COX和CPT在非酒精性脂肪性肝病不同進(jìn)展階段中的變化

劉曉琳 明雅南 張靜怡 曾民德 茅益民

非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）包括單純性脂肪肝（NAFL）和非酒精性脂肪性肝炎（NASH），其與肥胖、糖尿病等代謝危險(xiǎn)因素顯著相關(guān)。NAFLD已呈世界范圍內(nèi)流行，各地患病率在6.3%～33%［1］。通常認(rèn)為，NAFLD是一個(gè)良性過程，但是NASH具有進(jìn)展為肝硬化和肝癌的風(fēng)險(xiǎn)［2］。

線粒體是細(xì)胞物質(zhì)能量代謝的場(chǎng)所，通過多種信號(hào)通路參與肝臟的脂肪代謝和能量的產(chǎn)生。目前，已有越來越多的研究提示線粒體功能異常和NAFLD發(fā)生密切相關(guān)［3］，NAFLD已被認(rèn)為是一種線粒體疾病。與NAFLD相關(guān)的線粒體異常包括線粒體呼吸鏈復(fù)合物活性降低和線粒體β氧化功能受損［4］。細(xì)胞色素C氧化酶（COX）是線粒體呼吸鏈電子傳遞的終末復(fù)合物，鑲嵌于線粒體內(nèi)膜，可調(diào)控線粒體的氧化呼吸功能；而肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶（CPT）是細(xì)胞線粒體脂肪酸氧化的限速酶，位于線粒體外膜，可調(diào)控長(zhǎng)鏈脂肪酸由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體進(jìn)行β氧化［5］。本研究旨在了解線粒體兩種關(guān)鍵酶在NAFLD進(jìn)展中的變化。

資料和方法

一、材料

SD大鼠購(gòu)于上海斯萊克動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；高脂飼料和膽堿蛋氨酸缺乏飼料購(gòu)于Research Diets公司（美國(guó)）；活性線粒體分離試劑盒（GMS10006.2）、純化線粒體細(xì)胞色素C氧化酶活性測(cè)定試劑盒（GMS10014.2）、純化線粒體肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶活性測(cè)定試劑盒（GMS10104）購(gòu)于杰美基因醫(yī)藥科技有限公司；Trizol、PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR○RPremix Ex TaqTMII購(gòu)于Takara公司（日本）；PCR引物購(gòu)于上海生工有限公司；RIPA購(gòu)于碧云天生物技術(shù)公司；BCA購(gòu)于Thermo公司（美國(guó)）；COX和CPT抗體購(gòu)于Abcam公司（英國(guó)）；全自動(dòng)生化分析儀（SIEMENS ADVIA1800，美國(guó)）；TecanInfinite 2000多功能酶標(biāo)儀（瑞士）；UV2450分光光度儀（日本島津）。

二、方法

（一）動(dòng)物分組及模型制備 30只雄性6周齡SD大鼠平均分到3組，每組10只。在動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，對(duì)照組給予標(biāo)準(zhǔn)飼料，NALF組給予高脂飼料（HFD），NASH組給予蛋氨酸膽堿缺乏飼料（MCD）。期間自由飲水。飼養(yǎng)溫度控制在（24±2）℃，濕度為（50±5）%，每天換水和墊料，每周末稱重，持續(xù)12周。

（二）肝組織HE染色 在第12周末，大鼠處死后剪下整個(gè)肝臟并稱重，迅速切下一小部分放入4%甲醛溶液中過夜，第2天將固定好的肝臟組織修剪后放入石蠟中包埋，切片后使用自動(dòng)染色機(jī)進(jìn)行HE染色。

（三）血清指標(biāo)檢測(cè) 在第12周末，采用眼底靜脈叢取血法采集30只大鼠的血液，4℃靜置凝固后，5 000×g離心30 min，隨后使用全自動(dòng)生化檢測(cè)儀檢測(cè)大鼠血清ALT、AST、TBil、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、游離脂肪酸（FFA）、高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）。

