膽汁淤積小鼠模型的探討

張慧 卞兆連 王綺夏 廉哲雄 馬雄

膽汁淤積性肝病在臨床中較為常見，它可由多種原因引起，例如：肝細胞、毛細膽管、肝內(nèi)膽管以及肝外膽管任何部位器質(zhì)性或功能性異常，致使膽汁排泄障礙、膽汁流量減少、膽汁成分返流入血液中［1］。膽色素在肝細胞組織中蓄積，引起一系列器質(zhì)性損害，導(dǎo)致代謝紊亂和功能異常。此狀態(tài)若持續(xù)發(fā)展將導(dǎo)致肝小葉和血管結(jié)構(gòu)破壞、結(jié)締組織隔形成，最終肝硬化，患者預(yù)后差［2，3］。因此膽汁淤積性肝病小鼠模型的建立對于深入研究膽汁淤積性肝病具有重要意義。

資料和方法

一、實驗動物

6～8周齡的SPF級雄性C57BL/6小鼠，購自中國科學(xué)院上海分院斯萊克實驗動物中心。C57BL/6 dnTGF－βR II轉(zhuǎn)基因小鼠由中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)免疫學(xué)研究所廉哲雄教授惠贈。上述實驗動物均于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院實驗動物中心SPF級動物實驗室內(nèi)喂養(yǎng)。溫度20～24℃，濕度50%左右，12 h光照周期單籠喂養(yǎng)，自由飲食和飲水。所有小鼠適應(yīng)性正常飲食1周后，根據(jù)隨機數(shù)字表法分組，每組10只。

二、方法

（一）BDL模型小鼠 3.5%水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉小鼠后，打開腹腔。顯露十二指腸上段膽總管，于肝門部解剖分離肝門靜脈和膽總管，剝離膽總管周圍組織。造模組小鼠以6個“0”的絲線結(jié)扎膽總管后關(guān)閉腹腔。假手術(shù)對照組打開腹腔后僅解剖游離膽總管但不需將其結(jié)扎，隨即關(guān)閉腹腔。所有手術(shù)操作均在無菌條件下進行，兩組小鼠術(shù)后均給予普通飼料喂養(yǎng)，自由攝取食物和水。10 d后頸椎離斷處死小鼠，取肝臟石蠟包埋行HE染色。

（二）DDC模型小鼠［4］喂養(yǎng)含有0.1%DDC飼料兩周后頸椎離斷處死小鼠，取肝臟石蠟包埋行HE染色。

（三）2OA－BSA 模型小鼠［5］稱取100μg 2OABSA溶于50μL磷酸鹽緩沖液（PBS）中，之后加入含H37RA結(jié)核分枝桿菌（購自美國Sigma－Aldrich，St.Louis，MO）濃度為1 mg/mL的完全弗氏佐劑50μL。上述100μL充分混勻后對小鼠進行腹腔內(nèi)注射，100μL/只。初次2OA－BSA免疫當天及第3天，每只造模小鼠腹腔內(nèi)注射溶于100μL PBS的百日咳毒素（含 量 100 ng，購 自 List Biological Laboratories，Campbell，CA）。第3周時再次以100μg 2OA－BSA（溶于50μL PBS），并輔以50μL不完全弗氏佐劑，對造模小鼠腹腔內(nèi)注射，100μL/只。正常對照組小鼠則予以相同容積的溶劑為對照液。第8周時頸椎離斷處死小鼠，取肝臟石蠟包埋行HE染色。

（四）dnTGF－βR II轉(zhuǎn) 基 因 小 鼠 取 16 周 齡C57BL/6背景dnTGF－βR II轉(zhuǎn)基因以及其野生對照小鼠行頸椎離斷處死，取肝臟石蠟包埋行HE染色。

