分子p－mTOR、磷酸化的真核延伸因子激酶2（p－eEF2K）及磷酸化的起始因子4E結(jié)合蛋白1（p－4EBP1）蛋白表達(dá)水平顯著降低（均P＜0.05）。結(jié)論 rAAV2介導(dǎo)的AMPK－CA基因治療可能通過增加糖尿病大鼠腎臟AMPK活性，抑制mTOR信號通路，緩解基質(zhì)沉積，對糖尿病大鼠腎臟起保護(hù)作用。

腺苷酸活化蛋白激酶； 糖尿病腎??； 雷帕霉素靶蛋白

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病常見而嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，也是西方國家終末期腎臟疾病最主要的病因［1］。腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine 5’－monophosphate－activated protein kinase，AMPK）由1個(gè)催化亞基α（63kD）和2個(gè)非催化亞基β（40kD）、γ（38kD）構(gòu)成［2］。目前有研究表明一些治療糖尿病的藥物，如5－氨基咪唑－4－甲酰胺核糖核苷酸（AICAR）、二甲雙胍等，可激活A(yù)MPK，抑制雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路，從而減少蛋白合成［3－4］，因此我們推測AMPK在治療糖尿病腎病，抑制蛋白合成，緩解腎臟細(xì)胞外基質(zhì)沉積方面起著重要作用。但鑒于這些藥物并非AMPK特異性的激動劑，本研究將以一種無毒、無顯著免疫原性、能介導(dǎo)基因在體內(nèi)長期穩(wěn)定表達(dá)的重組腺相關(guān)病毒為載體，將持續(xù)激活型AMPK基因?qū)胩悄虿〈笫篌w內(nèi)，觀察AMPK對糖尿病的治療作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

表達(dá)持續(xù)激活型AMPKα1312（T172D）基因的質(zhì)粒pcDNA3.1－AMPK－CA，由D.Carling教授（英國倫敦）惠贈；重組腺相關(guān)病毒rAAV2－AMPK－CA包裝由北京本元正陽公司提供技術(shù)支持；鏈脲佐菌素（Sigma，美國）；Bayer血糖檢測儀及試紙；Trizol核酸提取試劑盒（Invitrogen，美國）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas，加拿大）；Real－time PCR試劑盒（Thermo Scientific，美國）；RIPA組織蛋白提取液及蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑（碧云天，中國）；兔抗大鼠單克隆抗體抗β－actin（Santa Cruz，美國）；兔抗大鼠單克隆抗體抗AMPKα、抗p－AMPKα（Thr172）、抗雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、抗phosphmTOR（Ser2448）、抗磷酸化的起始因子4E結(jié)合蛋白1（p－4EBP1，Thr37／46）、抗磷酸化的真核延伸因子激酶2（p－eEF2K，Ser366）、抗磷酸化的乙酰輔酶A羧化酶（p－ACC，Ser79），辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG抗體（Cell Signaling Techology，美國）；兔抗大鼠Ⅳ型膠原蛋白α1（Col4α1）多克隆抗體（武漢博士德公司）；增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑（Pierce，美國）；PVDF膜（Bio－Rad，美國）；SDS－PAGE蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)（Thermo Scientific公司）；Western blot設(shè)備（Bio－Rad公司），其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒?、分組、病毒感染

24只成年雄性SPF級Wistar大鼠購自湖北省疾控中心，體重180～200g，在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物學(xué)部SPF級屏障系統(tǒng)飼養(yǎng)，自由飲食飲水，保持墊料干燥，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為正常組（C組，n＝8）和糖尿病組（n＝16）。糖尿病組高脂高糖飲食（15%脂肪、15%糖、2%膽固醇、0.5%膽酸鈉和67.5%正?；A(chǔ)飼料）喂養(yǎng)4周后尾靜脈單次注射STZ（30mg／kg，用前溶于枸櫞酸－枸櫞酸鈉緩沖液，pH4.5），每2周測定體重、血糖、24h尿蛋白，觀察模型穩(wěn)定性。糖尿病腎病大鼠模型成功的標(biāo)準(zhǔn)包括:①隨機(jī)血糖大于16.7mmol／L；②與正常對照組相比尿蛋白顯著升高。STZ注射加上持續(xù)高脂高糖喂養(yǎng)8周后，糖尿病大鼠模型穩(wěn)定，且出現(xiàn)了明顯的蛋白尿（表1）。將糖尿病腎病大鼠隨機(jī)分為2組，分別經(jīng)尾靜脈注射腺相關(guān)病毒:①轉(zhuǎn)染rAAV2－GFP組（GFP組）:n＝8，高脂高糖飲食＋30 mg／kg STZ＋rAAV2－GFP（1×1012v.g.／mL）；②轉(zhuǎn)染rAAV2－AMPK－CA的糖尿病大鼠（CA組）:n＝8，高脂高糖飲食＋30mg／kg STZ＋rAAV2－AMPK－CA（1×1012v.g.／mL）。重組腺相關(guān)病毒感染12周后，禁食12h，自由飲水，處死動物，留取腎臟標(biāo)本，稱重。腎組織部分保存于10%中性甲醛溶液，部分保存于－80℃冰箱用于后續(xù)檢測。