（四）實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)肝組織RNA 使用Trizol試劑盒提取肝臟總RNA，使用NanoDrop ND－1000檢測(cè)RNA的質(zhì)量和純度，A260/A280≥1.8作為RNA質(zhì)量合格的標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，然后按照SYBR○RPremix Ex TaqTMII說明擴(kuò)增18S，COX和CPT。COX和CPT基因的mRNA水平以18S作為內(nèi)參對(duì)照，結(jié)果表示為相對(duì) mRNA含量。所用的引物序列為：COX：TGTTCTTCATCGGCTTCACT，AGGGAGGGAGGGAGGAG；CPT：TGACCCTACTACATCCAGAGAT，TCAGACGCCCAAGTATTCAC；18S：AGTCGCCGTGCCTACCAT，CGGGTCGGGAGTGGGTAAT。

（五）Western印跡檢測(cè)肝組織蛋白 肝組織蛋白用RIPA試劑盒提取，并用BCA法測(cè)定肝臟蛋白濃度。經(jīng)10%SDS－PAGE電泳分離；轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，轉(zhuǎn)膜電流為300 mA，COX為8 min，CPT為40 min；在5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h后，與兔抗鼠的COX（1∶1 000）、CPT（1∶2 000）抗體孵育，4℃過夜。第2天用TBST洗膜3次。室溫孵育二抗3 h，洗膜2次。使用熒光試劑盒發(fā)光顯影。

（六）提取線粒體 肝臟線粒體的提取使用GENMED活性線粒體分離試劑盒。取新鮮肝組織加入預(yù)冷的裂解工作液5 mL，渦旋5 s后放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器，勻化組織80下，4℃1500×g離心10 min，移出上清液到另一離心管，10 000×g離心10 min，棄上清液，加入保存液2 mL，10 000×g離心5 min，棄上清液，加入凍存液1 mL，混勻后放－80℃冰箱保存。

（七）線粒體COX和CPT活性的檢測(cè) 使用Bradford蛋白定量測(cè)定每份線粒體樣品的蛋白濃度。線粒體COX活性的檢測(cè)使用GENMED純化線粒體細(xì)胞色素C氧化酶活性測(cè)定試劑盒（GMS10014.2）：在445μL的緩沖液中加入5μL待測(cè)樣品，室溫孵育3 min，加入50μL含有反應(yīng)液和穩(wěn)定液的反應(yīng)工作液，即刻放進(jìn)分光光度儀，波長(zhǎng)550 nm，在0s和60 s各測(cè)讀1次。線粒體CPT活性的檢測(cè)使用純化線粒體肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶活性測(cè)定試劑盒：在350μL的緩沖液中加入50μL反應(yīng)液和50μL底物液，室溫孵育3 min，加入50μL待測(cè)樣品，即刻放進(jìn)分光光度儀，波長(zhǎng)為412 nm，在0min和15 min各測(cè)讀1次。

三、統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì) 使 用 SPSS16.0，作 圖 使 用 GraphPad Prism5.0。計(jì)量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較使用單因素方差分析和Newman－Keuls檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、動(dòng)物模型的建立

在造模過程中，NAFL組大鼠的體質(zhì)量逐漸升高，且高于對(duì)照組，而NASH組大鼠的體質(zhì)量自第5周開始逐漸低于對(duì)照組。造模結(jié)束后，NAFL的體質(zhì)量高于對(duì)照組，而NASH組體質(zhì)量低于對(duì)照組（P＜0.05）。NAFL和NASH組的肝指數(shù)（肝濕重/體質(zhì)量）都明顯高于對(duì)照組，且NASH組顯著高于NAFL組（P＜0.05）。表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、肝濕重和肝指數(shù)比較（s）

表1 各組大鼠體質(zhì)量、肝濕重和肝指數(shù)比較（s）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與 NAFL組比較，b P＜0.05

