Forskolin激活cAMP信號(hào)通路調(diào)控小鼠心肌成纖維細(xì)胞結(jié)締組織生長(zhǎng)因子的表達(dá)＊

劉 波，黃曉帆，李冬寒，王生偉，杜心靈

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院心血管外科，武漢 430022

論著

Forskolin激活cAMP信號(hào)通路調(diào)控小鼠心肌成纖維細(xì)胞結(jié)締組織生長(zhǎng)因子的表達(dá)＊

劉 波，黃曉帆，李冬寒，王生偉，杜心靈△

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院心血管外科，武漢 430022

目的 研究胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cAMP）水平提高對(duì)小鼠心肌成纖維細(xì)胞（MCFs）表達(dá)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）的影響及其信號(hào)通路。方法 采用出生1周內(nèi)C57BL乳鼠心臟分離培養(yǎng)原代MCFs，第3代MCFs使用腺苷酸環(huán)化酶激活劑Forskolin干預(yù)培養(yǎng)后檢測(cè)細(xì)胞CTGF、蛋白激酶A（PKA）、p44／42絲裂素活化蛋白激酶（MAPK）及磷酸化p44／42MAPK表達(dá)情況。分別給予磷酸化p44／42MAPK抑制劑PD98509及PKA抑制劑Rp－cAMPS阻斷相關(guān)信號(hào)節(jié)點(diǎn)，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PKA、p44／42MAPK、磷酸化p44／42MAPK以及CTGF表達(dá)變化。結(jié)果 Forskolin干預(yù)培養(yǎng)MCFs細(xì)胞后，胞內(nèi)cAMP水平提高，細(xì)胞活力下降，PKA表達(dá)上升，p44／42MAPK總蛋白無(wú)明顯改變，p44／42MAPK磷酸化水平下降，CTGF mRNA及蛋白表達(dá)下降；給予PD98509抑制p44／42MAPK磷酸化后，PKA表達(dá)上升，CTGF mRNA及蛋白表達(dá)下調(diào)；Rp－cAMPS抑制PKA活化后，p44／42MAPK磷酸化水平升高，CTGF mRNA及蛋白表達(dá)上調(diào)。結(jié)論Forskolin可以通過(guò)提高M(jìn)CFs胞內(nèi)cAMP水平抑制CTGF的表達(dá)，其作用信號(hào)通路為高水平cAMP上調(diào)PKA表達(dá)，降低下游p44／42MAPK磷酸化水平，抑制CTGF的表達(dá)。

Forskolin； 環(huán)磷酸腺苷； 結(jié)締組織生長(zhǎng)因子； 心肌成纖維細(xì)胞； 心肌纖維化

心肌梗死（MI）后的過(guò)度纖維化，特別是發(fā)生于非梗死區(qū)的繼發(fā)性纖維化對(duì)于MI后的心功能保護(hù)極為不利，極大增加心功能衰竭的發(fā)生概率［1］。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）是一種在機(jī)體中具有重要生物學(xué)作用的分泌型蛋白，其最為顯著的功能是促進(jìn)膠原合成和纖維化進(jìn)程［2］。CTGF的高表達(dá)與纖維化直接相關(guān)，在MI疾病動(dòng)物模型中，梗死區(qū)及非梗死區(qū)心肌組織均可以檢測(cè)到CTGF的大量表達(dá)［3］。因此抑制CTGF的表達(dá)能有效地抑制MI后的纖維化進(jìn)程。

環(huán)磷酸腺苷（cAMP）作為細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，對(duì)調(diào)控細(xì)胞的多種功能和增殖具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)升高靶細(xì)胞中cAMP水平能選擇性抑制CTGF基因表達(dá)，提高胞內(nèi)cAMP濃度亦能抑制肺成纖維細(xì)胞、腎成纖維細(xì)胞的增殖和膠原合成［47］。心肌成纖維細(xì)胞（MCFs）的活化與MI后心肌纖維化密切相關(guān)，cAMP是否對(duì)MCFs同樣具有抑制作用，目前文獻(xiàn)鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)腺苷酸環(huán)化酶激動(dòng)劑Forskolin提高細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度定向干預(yù)MCFs，以觀(guān)察cAMP對(duì)MCFs增殖活性的影響以及對(duì)CTGF表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，并探討其信號(hào)通路。