表1 注射腺相關(guān)病毒治療前各組大鼠生理指標(biāo)（s，n＝8）Table1 Biochemical parameters of rats before rAAV2injection in each groups，n＝8）

表1 注射腺相關(guān)病毒治療前各組大鼠生理指標(biāo)（s，n＝8）Table1 Biochemical parameters of rats before rAAV2injection in each groups，n＝8）

C組:正常大鼠；GFP組:注射rAAV2－GFP的糖尿病大鼠；CA組:注射rAAV2－AMPK－CA的糖尿病大鼠。與C組比較，＊P＜0.05

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1.3 尿蛋白檢測

記錄24h尿量，采用免疫比濁法測定尿總蛋白，嚴(yán)格按Roche Cobas 8000全自動生化分析儀及原裝試劑說明書測定。

1.4 腎臟組織形態(tài)學(xué)觀察及病理評估

腎組織經(jīng)10%中性甲醛溶液固定、石蠟包埋、切片（4μm）、作PAS染色，進(jìn)行鏡下觀察并進(jìn)行病理評估。①腎小球體積:評估腎小球肥大情況，腎小球體積＝（腎小球面積1.5×1.38）／1.01。②系膜／腎小球面積比:每只大鼠隨機(jī)選擇10個(gè)腎小球（至少2張切片），測定PAS陽性染色面積／腎小球面積比值，評估系膜基質(zhì)增生（mesangial matrix expansion）情況。③腎小管損害及腎間質(zhì)纖維化評分采用腎間質(zhì)顯微鏡半定量評分系統(tǒng)（400倍鏡下觀察至少40個(gè)視野）。0級:正常，腎小管無明顯改變，間質(zhì)中無或有少量炎癥細(xì)胞，無纖維組織增生；1級:腎小管上皮細(xì)胞輕度萎縮變性、壞死輕，呈灶狀分布，間質(zhì)少量炎癥細(xì)胞浸潤，纖維組織增生呈小灶狀，影響范圍小于25%；2級:腎小管上皮細(xì)胞中度萎縮變性、壞死輕，呈灶狀分布，炎癥細(xì)胞浸潤，纖維組織中度增生，病變范圍26%～50%；3級:腎小管上皮細(xì)胞萎縮變性、壞死嚴(yán)重，呈片狀分布，大量彌散或聚集成灶的炎癥細(xì)胞浸潤，纖維組織增生呈束狀、多灶或網(wǎng)狀成片，病變范圍大于50%。

1.5 細(xì)胞外基質(zhì)蛋白指標(biāo)mRNA表達(dá)的檢測

取80mg腎臟組織，提取總RNA，紫外分光光度計(jì)定量RNA濃度及純度，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。Real－time PCR檢測細(xì)胞外基質(zhì)蛋白mRNA表達(dá)水平如纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N），膠原蛋白（collagen，Col）Col1α1，Col4α1，Col4α5，層粘連蛋白（lamininγ1）。Real－time PCR由Light Cycler 480系統(tǒng)完成，過程如下:95℃，7min；在95℃10s，60℃15 s條件下40個(gè)循環(huán)，循環(huán)完后溫度升高至95℃作熔解曲線，數(shù)據(jù)采用2－ΔΔCt方法來進(jìn)行分析。

