C型凝集素CLEC4M對(duì)HCVcc易感性的影響

朱婷 聶青和 王媛媛 高祿化 龍振晝 李汨

目前，對(duì)于丙型肝炎尚無(wú)有效的預(yù)防性疫苗［1］。由于細(xì)胞受體是HCV入侵宿主細(xì)胞的門(mén)戶(hù)，是抗病毒藥物最佳靶點(diǎn)之一。因此，HCV受體一直是研究熱點(diǎn)，它對(duì)于今后有效控制HCV感染及其藥物的研發(fā)具有重要意義［2］。HCV受體主要包括CD81、B族I型清道夫受體（scavenger receptor class B typeI，SRBI）、緊密連接蛋白家族、低密度脂蛋白受體（low density lipoprotein receptor，LDLR）、樹(shù)突狀細(xì)胞特異性細(xì)胞間黏附分子－3－結(jié)合非整合素分子（DCSIGN）等［3］。研究表明，C型凝集素CLEC4M可能是介導(dǎo)HCV入胞的重要分子［4］。為此，本研究構(gòu)建了GV166－CLEC4M慢病毒載體，使其在 Huh7.5細(xì)胞過(guò)表達(dá)，獲得穩(wěn)定過(guò)表達(dá)CLEC4M的細(xì)胞系，應(yīng)用HCV體外培養(yǎng)系統(tǒng)，即體外培養(yǎng)的 HCV（cell cultured HCV，HCVcc）感染過(guò)表達(dá) CLEC4M 的Huh7.5細(xì)胞，了解CLEC4M的表達(dá)對(duì)HCVcc易感性的影響。

資料和方法

一、材料

人肝癌細(xì)胞系Huh－7.5細(xì)胞、包含HCV全長(zhǎng)序列的載體pFL－J6/JFH 由本室保存，GV166－CLEC4M慢病毒載體由本室構(gòu)建并保存；DMEM、胰蛋白酶、FBS、NEAA購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；XBaI購(gòu)自立陶宛MBI Fermentas公司、蛋白酶 K、RNA Marker RL 5000為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品；PageRulerTM 蛋白marker購(gòu)自中國(guó)Fermentas公司；GenEluteDNA純化試劑盒為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；PureLink質(zhì)粒小量提取試劑盒為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品；T7 AmpliScribe體外轉(zhuǎn)錄試劑盒為美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品；RNeasy RNA Mini Kit為德國(guó)Qiagen公司產(chǎn)品，抗GFP多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司，鼠抗人CLEC4M抗體、兔抗人HCV NS5a抗體、山羊抗兔IgG抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，HCV熒光定量試劑盒購(gòu)自深圳凱杰生物工程有限公司。

二、方法

（一）HCVcc的培養(yǎng)及感染測(cè)定 參照文獻(xiàn)［5］。將 HCV pFL－J6/JFH－1（2a基因型）質(zhì)粒10μL（濃度200 ng/μL），加入限制性?xún)?nèi)切酶 XbaI 2μL，37℃水浴，酶切3.5 h，使質(zhì)粒線性化。按照GenElute DNA純化試劑盒操作說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行線性化DNA純化。采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA純化后的濃度。按照Thermo Scientific TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit操作說(shuō)明對(duì)DNA模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，然后按照Qiagen RNeasy試劑盒操作說(shuō)明，純化RNA產(chǎn)物，測(cè)定濃度，分裝。提前將Huh7.5細(xì)胞鋪至6孔培養(yǎng)板中，顯微鏡下觀察融合度達(dá)80%左右時(shí)，將Huh7.5細(xì)胞培養(yǎng)上清棄去，用DMEM洗滌。提前對(duì)Opti－MEM和轉(zhuǎn)染試劑DMRIE－C進(jìn)行混勻，待細(xì)胞準(zhǔn)備好時(shí)加入6孔培養(yǎng)板中，并設(shè)置對(duì)照孔（只加入Opti－MEM）。37℃，體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2孵箱內(nèi)，培養(yǎng)4 h后，將轉(zhuǎn)染液倒掉，加入2 mL完全培養(yǎng)基，繼續(xù)37℃培養(yǎng)16 h～24 h后，收集培養(yǎng)上清，3500 r/min，離心10 min，0.2μm 濾器過(guò)濾，采用實(shí)時(shí)定量PCR和間接免疫熒光法檢測(cè)感染性，分裝，待用。