三、肝臟組織樣品采集及處理

頸椎離斷處死小鼠后迅速開腹取出肝臟，部分肝右葉組織置于4%甲醛中固定，石蠟包埋、切片，HE染色后光鏡下觀察匯管區(qū)以及膽管周圍淋巴細胞的浸潤情況，判斷肝臟的組織學(xué)病變。400倍光鏡下對肝組織匯管區(qū)炎性細胞進行計數(shù)。肝組織匯管區(qū)炎癥分級統(tǒng)計標準如下：0級：匯管區(qū)無或基本無炎性細胞；1級：匯管區(qū)極少量炎性細胞浸潤；2級：匯管區(qū)少量炎性細胞浸潤；3級：匯管區(qū)中等程度的炎性細胞浸潤；4級：匯管區(qū)擴大，大量炎性細胞浸潤。

四、統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism5.0軟件處理數(shù)據(jù)及作圖，匯管區(qū)淋巴細胞數(shù)以均值±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、BDL模型小鼠

模型組小鼠膽總管結(jié)扎后進食量減少，毛發(fā)散亂無光澤，少動并且對聲、光刺激反應(yīng)減弱，尿液逐漸呈濃茶樣改變。假手術(shù)對照組無上述異常改變。肝臟大體標本BDL組小鼠肝臟明顯腫大，肝包膜緊張、邊緣鈍、棕黃色，質(zhì)稍硬。對照組則肝臟體積正常，包膜無緊張，質(zhì)軟，切面紅潤、細膩。HE染色后光鏡下可見BDL組小鼠肝組織表現(xiàn)為肝細胞腫脹、空泡變性，出現(xiàn)凝固性壞死灶。匯管區(qū)及膽管周圍炎性細胞浸潤，膽管周圍纖維化（圖1A）；而對照組肝組織匯管區(qū)和膽管周圍無或極少量炎性細胞浸潤。小鼠匯管區(qū)炎癥分級BDL模型組為（2.7±0.5）；假手術(shù)對照組為（0.0±0.0），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

二、DDC模型小鼠

隨時間延長造模組小鼠出現(xiàn)厭食少動、反應(yīng)遲緩、毛發(fā)散亂無光澤；對照組小鼠則一般情況正常。肝臟大體標本肉眼可見對照組小鼠肝臟呈粉、絳紅色，表面光滑。DDC模型組小鼠肝臟腫大，色澤黃變。肝臟HE染色后光鏡下顯示：對照組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常，膽管周圍無明顯炎性細胞浸潤，匯管區(qū)偶有散在炎性細胞浸潤；而DDC模型組小鼠匯管區(qū)以及膽管周圍可見大量炎性細胞浸潤，膽管內(nèi)膽栓形成（圖1B）。小鼠匯管區(qū)炎癥分級DDC模型組為（2.9±0.6）；與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

三、2OA－BSA 模型小鼠

模型組小鼠隨著造模時間的延長，出現(xiàn)食欲減退、反應(yīng)遲鈍、精神萎靡。毛發(fā)粗亂、部分脫毛、二目無神。正常對照組小鼠食欲正常、反應(yīng)敏捷、毛色均勻烏黑、二目有神。肝臟大體標本肉眼觀：正常對照組小鼠肝臟呈粉紅色或絳紅色，表面光滑。2OA－BSA模型組小鼠肝臟腫大，色澤黃變，表面結(jié)構(gòu)雜亂不規(guī)整。肝組織HE染色：模型組可見匯管區(qū)周圍和肝內(nèi)小膽管周圍有大量炎性細胞浸潤（圖1C）；而對照組肝內(nèi)膽管周圍及匯管區(qū)無或極少量炎性細胞浸潤。小鼠匯管區(qū)炎癥分級2OA－BSA模型組為（1.5±0.5）；與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