Real－time PCR引物采用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)，NCBI比對其特異性，由Invitrogen公司合成。引物序列分別如下:β－actin，上游:5′－CACCCGCGAGTACAACCTTC－3′，下游:5′－CCCATACCCACCATCACACC－3′；FN，上游:5′－CCGGAGCCTTCACACATCAC－3′，下游:5′－GGTGGTGAAGTCAAAGCGAGT－3′；Col1α1，上游:5′－TCACCTACAGCACGCTTG－3′，下游:5′－GGTCTGTTTCCAGGGTTG－3′；Col4α1，上游:5′－CAACATCCGGCCCTTCATT－3′，下游:5′－GTGGGCTTCTTGAACATCTCG－3′；Col4α5，上游:5′－AGGCGAAATGGGTATGATGG－3′，下游:5′－TAATCCCTGGTAGCCTTTTGG－3′；lamininγ1，上游:5′－AACCGGACCATAGCTGAAGC－3′，下游5′－CATCATCATGTCCTGGTCGG－3′。

1.6 免疫印跡檢測蛋白質(zhì)水平

腎臟組織剪碎后加RIPA裂解液及蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，提取總蛋白，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。Western blot檢測AMPKα，p－AMPKα，p－ACC，mTOR，p－mTOR，p－4EBP1，p－eEF2K，Col4α1，β－actin蛋白表達(dá)水平。過程如下:40μg蛋白加上樣緩沖液煮沸變性，10%或8%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，用含5%小牛血清白蛋白的TBST溶液室溫封閉3h，再分別與特異性蛋白一抗4℃孵育過夜，TBST溶液洗滌后分別與相應(yīng)的二抗室溫孵育2h，TBST溶液洗滌，ECL發(fā)光劑發(fā)光，Bio－Rad成像系統(tǒng)采集圖片，Image－pro plus軟件對圖片進(jìn)行吸光度分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 rAAV2－AMPK－CA能顯著改善糖尿病大鼠腎臟病理變化

光鏡下觀察腎組織PAS染色可見，正常飲食組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)正常，糖尿病大鼠腎小球直徑明顯增大，毛細(xì)血管袢擴(kuò)張呈分葉狀，腎小球系膜基質(zhì)增多，系膜區(qū)擴(kuò)張，腎小球基底膜及囊壁增厚，部分腎小管上皮細(xì)胞空泡變性、脫落，間質(zhì)區(qū)可見大量炎癥細(xì)胞浸潤。與C組相比，GFP組、CA組大鼠的腎重／體重比、腎小球體積、系膜／腎小球面積比、腎小管損害及腎間質(zhì)纖維化評分均有顯著差異。與GFP組相比，CA組腎重／體重比，腎小球體積，系膜／腎小球面積比明顯改善，腎小管損害及腎間質(zhì)纖維化評分沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖1和表2）。

2.2 rAAV2－AMPK－CA介導(dǎo)AMPK－CA在糖尿病大鼠體內(nèi)表達(dá)

乙酰輔酶A羧化酶（ACC）是AMPK下游分子，p－ACC檢測可反映AMPK活性［56］。與對照組（C組）相比，糖尿病大鼠（GFP組和CA組）p－AMPK水平顯著降低，GFP組p－ACC水平顯著降低，CA組p－ACC有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與GFP組相比，CA組p－ACC水平顯著升高，提示AMPK－CA具有生物學(xué)功能，可以提高AMPK的活性（圖2）。

圖1 大鼠腎臟組織PAS染色（×400）Fig.1 PAS staining of kidney tissues of rat（×400）

表2 rAAV2－AMPK－CA治療12周后腎臟病理指標(biāo)評估（ˉx±s，n＝8）Table2 Evaluation of renal pathological parameters of diabetic rats after treatment with rAAV2－AMPK－CA for 12weeks（ˉx±s，n＝8）

圖2 rAAV2－AMPK－CA介導(dǎo)AMPK－CA在糖尿病大鼠體內(nèi)表達(dá)Fig.2 Expression of AMPK－CA in diabetic rats treated with rAAV2－AMPK－CA

2.3 rAAV2－AMPK－CA顯著降低糖尿病大鼠腎組織細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)

與正常對照組相比，GFP組大鼠細(xì)胞外基質(zhì)FN、Col1α1、Col4α1、Col4α5、lamininγ1mRNA顯著升高，與GFP組相比，CA組FN、Col4α1、Col4α5 mRNA表達(dá)顯著降低，Col1α1和lamininγ1雖差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但表現(xiàn)出下降趨勢（表3）。

表3 rAAV2－AMPK－CA治療12周后腎臟細(xì)胞外基質(zhì)蛋白指標(biāo)mRNA表達(dá)降低，n＝8）Table3 Decreased mRNA levels of ECM proteins in rats treated with rAAV2－AMPK－CA for 12weeks，n＝8）