組別 鼠數(shù) 體質(zhì)量（g）肝濕重（g）肝指數(shù)（%）06 NAFL組 10 681.00±28.47 20.26±1.14a2.98±0.12 NASH 組 10 313.70±9.22 16.52±9.22a5.28±0.19對(duì)照組 10 545.80±12.86 41.01±0.35 2.57±0.ab

二、各組大鼠肝臟病理組織學(xué)改變

對(duì)照組大鼠的肝臟組織結(jié)構(gòu)完整，肝板排列整齊，肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常；NAFL組大鼠的肝臟出現(xiàn)大泡和小泡性脂肪變以及氣球樣變，主要集中在3區(qū)，且有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；NASH組大鼠肝臟則呈現(xiàn)明顯的大泡性脂肪變，范圍波及整個(gè)肝葉，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，且存在點(diǎn)狀壞死。由此提示，NASH組大鼠的肝臟組織學(xué)進(jìn)展程度更重，脂肪變、氣球樣變、小葉炎性反應(yīng)更明顯。見圖1。

三、各組大鼠血清各項(xiàng)指標(biāo)的變化

與對(duì)照組相比，ALT和AST在NAFL組和NASH組均明顯升高，NASH組顯著高于NAFL組。NASH組的TBil和LDL均較對(duì)照組和NAFL組顯著增高。TG在NAFL和NASH組中升高。見表2。

四、各組大鼠肝臟組織COX和CPT基因表達(dá)量的變化

在大鼠的肝臟組織中提取RNA和蛋白檢測(cè)了COX和CPT表達(dá)量的變化。RT－PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，NAFL組和NASH組COX mRNA含量均降低（P＜0.05），見圖2A；NAFL組和 NASH 組CPT mRNA含量分別降低了50%和60%（P＜0.05），見圖2B。NAFL組和 NASH 組的 COX和CPT的蛋白含量也明顯降低。見圖2C。

五、各組大鼠肝臟組織線粒體COX和CPT酶活性的變化

從肝臟組織分離的活性線粒體立即測(cè)量了COX和CPT兩種酶的活性，結(jié)果顯示：COX在NAFL和NASH組，分別降低20%和35%，且NASH組低于NAFL組（P＜0.05）；CPT在 NAFL和 NASH 組，分別降低35%和50%，且NASH組低于NAFL組（P＜0.05）。結(jié)果表明，COX和CPT兩種酶在NAFLD中活性都受到抑制，且隨著疾病的進(jìn)展，兩種酶的活性降低更為顯著。見圖3。

表2 各組大鼠血清各指標(biāo)比較（s）

表2 各組大鼠血清各指標(biāo)比較（s）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與 NAFL組比較，b P＜0.05

組別 鼠數(shù) ALT（U/L）AST（U/L）TBil（μmol/L）TC（mmol/L）TG（mmol/L）HDL（mmol/L）LDL（mmol/L）01 NAFL組 10 147.90±32.75a190.30±22.48a2.25±0.14 1.92±0.07 1.35±0.20a 0.40±0.01 0.38±0.20 NASH 組 10 422.90±63.58ab 587.90±66.00ab 6.24±0.44ab 2.09±0.27 1.70±0.24a 0.35±0.05 0.78±0.17對(duì)照組 10 42.30±2.53 107.70±3.50 2.18±0.17 1.74±0.16 0.80±0.06 0.37±0.02 0.13±0.ab

圖1 各組大鼠的肝組織病理切片（HE×200）

圖2 COX和CPT在不同組別大鼠肝臟的表達(dá)情況

圖3 COX和CPT在大鼠肝臟線粒體中的活性水平

討 論

NAFLD的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，游離脂肪酸向肝臟的傳遞和運(yùn)輸增多、脂肪酸氧化能力下降可能是NAFLD發(fā)病中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［6］。線粒體通過不同信號(hào)通路的調(diào)控，不僅參與脂肪酸的β氧化，而且在細(xì)胞能量代謝中也發(fā)揮重要作用。越來越多的研究證實(shí)肝臟的線粒體在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，但是具體的分子機(jī)制尚未明確［7］。