1 材料與方法

1.1 主要藥品與試劑

DMEM高糖培養(yǎng)液（HyClone公司）；特級(jí)胎牛血清、0.25%胰蛋白酶（Gibco公司）；Forskolin、PD98509、p44／42絲裂素活化蛋白激酶（MAPK）抗體、磷酸化p44／42MAPK抗體（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所）；重組人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－β1（TGF－β1，PeproTech公司）；小鼠cAMP ELISA試劑盒（上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司）；cAMP依賴(lài)性蛋白激酶抑制劑（Rp－cAMPS，Santa Cruz公司）；兔抗CTGF多克隆抗體（Proteintech Group）；Ⅱ型膠原酶、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）（Sigma公司）；兔抗蛋白激酶A（PKA）多克隆抗體、波形蛋白（Vimentin）單克隆抗體、α－平滑肌肌動(dòng)蛋白（α－SMA）單克隆抗體均購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 MCFs原代分離和培養(yǎng)

出生1周內(nèi)C57BL乳鼠10只（購(gòu)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部），75%乙醇消毒1 min后轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)，快速開(kāi)胸取出心臟，置于4℃預(yù)冷磷酸鹽緩沖液（PBS）中洗盡殘血，剔除心房及心臟結(jié)締組織，保留左心室。將心室組織剪碎，轉(zhuǎn)入50mL無(wú)菌離心管，首次加入0.25%胰蛋白酶37℃軟化組織5min，棄上清。加入等體積0.125%胰蛋白酶及0.1%Ⅱ型膠原酶混合消化液37℃分次振蕩消化，每次10min，靜置1min后留取上清液。重復(fù)分次消化，直到組織塊完全消失。將所有上清液經(jīng)200目細(xì)胞篩過(guò)濾，去除大塊未消化組織，1 500 r／min離心10min，去除上清液，加入完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)90min，去除未貼壁細(xì)胞，獲取MCFs，加入含10%胎牛血清完全培養(yǎng)液繼續(xù)正常培養(yǎng)，取第3代MCFs用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 MCFs免疫熒光鑒定

0.25 %胰蛋白酶消化第2代細(xì)胞，以3×105個(gè)／mL細(xì)胞數(shù)量接種于多聚賴(lài)氨酸包被的圓形載玻片上，置于12孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)，終止細(xì)胞培養(yǎng)，取出爬片，4%多聚甲醛固定20min，PBS漂洗3次。Triton室溫封閉1h，PBS漂洗3次；1%牛血清白蛋白（BSA）封閉30 min。分別滴加1%BSA稀釋的一抗（Vimentin單克隆抗體及α－SMA），4℃過(guò)夜，PBS漂洗3次。滴加1%BSA稀釋的二抗，37℃避光孵育1h后PBS漂洗3次。5μg／mL DAPI染色2min，封片后熒光顯微鏡下觀(guān)察。

1.4 MCFs活力MTT測(cè)定

MCFs以2×104個(gè)／mL細(xì)胞數(shù)量接種于96孔板上，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)吸棄培養(yǎng)液中止培養(yǎng)，各孔加入20μL MTT溶液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱37℃孵育4h后吸棄MTT溶液。各孔加入150μL二甲基亞砜（DMSO）室溫振蕩10min后置于酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀490nm波長(zhǎng)讀取吸光度（A）值。

1.5 MCFs胞內(nèi)cAMP濃度ELISA檢測(cè)

0.25 %胰蛋白酶消化細(xì)胞，1 500r／min離心10 min，收獲細(xì)胞后超聲裂解，獲取上清液，所獲樣品嚴(yán)格按照小鼠cAMP ELISA試劑盒操作說(shuō)明使用酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀于450nm波長(zhǎng)讀取各樣本吸光度值。以標(biāo)準(zhǔn)物濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算各樣本cAMP實(shí)際濃度。

1.6 目的蛋白Western blot檢測(cè)