四、dnTGF－βR II轉(zhuǎn)基因小鼠

轉(zhuǎn)基因組小鼠隨時間延長，出現(xiàn)食欲減退、腹瀉、體重下降、毛發(fā)粗亂、反應(yīng)遲緩。野生型小鼠進食正常、反應(yīng)敏捷、毛色烏亮，其肝臟外觀邊緣銳利，色澤紅潤。dnTGF－βR II組肝臟外觀腫脹，包膜緊張，邊緣鈍厚，色澤暗紅。肝臟常規(guī)病理HE染色比較：野生型小鼠肝細胞索以中央靜脈為中心向四周呈放射性排列，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞間聯(lián)系緊密；肝細胞核大而圓，核仁明顯，胞質(zhì)豐富均勻；匯管區(qū)無炎性細胞浸潤，結(jié)構(gòu)清晰可見。而dnTGF－βR II轉(zhuǎn)基因小鼠，可見匯管區(qū)和小膽管周圍淋巴、漿細胞浸潤，膽管上皮細胞變性壞死，基底膜不完整，小膽管增生（圖1D）。小鼠匯管區(qū)炎癥分級dnTGF－βR II轉(zhuǎn)基因組為（1.2±0.6）；與野生型對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

本研究中的小鼠肝組織匯管區(qū)炎性細胞計數(shù)顯示：各對照組小鼠匯管區(qū)炎性細胞個數(shù)均很少，在0～3個之間（圖1E）。

圖1 各組小鼠肝組織光學(xué)顯微鏡下表現(xiàn)（HE，×200）

討 論

膽汁淤積是由于膽汁分泌及排泄障礙引起的一種病理生理過程，長期持續(xù)的膽汁淤積將進展為肝纖維化甚至肝硬化［6，7］。建立合適的膽汁淤積性肝病小鼠模型是研究膽汁淤積發(fā)生機制、篩選護肝藥物的前提，具有重要意義。盡管膽汁淤積造模方法較多，但不同物質(zhì)或方法誘導(dǎo)膽汁淤積的機制不同，進而產(chǎn)生不同的病理和生化改變，各有利弊。

原發(fā)性硬化性膽管炎（primary sclerosing cholangitis，PSC）是一種慢性膽汁淤積性肝病，好發(fā)于青壯年男性，同時累及肝內(nèi)、外膽管系統(tǒng)。病理特點為肝內(nèi)大膽管呈節(jié)段性狹窄及擴張，導(dǎo)致不規(guī)則的膽管閉塞，形成多病灶膽管狹窄，最終可發(fā)展為肝硬化。本研究中的BDL和DDC小鼠模型即為以肝內(nèi)大膽管損傷為特征的PSC動物模型。

BDL小鼠模型結(jié)扎小鼠膽總管后，隨時間延長肝臟對稱性腫大，出現(xiàn)膽汁淤積表現(xiàn)。本研究中采用膽總管結(jié)扎法造成小鼠肝外膽道梗阻，進而肝細胞缺血和壞死，建立膽汁淤積動物模型。此模型建立時間相對較短，術(shù)后10 d即可在光鏡下見輕度肝細胞腫脹、空泡變性，匯管區(qū)及大膽管周圍炎性細胞浸潤、膽管周圍纖維化?？紤]到手術(shù)應(yīng)激、肝臟牽拉、甚至麻醉藥物的應(yīng)用都會造成肝細胞損傷，因此在此組實驗設(shè)計中設(shè)置假手術(shù)對照組以觀察上述原因?qū)Ω谓M織的影響。光鏡下可見假手術(shù)對照組小鼠肝臟小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞索由中央靜脈向四周呈放射狀排列，中央靜脈、匯管區(qū)動、靜脈和膽管結(jié)構(gòu)正常。肝竇不擴張，肝組織匯管區(qū)和膽管周圍無或極少量炎性細胞浸潤。兩組小鼠匯管區(qū)炎癥分級差異有統(tǒng)計學(xué)意義。膽管梗阻時，肝臟實際上呈缺血狀態(tài)。毛細膽管進行性擴張，可形成小囊，微絨毛數(shù)量明顯減少或消失。肝細胞向肝血竇伸出微絨毛，阻塞血流。肝細胞和肝內(nèi)巨噬細胞中出現(xiàn)膽色素顆粒沉積，肝內(nèi)炎性單核吞噬細胞分泌Ly－6C和CD11b以及大量炎性因子［8］。膽管阻塞時，肝臟病理改變最明顯處為門管區(qū)，小葉間膽管增生，伴膽管周圍纖維化。增生膽管有很窄的管腔，不斷被膠原纖維包繞，最終導(dǎo)致肝硬化［9］。