表3 rAAV2－AMPK－CA治療12周后腎臟細(xì)胞外基質(zhì)蛋白指標(biāo)mRNA表達(dá)降低，n＝8）Table3 Decreased mRNA levels of ECM proteins in rats treated with rAAV2－AMPK－CA for 12weeks，n＝8）

Real－time PCR檢測各組腎臟組織細(xì)胞外基質(zhì)mRNA變化。C組:正常大鼠；GFP組:注射rAAV2－GFP的糖尿病大鼠；CA組:注射rAAV2－AMPK－CA的糖尿病大鼠。與C組比較，＊P＜0.05；與GFP組比較，＃P＜0.05

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Western blot檢測結(jié)果顯示，與C組相比，GFP組Col4α1蛋白水平顯著升高；與GFP組相比，CA組Col4α1表達(dá)顯著下降；CA組與C組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3A）。

2.4 rAAV2－AMPK－CA抑制mTOR信號通路

與C組相比，GFP組大鼠p－mTOR、p－eEF2K及p－4EBP1水平顯著升高（均P＜0.05）；CA組較GFP組顯著下降，與C組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3B～D）。提示糖尿病腎病大鼠腎組織中AMPK活性被抑制，導(dǎo)致其下游mTOR信號通路分子（包括peEF2K、p－4EBP1等）活化，促使細(xì)胞外基質(zhì)蛋白合成增加；引入外源性有活性的AMPK，可能通過抑制mTOR信號通路活化，從而減少基質(zhì)蛋白合成，緩解基質(zhì)沉積，減輕腎臟損害。

圖3 rAAV2－AMPK－CA抑制mTOR信號通路降低Col4α1蛋白表達(dá)Fig.3 rAAV2－AMPK－CA suppressed the protein expression of Col4α1by inhibiting the mTOR signaling pathway

3 討論

糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與基因、代謝、血流動力學(xué)等因素改變有關(guān)，其主要的病理學(xué)特征是腎小球肥大和細(xì)胞外基質(zhì)沉積。細(xì)胞外基質(zhì)過度合成和進(jìn)行性沉積導(dǎo)致腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化，最終發(fā)展至腎臟功能衰竭。蛋白質(zhì)的合成，尤其是mRNA的翻譯需要消耗大量能量，AMPK作為重要的能量調(diào)節(jié)器，激活后能夠調(diào)控mRNA翻譯并抑制蛋白質(zhì)的合成。之前也有研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可以通過激活A(yù)MPK的活性而降低腎小球上皮細(xì)胞中纖維連接蛋白的合成，硫化氫（H2S）可以通過激活A(yù)MPK信號分子而抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞外基質(zhì)的合成［78］。因此，AMPK可能在緩解糖尿病基質(zhì)蛋白沉積中起到重要作用。

本實(shí)驗(yàn)中，我們通過尾靜脈注射小劑量STZ加高糖高脂飲食成功地構(gòu)建了糖尿病大鼠模型，糖尿病大鼠體內(nèi)p－AMPK和p－ACC表達(dá)水平大大降低；而將rAAV2介導(dǎo)的持續(xù)激活型AMPK－CA基因?qū)胩悄虿〈笫篌w內(nèi)，p－ACC的表達(dá)水平又有所升高，表明AMPK－CA基因能夠在糖尿病大鼠體內(nèi)穩(wěn)定地表達(dá)，顯著增加AMPK的總活性，可以用于后續(xù)AMPK對糖尿病腎病保護(hù)作用機(jī)制研究。此外，我們還發(fā)現(xiàn)GFP組大鼠腎臟細(xì)胞外基質(zhì)FN、Col1α1、Col4α1、Col4α5和lamininγ1mRNA表達(dá)水平明顯增高，Col4α1蛋白升高趨勢與其mRNA變化趨勢相一致。轉(zhuǎn)染rAAV2－AMPK－CA后Col4α1、Col4α5、Fn mRNA和Col4α1蛋白表達(dá)水平顯著降低。大鼠腎臟的形態(tài)學(xué)分析也提示糖尿病大鼠腎臟系膜基質(zhì)沉積，腎臟肥大較嚴(yán)重，給予AMPK－CA基因治療后基質(zhì)沉積，腎臟肥大得到一定改善。說明AMPK可以抑制細(xì)胞外基質(zhì)的合成，緩解腎臟肥大。