0.25 %胰蛋白酶消化細(xì)胞，1 500r／min離心10 min后收獲細(xì)胞，提取總蛋白。取50μg總蛋白12%SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳（恒壓115V、135 min），電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜（恒流200mA、轉(zhuǎn)膜時(shí)間90min），使用含5%脫脂奶粉的TBST浸泡PVDF膜，室溫?fù)u床封閉2h。分別加入目的蛋白一抗和GAPDH抗體4℃搖床孵育過(guò)夜。TBST洗滌4次，每次5min。目的蛋白再加入相應(yīng)二抗，GAPDH再加入兔抗GAPDH多克隆IgG抗體，室溫?fù)u床孵育2h，TBST充分洗滌PVDF膜4次，每次5min，ECL發(fā)光試劑顯影，結(jié)果使用凝膠成像分析系統(tǒng)測(cè)定，各條帶與GAPDH的灰度值之比為目的蛋白表達(dá)相對(duì)含量。

1.7 CTGF mRNA RT－PCR檢測(cè)

0.25 %胰蛋白酶消化細(xì)胞，1 500r／min離心10 min后收獲細(xì)胞，使用Trizol試劑盒提取RNA，分光光度計(jì)測(cè)定A260／280，計(jì)算RNA濃度。RT－PCR引物設(shè)計(jì):CTGF正義鏈5′－GGCATCTCCACCCGAGTTAC－3′，反義鏈5′－TTGGCGATTTTAGGTGTCCG－3′，146bp；β－actin正義鏈5′－CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC－3′，反義鏈5′－TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT－3′，240bp。各樣品取等量RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA，反應(yīng)條件42℃60 min，95℃5min。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA行RT－PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件:94℃、預(yù)變性4min，94℃、變性30 s，54℃、退火30s，72℃、延伸25s，30個(gè)循環(huán)，72℃終延伸10min，取出反應(yīng)體系，4℃放置4min。擴(kuò)增完成后，各組取等量擴(kuò)增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，所得圖像進(jìn)行灰度掃描，讀取各條帶吸光度值，以CTGF／β－actin吸光度值之比行半定量分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，組間均數(shù)比較采用成組資料t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀(guān)察及生長(zhǎng)特性

混合酶消化心室組織后，可以得到較多混合細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀(guān)察呈現(xiàn)大小不等的圓形。差速貼壁90min后，大部分MCFs已呈貼壁生長(zhǎng)，去除雜質(zhì)細(xì)胞后，可獲得純度較高的MCFs（圖1）。繼續(xù)培養(yǎng)2d后，細(xì)胞形態(tài)逐漸由圓形變成梭形，無(wú)自發(fā)搏動(dòng)現(xiàn)象。經(jīng)過(guò)2d潛伏期后，細(xì)胞第3天開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞數(shù)量成倍增加；第5天細(xì)胞增殖速率下降，活力降低；第6天細(xì)胞數(shù)量開(kāi)始減少（圖2、3）。

圖1 混合酶消化后原代MCFs分離和培養(yǎng)（×100）Fig.1 Isolating by mixed enzymes and culturing of primary mice cardiac fibroblasts（×100）

圖2 MCFs細(xì)胞生長(zhǎng)數(shù)量曲線(xiàn)Fig.2 The growth curve of MCFs

圖3 MCFs細(xì)胞生長(zhǎng)活力曲線(xiàn)Fig.3 The vitality curve of MCFs

2.2 MCFs免疫熒光鑒定

MCFs是心臟組織中含量較多的細(xì)胞，原代分離后的混合細(xì)胞中除MCFs以外，尚有大量心肌細(xì)胞存在，因兩者貼壁時(shí)間不同，差速貼壁90min后可去除絕大部分心肌細(xì)胞。MCFs與心肌細(xì)胞在光鏡下外形差異不明顯，兩者最大的區(qū)別在于心肌細(xì)胞有規(guī)律的自發(fā)搏動(dòng)，而MCFs無(wú)搏動(dòng)。在特異性標(biāo)記物上，心肌成纖維細(xì)胞表達(dá)Vimentin，不表達(dá)α－SMA（圖4）。