（二）穩(wěn)定過(guò)表達(dá)GV166－CLEC4M的 Huh7.5細(xì)胞系的建立 GV166－CLEC4M慢病毒載體的構(gòu)建相關(guān)方法參見(jiàn)文獻(xiàn)［6］。用制備好的GV166－CLEC4M和GV166－空載體共同轉(zhuǎn)染 Huh7.5細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前12 h～24 h按1.5×105個(gè)/孔將 Huh7.5細(xì)胞接種到6孔培養(yǎng)板；當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)30%～50%后，去除培養(yǎng)液，加入 MOI為50的稀釋后的GV166－CLEC4M 和GV166－空載體病毒液1 mL，同時(shí)加入Polybrene，終濃度為8 mg/L，37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后8 h去除含有病毒的培養(yǎng)基，加入新鮮的完全培養(yǎng)基，置37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后24 h，加入G418（600μg/mL）進(jìn)行篩選。篩選3 d后換液，將G418濃度調(diào)整為600 ng/mL 和300μg/mL；培養(yǎng)7 d，換完全培養(yǎng)基于37℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱培 養(yǎng)，分 別 命 名 為 Huh7.5－CLEC4M、Huh7.5－GV166。

（三）Western印跡和RT－PCR檢測(cè)Huh7.5細(xì)胞上GV166－CLEC4M的表達(dá) Western印跡方法以GAPDH為內(nèi)參照物，分別提取原始Huh7.5細(xì)胞、Huh7.5－CLEC4M細(xì)胞蛋白，用BCA測(cè)定試劑盒取上清測(cè)蛋白濃度，每個(gè)樣本蛋白終濃度調(diào)整為2μg/μL，－80℃保存?zhèn)溆谩?種蛋白各取2.0g樣品蛋白經(jīng)12%聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉的封閉液，室溫封閉2 h。加入1∶100抗CLEC4M一抗，1∶5 000的GAPDH，4℃孵育過(guò)夜，TBS/T洗膜，共3次，每次5 min。加入二抗室溫孵育2 h，TBS/T洗膜，共3次，每次5 min。封口，壓片，顯 影 后 讀 片。RT－PCR 檢 測(cè)：參 照CLEC4M（Genbank注冊(cè)號(hào)為NM－014257）核苷酸序列，上游引物：5′－AATTCCGTGGTGTTGTCG－3′；下游 引 物：5′－AAGGTCCGCTGGATTGAG－3′。 提 取Huh7.5－CLEC4M、Huh7.5－GV166，原始 Huh7.5細(xì)胞的總RNA，RevertAiD反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈，加入CLEC4M上游及下游引物，以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸5 min，40個(gè)循環(huán)，72℃10 min。RT－PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳。

（四）CLEC4M表達(dá)與HCVcc結(jié)合實(shí)驗(yàn)及競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn) 結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞共分為3組，陽(yáng)性對(duì)照組：Huh7.5－CLEC4M＋HCVcc病毒液；陰性對(duì)照組：Huh7.5－GV166＋ HCVcc病毒液；空白對(duì)照組：Huh7.5－CLEC4M＋5%DMEM。競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞共分為4組，陽(yáng)性對(duì)照組：Huh7.5－CLEC4M＋HCVcc病毒液；單克隆抗體干擾組：Huh7.5－CLEC4M＋鼠抗人CLEC4M單克隆抗體＋HCVcc病毒液；甘露聚糖干擾組：Huh7.5－CLEC4M＋甘露聚糖＋HCVcc病毒液?？瞻捉M對(duì)照組：Huh7.5－CLEC4M＋5%DMEM。干擾組在加入HCVcc病毒液前，分別加入鼠抗人CLEC4M單克隆抗體和甘露聚糖進(jìn)行干預(yù)，其余兩組加入同體積的PBS。