mTOR作為細(xì)胞內(nèi)重要的信號通路，能夠調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成起始和延長階段中一些關(guān)鍵分子如核糖體S6蛋白激酶（S6K），起始因子4E結(jié)合蛋白1（4EBP1）和真核延伸因子激酶2（eEF2K），控制蛋白質(zhì)的合成，其活性改變對糖尿病腎臟結(jié)構(gòu)改變，包括腎小球肥大，基底膜增厚及細(xì)胞外基質(zhì)沉積也起著重要的作用［3，7，9］。AMPK的大多數(shù)生物學(xué)作用是通過抑制mTOR信號通路來實(shí)現(xiàn)的。事實(shí)也表明了抑制LKB1／AMPK信號可以引起mTOR／p70 S6K信號通路的活化從而引起心臟肥大和心功能失常［1011］；AMPK通過抑制mTOR信號通路而抑制肌肉組織中蛋白的合成［4］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖尿病組腎臟組織中mTOR信號通路活化，p－mTOR、p－eEF2K、p－4EBP1蛋白分子的磷酸化水平明顯升高，但經(jīng)AMPK－CA基因治療后mTOR通路中的信號分子的磷酸化水平又明顯降低。這些動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示AMPK可通過mTOR信號通路抑制蛋白質(zhì)合成，減少基質(zhì)沉積，緩解腎臟肥大。

綜上所述，AMPK通過抑制mTOR信號通路減輕細(xì)胞外基質(zhì)沉積，緩解腎臟肥大，對糖尿病腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展具有保護(hù)作用。AMPK及其信號通路極有可能成為治療糖尿病的一個(gè)新的藥理學(xué)靶點(diǎn)。

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（2014－08－27 收稿）

AMP－activated Protein Kinase Alleviates the Accumulation of Renal Extracellular Matrix in Diabetic Rats through Inhibiting mTOR Signaling Pathway

Luo Xia，Deng Lingyan，Xu Wenjuan et al
Department of Laboratory Medicine，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China

Objective To investigate the protective effect of adenosine 5’－monophosphate（AMP）－activated protein kinase（AMPK）on the kidneys of diabetic rats and the involved mechanism after recombinant adeno－associated viruses（rAAVs）encoding constitutively active AMPK－CA（AMPKα1312，T172D）were injected into the diabetic rat models（via tail veins）which were established by using streptozocin（STZ）as well as diets enriched in both glucose and fat.Methods A total of 24male Wistar rats were randomly divided into normal control（n＝8）and experimental groups（n＝16）.Rats in the experimental group were fed on high－glucose and high－fat diets and were injected with STZ to induce diabetes mellitus（DM）.They were allocated to two subgroups randomly after 8weeks.Diabetic rats in the two subgroups were injected with rAAV2expressing AMPK－CA gene（CA subgroup）or GFP gene（GFP subgroup，as controls）through tail veins.Rats were killed and the kidneys removed after another 12weeks.PAS staining was performed to evaluate the renal pathological changes.The expression of extracellular matrix mRNA was detected by Real－time PCR and protein levels of collagenⅣα1（Col4α1），AMPK，p－AMPK，phospho－acetyl－CoA carboxylase（p－ACC），mammalian target of rapamycin（mTOR），p－mTOR and its downstream targets were measured by Western blot.Results The expressions of p－AMPK and p－ACC proteins were significantly declined in GFP subgroup compared with normal control group.rAAV2－AMPK－CA treatment could elevate p－ACC expression and improve the pathological changes of diabetic nephropathy（kidney weight／body weight，mean glomerular volume，mesangial matrix area）in comparison with GFP subgroup.Furthermore，rAAV2－AMPK－CA reversed the mRNA expressions of FN，Col4α1and Col4α5and protein levels of Col4α1，p－mTOR，p－eEF2Kand p－4EBP1which were increased in the GFP group.Conclusion rAAV2－AMPK－CA gene treatment could protect the kidney in diabetic rats by increasing the activity of AMPK in the kidney of diabetic rats，inhibiting the ac－tivation of mTOR signaling pathway and alleviating the extracellular matrix deposition.

adenosine 5’－monophosphate－activated protein kinase（AMPK）； diabetic nephropathy； mammalian target of rapamycin（mTOR）

R692.3

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.01.002

＊國家自然科學(xué)基金（青年基金）資助項(xiàng)目（No.81000331）

羅 霞，女，1988年生，醫(yī)學(xué)碩士，E－mail:luoxiaha＠126.com

△通訊作者，Corresponding author，E－mail:chengliming2002＠163.com