2.3 TGF－β1刺激MCFs高表達(dá)CTGF

CTGF在正常細(xì)胞中表達(dá)較少，使用TGF－β1刺激MCFs可快速高表達(dá)CTGF。采用第3代細(xì)胞，接種于6孔板中，分為正常培養(yǎng)組（A）及TGF－β1刺激組（B）。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)，刺激組中加入TGF－β1（10ng／mL）置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后收獲細(xì)胞，行CTGF Western blot檢測(cè)及CTGF mRNA RT－PCR檢測(cè)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)3次驗(yàn)證。結(jié)果提示MCFs在TGF－β1刺激24h后，CTGF蛋白及mRNA表達(dá)較正常培養(yǎng)組明顯升高（P＜0.05）（圖5）。

圖4 MCFs免疫熒光鑒定（×400）Fig.4 Identification of MCFs by immunofluorescence（×400）

圖5 TGF－β1刺激MCFs后CTGF蛋白及mRNA表達(dá)變化Fig.5 The changes of CTGF protein and mRNA in MCFs stimulated by TGF－β1

2.4 Forskolin提高M(jìn)CFs胞內(nèi)cAMP濃度水平抑制MCFs表達(dá)CTGF

腺苷酸環(huán)化酶激動(dòng)劑Forskolin干預(yù)培養(yǎng)MCFs細(xì)胞，設(shè)立正常培養(yǎng)組（A）、TGF－β1刺激組（B）及TGF－β1＋Forskolin組（C）。MCFs使用Forskolin（12μmol／L）培養(yǎng)30min后，加入TGF－β1（10ng／mL）繼續(xù)培養(yǎng)24h，分別檢測(cè)各組細(xì)胞胞內(nèi)cAMP水平、細(xì)胞活力、CTGF蛋白及CTGF mRNA表達(dá)變化以及PKA、p44／42MAPK、磷酸化p44／42MAPK表達(dá)變化，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)3次驗(yàn)證。結(jié)果提示TGF－β1＋Forskolin組細(xì)胞胞內(nèi)cAMP濃度較正常培養(yǎng)組及TGF－β1刺激組明顯上升（均P＜0.05）（圖6）；細(xì)胞活力MTT檢測(cè)提示TGF－β1＋Forskolin組細(xì)胞活力下降（P＜0.05）（圖7）；CTGF蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)TGF－β1＋Forskolin組較TGF－β1刺激組均出現(xiàn)下調(diào)（均P＜0.05）（圖8），PKA蛋白表達(dá)較TGF－β1刺激組上調(diào)（P＜0.05），p44／42MAPK磷酸化水平較TGF－β1刺激組降低（P＜0.05），p44／42MAPK總蛋白無(wú)明顯改變（P＞0.05）（圖9）。

圖6 各組MCFs胞內(nèi)cAMP濃度變化Fig.6 The changes of intracellular cAMP levels in MCFs in each group

圖7 各組MCFs細(xì)胞活力變化Fig.7 The changes of the viability of MCFs in each group

圖8 Forskolin干預(yù)MCFs后CTGF蛋白及mRNA表達(dá)變化Fig.8 The changes of CTGF protein and mRNA in MCFs treated with Forskolin

圖9 Forskolin干預(yù)MCFs后PKA、p44／42MAPK及磷酸化p44／42MAPK表達(dá)變化Fig.9 The changes of PKA，p44／42MAPK and phospho－p44／42MAPK in MCFs after intervention with Forskolin

2.5 PD98509抑制p44／42 MAPK磷酸化水平后相關(guān)信號(hào)分子表達(dá)變化及CTGF表達(dá)變化

設(shè)立正常培養(yǎng)組（A）、TGF－β1＋Forskolin組（B）及TGF－β1＋Forskolin＋PD98509組（C）。MCFs加入PD98509（5μmol／L）培養(yǎng)1h后，加入Forskolin（12μmol／L）培養(yǎng)30min，繼續(xù)TGF－β1（10ng／mL）培養(yǎng)24h，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)3次驗(yàn)證。結(jié)果顯示PD98509培養(yǎng)組細(xì)胞CTGF蛋白及mRNA較TGF－β1＋Forskolin組下調(diào)（P＜0.05）（圖10），p44／42MAPK磷酸化水平受到抑制（P＜0.05），p44／42MAPK總蛋白無(wú)明顯改變（P＞0.05），PKA表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）（圖11）。