已知外源物質(zhì)和藥物可能導(dǎo)致膽管發(fā)生病理性改變，出現(xiàn)膽管纖維化。毒素可直接干擾肝細胞和/或膽管上皮細胞及其分子水平機制，通過影響相關(guān)基因（Ntcp，Oatp4，Mdr2，Mrp2，Mrp3，Mrp4等）表達的上調(diào)和/或下調(diào)、阻斷生長因子與受體結(jié)合、蛋白合成、炎性反應(yīng)損害細胞膜和/或激活非實質(zhì)細胞等起作用［10－14］。以往文獻顯示，喂養(yǎng)小鼠以 DDC后可使之膽卟啉分泌增加，誘導(dǎo)膽管上皮細胞表達血管細胞黏附分子、骨橋蛋白和腫瘤壞死因子α。同時，肝組織內(nèi)CD11b陽性細胞、膽管損傷、膽管周圍成纖維細胞活化顯著增加并伴以嚴重的膽管周圍炎。隨著造模時間的延長，小鼠谷胱甘肽和磷脂的分泌顯著下降。出現(xiàn)膽管周圍炎、管周纖維化、相鄰門管區(qū)橋接樣炎癥，節(jié)段性膽管梗阻。本研究2周DDC小鼠造模組光鏡下肝細胞內(nèi)可見膽色素沉積，膽管內(nèi)膽汁淤積。上述結(jié)果表明，已成功建立DDC喂養(yǎng)誘導(dǎo)法的膽汁淤積性小鼠模型。

原發(fā)性膽汁性肝硬化是一種慢性膽汁淤積性肝病，中老年女性患者多見，血清堿性磷酸酶和γ－谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶水平顯著升高，免疫球蛋白IgM升高。約90%～95%的PBC患者血清抗線粒體抗體（antimitochondria antibody，AMA）陽性，以免疫介導(dǎo)的肝內(nèi)小葉間膽管炎損傷為病理學(xué)特征。PBC的病變特征即是肝內(nèi)匯管區(qū)大量的淋巴細胞浸潤，自身反應(yīng)性T細胞不斷破壞小膽管上皮細胞，導(dǎo)致膽管逐漸減少，膽汁淤積并最終引起進行性的肝臟損傷［15］。目前建立的PBC動物模型包括自發(fā)性模型、藥物誘導(dǎo)模型、抗原接種模型、細胞接種模型和基因缺陷模型［16－18］。

本研究中的2OA－BSA小鼠模型和dnTGFβR II轉(zhuǎn)基因小鼠均屬于以膽汁淤積為疾病特征的PBC動物模型。Wakabayashi等［5］在C57BL/6小鼠中以外源性物質(zhì)2OA－BSA輔以完全弗氏佐劑腹腔內(nèi)注射免疫造模并觀察至24周。該研究顯示，造模小鼠出現(xiàn)自身免疫性膽管炎、血清AMA陽性、肝組織內(nèi)浸潤的淋巴細胞數(shù)量增加，后者尤指共表達CD44的CD8＋T細胞。血清腫瘤壞死因子α、干擾素γ等細胞因子增加。本研究中的2OA－BSA小鼠肝組織可見匯管區(qū)周圍和肝內(nèi)小膽管周圍有大量炎性細胞浸潤；而對照組肝內(nèi)膽管周圍及匯管區(qū)無或極少量炎性細胞浸潤。兩組小鼠匯管區(qū)炎癥分級差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