（五）免疫熒光檢測(cè)CLEC4M對(duì)HCVcc的易感性的影響 感染48 h后取出12孔板中提前放置的蓋玻片，放入4%多聚甲醛固定，4℃，30 min，PBS漂洗3遍，每次3～5min，然后過(guò) ddH2O。加入0.2%TrionX－100室溫透化10 min，PBS漂洗3遍，每次5 min，過(guò)ddH2O。37℃，5%BSA溶液封閉1 h，PBS漂洗3遍，每次5 min，過(guò)ddH2O。加入HCV NS5a抗體，4℃，過(guò)夜。加入Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗兔IgG，37℃ 濕育1 h，PBS漂洗漂洗5遍，每次5 min，過(guò)ddH2O。50%甘油封片后，在熒光顯微鏡下觀察、拍照。

（六）實(shí)時(shí)PCR 加入病毒液繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，洗凈未結(jié)合的病毒，換取新鮮的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，分別收集24 h上清液，進(jìn)行熒光定量PCR，檢測(cè)感染細(xì)胞的HCV RNA含量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、過(guò)表達(dá)GV166－CLEC4M 的 Huh7.5細(xì)胞的檢測(cè)

（一）Western印跡檢測(cè) Huh7.5－CLEC4M 的表達(dá) 經(jīng)檢測(cè)穩(wěn)定過(guò)表達(dá)GV166－CLEC4M的Huh7.5細(xì)胞，可在相對(duì)分子質(zhì)量為46×103處有特征性條帶，其大小和目的基因融合蛋白相吻合。而原始Huh7.5細(xì)胞未見(jiàn)特征性條帶（圖1）。說(shuō)明經(jīng)轉(zhuǎn)染后Huh7.5細(xì)胞穩(wěn)定過(guò)表達(dá)GV166－CLEC4M。

（二 ）RT－PCR 檢 測(cè) Huh7.5 細(xì) 胞 上 GV166－CLEC4M的表達(dá)

提取各類(lèi)細(xì)胞總RNA，經(jīng)RT－PCR檢測(cè)，過(guò)表達(dá)CLEC4M的Huh7.5細(xì)胞在1 200 bp可見(jiàn)明顯條帶，而空載體和原始Huh7.5細(xì)胞在此位置未見(jiàn)條帶。說(shuō)明轉(zhuǎn)染后的Huh7.5可以過(guò)表達(dá)CLEC4M（圖2）。

二、免疫熒光檢測(cè)CLEC4M對(duì)HCVcc的易感性的影響

間接免疫熒光染色后，陽(yáng)性對(duì)照組的熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于單克隆抗體干擾組和甘露聚糖干擾組?？瞻讓?duì)照組未見(jiàn)黃綠色熒光（圖3）。

圖1 Western印跡檢測(cè)Huh7.5－CLEC4M表達(dá)

圖2 RT－PCR檢測(cè) Huh7.5細(xì)胞 GV166－CLEC4M

圖3 CLEC4M對(duì)HCVcc的易感性影響的免疫熒光結(jié)果（×50）

三、RT－PCR

各組細(xì)胞經(jīng)最后一次清洗液RT－PCR檢測(cè)結(jié)果為陰性，說(shuō)明已將未結(jié)合的HCV洗脫，排除了未結(jié)合的HCVcc造成的影響。熒光定量PCR檢測(cè)HCV RNA水平，結(jié)果顯示，陽(yáng)性對(duì)照組比陰性對(duì)照組HCVcc易感性明顯增強(qiáng)。陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組相比，對(duì)HCVcc易感性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4）。競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)中，陽(yáng)性對(duì)照組HCVcc易感性明顯增高，單克隆抗體干擾組和甘露聚糖干擾組與陽(yáng)性對(duì)照組相比，其對(duì)HCVcc易感性較低。而各組水平均較空白對(duì)照組高（圖5）。

圖4 CLEC4M表達(dá)與HCVcc結(jié)合實(shí)驗(yàn)熒光定量PCR結(jié)果

圖5 CLEC4M表達(dá)與HCVcc競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)熒光定量PCR結(jié)果