圖10 PD98509干預(yù)MCFs后CTGF蛋白及mRNA表達(dá)變化Fig.10 The changes of CTGF protein and mRNA in MCFs treated with PD98509

圖11 PD98509干預(yù)MCFs后PKA、p44／42MAPK及磷酸化p44／42MAPK表達(dá)變化Fig.11 The changes of PKA，p44／42MAPK and phospho－p44／42MAPK in MCFs after intervention with PD98509

2.6 Rp－cAMPS抑制PKA后相關(guān)信號(hào)分子表達(dá)變化及CTGF表達(dá)變化

設(shè)立正常培養(yǎng)組（A）、TGF－β1＋Forskolin組（B）及TGF－β1＋Forskolin＋Rp－cAMPS組（C）。MCFs加入Rp－cAMPS（10－5mol／L）培養(yǎng)1h后，加入Forskolin（12μmol／L）培養(yǎng)30min，繼續(xù)加入TGF－β1（10ng／mL）培養(yǎng)24h，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)3次驗(yàn)證。結(jié)果顯示Rp－cAMPS培養(yǎng)組細(xì)胞CTGF蛋白及mRNA表達(dá)明顯增加（P＜0.05）（圖12）；PKA表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），p44／42MAPK磷酸化水平上調(diào)（P＜0.05），p44／42MAPK總蛋白無(wú)明顯改變（P＞0.05）（圖13）。

圖12 Rp－cAMPS培養(yǎng)MCFs后CTGF蛋白及mRNA表達(dá)變化Fig.12 The changes of CTGF protein and mRNA in MCFs treated with Rp－cAMPS

圖13 Rp－cAMPS干預(yù)MCFs后PKA、p44／42MAPK及磷酸化p44／42MAPK表達(dá)變化Fig.13 The changes of PKA，p44／42MAPK and phospho－p44／42MAPK in MCFs after intervention with Rp－cAMPS

3 討論

MI后心臟修復(fù)過(guò)程中出現(xiàn)的影響心臟功能的不利心室重塑仍然是一個(gè)值得關(guān)注的重要問(wèn)題。研究提示，MI后梗死區(qū)與非梗死區(qū)纖維化的進(jìn)展和調(diào)控并不相同并且都存在失調(diào)的可能，而導(dǎo)致過(guò)度纖維化，特別是發(fā)生在非梗死區(qū)域心肌的繼發(fā)性間質(zhì)纖維化因心室僵硬度增加、心室順應(yīng)性降低，對(duì)于MI后的心功能保護(hù)極為不利，極大增加了心功能衰竭的發(fā)生概率［1］。因此，抑制心肌纖維化，特別是非梗死區(qū)心肌組織的纖維化對(duì)于抑制MI后不利心室重塑、保護(hù)心臟功能具有積極意義。

CTGF是一種在機(jī)體中具有重要生物學(xué)作用的分泌型蛋白，屬于即刻早期基因CTGF／cyr－61／nov家族（CCN家族），廣泛表達(dá)于心、腦、肺、腎、肝、胎盤(pán)以及皮膚等多種組織器官，在多種生理、病理過(guò)程中起著重要作用［8］。CTGF具有多種生物學(xué)活性，包括參與正常胚胎發(fā)育和分化、促進(jìn)血管生成、介導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)控細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)合成等過(guò)程，但CTGF最為顯著的功能是促進(jìn)膠原合成和纖維化進(jìn)程［9］。作為直接參與纖維化進(jìn)程的重要促纖維化因子，CTGF的高表達(dá)在多種病理過(guò)程中如肝纖維化、腎纖維化、動(dòng)脈粥樣硬化、氣道重塑等均可檢測(cè)發(fā)現(xiàn)［1012］。在MI疾病動(dòng)物模型中，也可檢測(cè)到CTGF高表達(dá)，并且表達(dá)量隨時(shí)間逐漸遞增［13］。