顯性陰性轉(zhuǎn)移生長因子β受體II（dnTGFβR II）小鼠屬于基因缺陷PBC小鼠模型，其血清AMA陽性率100%［19］。本研究中觀察了dnTGFβR II轉(zhuǎn)基因及其野生對照型小鼠16周齡時肝臟病理組織學(xué)HE染色的變化。光鏡下觀察可見，野生對照組肝小葉完整，肝細胞排列整齊，未見明顯肝實質(zhì)細胞病變，中央靜脈和匯管區(qū)結(jié)構(gòu)正常。而dnTGFβR II轉(zhuǎn)基因組肝小葉輪廓不清，匯管區(qū)有大量淋巴、漿細胞浸潤，肝細胞腫大、胞質(zhì)疏松，有的呈氣球樣變及嗜酸樣變，可見明顯點狀或灶性壞死（圖1D）。兩組小鼠匯管區(qū)炎癥分級差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

已知TGF－β在細胞的增殖、分化、遷移過程中以及癌變、纖維化、創(chuàng)傷愈合、免疫反應(yīng)中有重要作用［20－23］。同時，該細胞因子對 T、B、NK、巨噬細胞和樹突狀細胞有抑制作用。肝臟纖維化時，TGF－β起著重要作用。目前認為導(dǎo)致細胞外基質(zhì)蛋白沉積增加的最主要細胞族是肝星形細胞（hepatic stellate cels，HSC），HSC通過旁分泌、自分泌途徑增加TGF－β生成。TGF－β繼而又參與HSC活化，導(dǎo)致細胞外基質(zhì)蛋白生成增多、降解減少，發(fā)生肝纖維化［24］。dnTGF－βR II轉(zhuǎn)基因小鼠是由CD4啟動子控制的TGF－β受體Ⅱ顯性負相過度表達C57BL小鼠，因特異性損傷CD4啟動子處的TGF－βII型受體，導(dǎo)致其外周免疫耐受被影響。該小鼠能自發(fā)形成PBC，出現(xiàn)類似PBC患者的表現(xiàn)，包括：血清AMA/M2陽性，類似PBC肝臟病理及細胞因子譜的改變等。模型發(fā)病年齡為5～6周，組織病理顯示肝臟門脈區(qū)浸潤的炎性細胞和人類PBC非常相似。兩者均存在特異性的小膽管損傷、肝纖維化，肝臟浸潤的T細胞中CD4＋T細胞活化，活化CD4＋T細胞針對的靶抗原為丙酮酸脫氫酸復(fù)合體E2亞基，NKT細胞比例增加，血清免疫球蛋白水平上升，產(chǎn)生針對PDC－E2、2－酮戊二酸脫氫酶E2亞基和支鏈2－酮酸脫氫酶E2亞基的AMA，有ANA產(chǎn)生，以及血清IL－12、IL－6、腫瘤壞死因子α、干擾素γ等細胞因子增加［25］。TGF－β促進FoxP3＋調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）的形成。有報道顯示PBC患者外周Treg水平降低［26，27］。TGF－β調(diào)節(jié) Treg的 FoxP3表達，TGF－βII型受體受損，導(dǎo)致機體對肝臟自身蛋白免疫耐受的缺失，誘發(fā)自身免疫性疾病。上述模型的建立有助于闡明PBC發(fā)病機制，促進PBC早期診斷和治療研究的進一步深入。

膽汁淤積是多種肝臟疾病過程中常見的病理改變，表現(xiàn)為正常膽汁流被損害或阻斷，膽汁酸和其他有害物質(zhì)過度蓄積而引發(fā)肝損傷。本研究所建立的四種膽汁淤積小鼠模型造模方法簡單、周期短，形成膽汁淤積穩(wěn)定可靠。其中，BDL和DDC模型以大膽管損傷為主；2OA－BSA模型和dnTGF－βR II轉(zhuǎn)基因小鼠模型以小膽管損傷為主。實驗中均無對動物和人有毒物的物質(zhì)接觸。因此，上述模型是研究膽汁淤積發(fā)病機制和尋找治療藥物研究的理想模型。

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