討 論

C型凝集素CLEC4M（又稱(chēng)DC－SIGNR），是一種外源C型植物凝素的Ⅱ型跨膜蛋白，與DC－SIGN具有同源的基因及蛋白結(jié)構(gòu)，由7個(gè)外顯子、6個(gè)內(nèi)含子組成［7］。與DC－SIGN不同的是，CLEC4M 專(zhuān)一地、大量地選擇性表達(dá)于成熟和未成熟的肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴竇內(nèi)皮細(xì)胞及胎盤(pán)毛細(xì)血管［8－9］。胞外區(qū)C端包含一個(gè)糖基結(jié)合位點(diǎn)，可通過(guò)鈣離子依賴(lài)方式與病毒糖基結(jié)合，其N(xiāo)末端相連高甘露糖寡糖，通過(guò)高甘露糖寡糖對(duì)sE2有高度親和力。其天然配體為ICAM－3，主要表達(dá)于T淋巴細(xì)胞上，加工提呈的抗原可以被大量的T淋巴細(xì)胞受體所識(shí)別，為早期與CLEC4M的相互作用奠定了基礎(chǔ)［10］。

HCV入胞是一個(gè)多因素參與的復(fù)雜過(guò)程，需要多種分子介導(dǎo)或參與，包括 CD81、SR－BI、CLDN1、Occludin、DC－SIGN和LDLR等。CD81和SR－BI目前已經(jīng)被證明是HCV感染細(xì)胞的不可或缺的細(xì)胞受體［11］。近期研究表明，C型凝集素CLEC4M有可能介導(dǎo)HCV入胞過(guò)程。我們?cè)谇捌谘芯恐?，從外周血中分離出CD14＋細(xì)胞，應(yīng)用IL－4，GM－CSF刺激誘導(dǎo)出成熟DC細(xì)胞，運(yùn)用HCV RNA陽(yáng)性患者血清感染DC細(xì)胞，并設(shè)置單克隆抗體和甘露聚糖干擾組的競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)。研究顯示，經(jīng)單克隆抗體干擾組和甘露聚糖干擾組的細(xì)胞感染效率明顯低于陽(yáng)性對(duì)照組，說(shuō)明CLEC4M可能在HCV感染過(guò)程中扮演著重要角色［12］。

近年來(lái)，慢病毒載體因其具有宿主范圍廣、轉(zhuǎn)基因效率高且安全性好等突出優(yōu)勢(shì)而在基礎(chǔ)和臨床研究中得到廣泛應(yīng)用［13］。與其他病毒載體相比，慢病毒不僅具有能夠轉(zhuǎn)染分裂期和非分裂期細(xì)胞，并穩(wěn)定表達(dá)治療基因、無(wú)明顯免疫反應(yīng)等特性，而且可以廣泛轉(zhuǎn)染組織，病毒液濃縮成高滴度。

因此，基于Huh7.5細(xì)胞可以同時(shí)表達(dá)CD81和SR－BI，而不表達(dá) CLEC4M 分子，構(gòu) 建 了 過(guò) 表 達(dá)CLEC4M慢病毒載體并轉(zhuǎn)染Huh7.5細(xì)胞。轉(zhuǎn)染的Huh7.5細(xì)胞經(jīng)過(guò)G418篩選后獲得穩(wěn)定過(guò)表達(dá)CLEC4M的Huh7.5細(xì)胞系。HCVcc感染穩(wěn)定過(guò)表達(dá)CLEC4M的Huh7.5細(xì)胞和空載體細(xì)胞，研究結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)CLEC4M的Huh7.5細(xì)胞的感染效率高于空載體組。應(yīng)用單克隆抗體和甘露聚糖干擾，進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)。研究發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)性對(duì)照組的HCV RNA明顯高于單克隆抗體干擾組和甘露聚糖干擾組，而單克隆抗體干擾組與甘露聚糖干擾組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本研究顯示，CLEC4M在HCV入胞過(guò)程中扮演著重要角色。DC是功能強(qiáng)大的專(zhuān)職抗原遞呈細(xì)胞［14］。成熟DC表面可以高表達(dá)CLEC4M，因此，推測(cè)CLEC4M分子是DC能夠逃逸HCV免疫機(jī)制的重要原因，更深層的意義是為臨床及基礎(chǔ)工作在慢性丙型肝炎治療提供新的思路，為預(yù)防性疫苗的研究提供理論依據(jù)［15］。

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