MI后CTGF高表達(dá)是心肌細(xì)胞壞死后梗死區(qū)纖維化重塑的正常保護(hù)性反應(yīng)，對(duì)于保持MI后心臟結(jié)構(gòu)完整，維持心臟泵血功能，具有不可替代的重要意義。然而研究提示，CTGF的表達(dá)在梗死區(qū)瘢痕形成后仍存在持續(xù)高表達(dá)現(xiàn)象，并波及到非梗死區(qū)組織，導(dǎo)致非缺血區(qū)心肌細(xì)胞收縮功能受限，引起心室順應(yīng)性降低［1］。因此抑制MI后CTGF的表達(dá)，降低心肌組織的過(guò)度纖維化，對(duì)于保護(hù)心臟功能具有積極意義。

MCFs作為構(gòu)成心臟結(jié)構(gòu)的主要細(xì)胞之一，其活化而合成的大量細(xì)胞外基質(zhì)以及降解紊亂與MI后心肌纖維化密切相關(guān)，抑制MCFs的活化可以抑制CTGF的表達(dá)，從而抑制纖維化進(jìn)程。cAMP作為細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，對(duì)調(diào)控細(xì)胞的多種功能和增殖有重要作用，研究表明提升靶細(xì)胞中cAMP水平能選擇性抑制CTGF基因表達(dá)［45］，我們?cè)谇捌趧?dòng)物預(yù)實(shí)驗(yàn)中亦發(fā)現(xiàn)，MI后1周小鼠通過(guò)腹腔注射環(huán)磷酸腺苷干預(yù)4周后，通過(guò)Western blot及RT－PCR檢測(cè)均提示梗死區(qū)及非梗死區(qū)CTGF表達(dá)下調(diào)。同時(shí)其他研究發(fā)現(xiàn)高濃度cAMP能抑制肺成纖維細(xì)胞的增殖［6］，因此我們推測(cè)cAMP對(duì)MCFs的增殖活性亦有同樣的抑制作用。

Forskolin可透過(guò)細(xì)胞，通過(guò)激活腺苷酸環(huán)化酶而提高細(xì)胞內(nèi)cAMP含量水平。因CTGF在正常細(xì)胞中表達(dá)較少，本研究中我們使用TGF－β1快速上調(diào)CTGF表達(dá)，再通過(guò)Forskolin干預(yù)MCFs，以觀(guān)察cAMP濃度提高對(duì)MCFs增殖活性及CTGF表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過(guò)Forskolin干預(yù)的細(xì)胞，其增殖活性較正常培養(yǎng)組細(xì)胞降低，同時(shí)Western blot及RT－PCR檢測(cè)均提示CTGF表達(dá)較正常培養(yǎng)組下調(diào)。因此我們認(rèn)為cAMP含量水平提高對(duì)MCFs表達(dá)CTGF具有負(fù)性調(diào)控作用。

CTGF表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制在不同的細(xì)胞類(lèi)型中并不一致，各種調(diào)節(jié)因子對(duì)CTGF的表達(dá)調(diào)節(jié)都是通過(guò)自己獨(dú)特的信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)，任何一個(gè)調(diào)節(jié)因子都可以在不同的細(xì)胞中在不同的水平對(duì)CTGF的基因表達(dá)產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。在人肺成纖維細(xì)胞中，CTGF的表達(dá)主要是通過(guò)JNK信號(hào)通路介導(dǎo)［14］；在平滑肌細(xì)胞中，CTGF的表達(dá)主要通過(guò)p38信號(hào)通路介導(dǎo)［15］；而在人類(lèi)晶狀體上皮細(xì)胞中，CTGF的表達(dá)主要是通過(guò)JAK2／STAT3信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)［16］。研究表明，在TGF－β1誘導(dǎo)的CTGF大量表達(dá)所致的纖維化過(guò)程中，p44／42MAPK信號(hào)通路起著重要作用［17］。在Forskolin干預(yù)MCFs后，我們通過(guò)Western blot檢測(cè)了細(xì)胞中p44／42MAPK總蛋白以及磷酸化p44／42MAPK的表達(dá)水平，結(jié)果提示p44／42MAPK總蛋白在各組中均無(wú)明顯改變，而磷酸化p44／42MAPK的表達(dá)水平在Forskolin干預(yù)組呈現(xiàn)下調(diào)，因此提示在Forskolin提升細(xì)胞內(nèi)cAMP水平抑制MCFs表達(dá)CTGF過(guò)程中，p44／42 MAPK的磷酸化水平發(fā)揮著重要作用。目前研究已證實(shí)，PKA作為cAMP的下游信號(hào)分子，由cAMP所介導(dǎo)的各種效應(yīng)主要通過(guò)激活PKA來(lái)實(shí)現(xiàn)，因此我們也同時(shí)檢測(cè)了PKA的表達(dá)變化，結(jié)果提示PKA表達(dá)水平在Forskolin干預(yù)MCFs后上升。因此我們認(rèn)為PKA、磷酸化p44／42MAPK參與了cAMP對(duì)MCFs表達(dá)CTGF的調(diào)控過(guò)程。

為了確定p44／42MAPK磷酸化水平在調(diào)控CTGF表達(dá)中的作用，我們采用PD98509抑制p44／42MAPK磷酸化水平后觀(guān)察CTGF表達(dá)變化，結(jié)果提示p44／42MAPK磷酸化水平被抑制以后，CTGF mRNA及蛋白表達(dá)均下調(diào)；同時(shí)檢測(cè)PKA的表達(dá)提示PKA表達(dá)水平呈現(xiàn)一定程度的上調(diào)。為了進(jìn)一步明確PKA與p44／42MAPK磷酸化水平之間的關(guān)系，我們采用Rp－cAMPS抑制PKA的表達(dá)，以觀(guān)察p44／42MAPK磷酸化水平的變化，結(jié)果提示PKA表達(dá)水平被抑制后，p44／42 MAPK磷酸化水平呈現(xiàn)上調(diào)，同時(shí)CTGF mRNA及蛋白的表達(dá)水平均上調(diào)。以上結(jié)果提示PKA與p44／42MAPK磷酸化水平之間存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)方式，而CTGF的基因表達(dá)和蛋白合成則受p44／42 MAPK磷酸化水平的正性調(diào)控。

本研究結(jié)果表明，MCFs胞內(nèi)cAMP水平的提高可以抑制MCFs細(xì)胞的活化，降低CTGF的表達(dá)水平，其發(fā)揮作用的信號(hào)通路為高水平cAMP激活PKA的表達(dá)從而抑制下游p44／42MAPK磷酸化水平，降低CTGF mRNA表達(dá)水平，抑制CTGF蛋白的合成。

［1］ Jugdutt B I，Dhalla N S.Cardiac remodeling:Molecular mechanisms［M］.New York:Springer，2013:525－545.

［2］ Ihn H.Pathogenesis of fibrosis:role of TGF－βand CTGF［J］.Curr Opin Rheumatol，2002，14（6）:681－685.

［3］ Dean R G，Balding L C，Candido R，et al.Connective tissue growth factor and cardiac fibrosis after myocardial infarction［J］.J Histochem Cytochem，2005，53（10）:1245－1256.

［4］ Duncan M R，F(xiàn)razier K S，Abramson S，et al.Connective tissue growth factor mediates transforming growth factorβ－induced collagen synthesis:down－regulation by cAMP［J］.FASEB J，1999，13（13）:1774－1786.

［5］ Yu J，Prado G N，Schreiber B，et al.Role of prostaglandin E2 EP receptors and cAMP in the expression of connective tissue growth factor［J］.Arch Biochem Biophys，2002，404（2）:302－308.

［6］ Liu X，Ostrom R S，Insel P A.cAMP－elevating agents and adenylyl cyclase overexpression promote an antifibrotic phenotype in pulmonary fibroblasts［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2004，286（5）:C1089－C1099.

［7］ Heusinger－Ribeiro J，Eberlein M，Wahab N A，et al.Expression of connective tissue growth factor in human renal fibroblasts:regulatory roles of RhoA and cAMP［J］.J Am Soc Nephrol，2001，12（9）:1853－1861.

［8］ Desnoyers L.Structural basis and therapeutic implication of the interaction of CCN proteins with glycoconjugates［J］.Curr Pharm Des，2004，10（31）:3913－3928.

［9］ Gao R，Brigstock D R.Low density lipoprotein receptor－related protein（LRP）is a heparin－dependent adhesion receptor for connective tissue growth factor（CTGF）in rat activated hepatic stellate cells［J］.Hepatol Res，2003，27（3）:214－220.

［10］ Lam S，van der Geest R N，Verhagen N A，et al.Connective tissue growth factor and IGF－I are produced by human renal fibroblasts and cooperate in the induction of collagen production by high glucose［J］.Diabetes，2003，52（12）:2975－2983.

［11］ Burgess J K.Connective tissue growth factor:a role in airway remodelling in asthma？［J］.Clin Exp Pharmacol Physiol，2005，32（11）:988－994.

［12］ Ohnishi H，Oka T，Kusachi S，et al.Increased expression of connective tissue growth factor in the infarct zone of experimentally induced myocardial infarction in rats［J］.J Mol Cell Cardiol，1998，30（11）:2411－2422.

［13］ Utsugi M，Dobashi K，Ishizuka T，et al.C－Jun－NH2－terminal kinase mediates expression of connective tissue growth factor induced by transforming growth factor－β1in human lung fibroblasts［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2003，28（6）:754－761.

［14］ Chowdhury I，Chaqour B.Regulation of connective tissue growth factor（CTGF／CCN2）gene transcription and mRNA stability in smooth muscle cells［J］.Eur J Biochem，2004，271（22）:4436－4450.

［15］ Park S K，Kim J，Seomun Y，et al.Hydrogen peroxide is a novel inducer of connective tissue growth factor［J］.Biochem Biophys Res Commun，2001，284（4）:966－971.

［16］ Hayashida T，Poncelet A C，Hubchak S C，et al.TGF－β1activates MAP kinase in human mesangial cells:A possible role in collagen expression［J］.Kidney Int，1999，56（5）:1710－1720.

［17］ Suzuki H，Uchida K，Nitta K，et al.Role of mitogen－activated protein kinase in the regulation of transforming growth factor－β－induced fibronectin accumulation in cultured renal interstitial fibroblasts［J］.Clin Exp Nephrol，2004，8（3）:188－195.

（2014－10－08 收稿）

Forskolin Regulates the Expression of CTGF in Mouse Cardiac Fibroblasts by Activating the cAMP Signaling Pathway

Liu Bo，Huang Xiaofan，Li Donghan et al
Department of Cardiovascular Surgery，Union Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430022，China

Objective To examine the effects of the increased levels of cyclic adenosine monophosphate（cAMP）on the expression of connective tissue growth factor（CTGF）in mouse cardiac fibroblasts（MCFs）and the related signal transduction pathway.Methods MCFs from the hearts of 1－week－old C57BL mice were isolated and primarily cultured.The expression levels of CTGF，protein kinase A（PKA），p44／42mitogen activated protein kinase（MAPK）and phospho－p44／42MAPK were detected in 3－generation MCFs treated with Forskolin（an activating agent of cAMP），PD98509（an inhibitor of phospho－p44／42MAPK）or Rp－cAMPS（an inhibitor of PKA）.Results The levels of cAMP were increased，the cell viability decreased，the expression levels of PKA and CTGF increased and the expression levels of phospho－p44／42MAPK declined in MCFs treated with Forskolin.The PKA expression levels were increased while the expression levels of CTGF decreased in MCFs treated with PD98509.RpcAMPS could inhibit the expression of PKA，and upregulate the expressions of phospho－p44／42MAPK and CTGF.Conclusion Forskolin can inhibit the CTGF expression levels by increasing the intracellular level of cAMP.The involved mechanism is that high levels of cAMP upregulate the PKA expression level，reduce the phosphorylation level of the downstream target p44／42 MAPK and inhibit the CTGF expression.

Forskolin； cyclic adenosine monophosphate； connective tissue growth factor； cardiac fibroblasts； myocardial fibrosis

R542.2

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.01.001

＊教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)科研基金資助項(xiàng)目（No.2011014 2110009）

劉 波，男，1986年生，博士研究生，E－mail:liubo2012＠126.com

△通訊作者，Corresponding author，E－mail:xinlingdu＠hust.edu.cn