在NAFLD中，線粒體氧化呼吸鏈（MRC）復(fù)合物的活性發(fā)生了改變。在HFD和MCD誘導(dǎo)的NASH動(dòng)物 模 型 中，COX 活 性顯著下 降［8－9］，但 也 有 報(bào) 道，COX活性不變甚至升高［10］，這可能提示在NAFLD的進(jìn)展中有一些MRC水平的代償機(jī)制被激活。一項(xiàng)研究探索了NASH患者中MRC復(fù)合物活性的改變，發(fā)現(xiàn)5種MRC復(fù)合物的肝臟活性明顯降低，且與血清TNF－α水平有關(guān)［11］。在 NAFLD中，飽和脂肪酸可直接抑制與 MRC相關(guān)的酶［12］，也可激活c－Jun氨基端激酶，引起線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致線粒體釋放細(xì)胞色素C發(fā)生凋亡；同時(shí)過量產(chǎn)生的活性氧自由基可以對(duì)MRC復(fù)合物造成損傷［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，在NAFL和NASH大鼠模型中，肝臟的COX mRNA和蛋白水平都下降，尤其在肝臟純化的線粒體中，COX的活性在NASH大鼠比NAFL大鼠降低的程度更顯著。提示在分離的線粒體中檢測(cè)酶的活性改變能更敏感的反映肝臟線粒體的功能障礙；同時(shí)也提示隨著NAFLD的進(jìn)展，肝臟的能量代謝狀態(tài)逐漸惡化。

有研究報(bào)道，在嚙齒類動(dòng)物NAFLD的模型中線粒體的脂肪酸氧化水平降低，同時(shí)與之相關(guān)的酶如CPT的活性降低［14－15］。隨著高脂飲食時(shí)間的延長(zhǎng)，PPARα表達(dá)逐漸降低，肝臟損傷加重［16］。特別是在NASH的動(dòng)物模型中，PPARα表達(dá)量持續(xù)下降，脂聯(lián)素水平逐漸降低［17］。雖然在NAFLD中線粒體脂肪酸氧化可維持正?；蛟鰪?qiáng)，但在一些以廣泛氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化為特征的嚴(yán)重NASH和肝硬化階段，線粒體的脂肪酸β氧化過程減弱［18－20］。這些數(shù)據(jù)都證實(shí)了NASH的線粒體β氧化功能存在不同程度的受損。而在本研究中NAFL和NASH大鼠肝臟CPT基因的表達(dá)量都減少，并且在肝臟純化的線粒體中測(cè)量CPT的活性，發(fā)現(xiàn)在NAFL組和NASH組中，該酶的活性都受到了明顯抑制，且NASH組比NAFL組的降低程度更顯著。提示在NAFLD進(jìn)程中，線粒體脂肪酸氧化過程受損，且NASH比NAFL的損傷程度更重。

綜上，在NAFLD中，線粒體的能量轉(zhuǎn)化和物質(zhì)代謝功能都受到了不同程度的抑制，脂肪酸氧化功能異常會(huì)促進(jìn)肝臟的脂肪聚集，MRC功能的進(jìn)行性降低會(huì)干擾能量的輸出。隨著疾病的發(fā)展，兩者的惡化會(huì)逐漸導(dǎo)致活性氧的過量產(chǎn)生，從而加重氧化應(yīng)激，促發(fā)惡性循環(huán)進(jìn)一步加重NAFLD。線粒體是多種物質(zhì)和能量的代謝場(chǎng)所，所以其功能障礙會(huì)留下代謝指紋，未來可以通過代謝組學(xué)等高通量技術(shù)篩選出特異性的線粒體障礙標(biāo)志物，這將有利于在NAFLD患者中早期發(fā)現(xiàn)線粒體功能異常。

1 Chalasani N，Younossi Z，Lavine J E，et al.The diagnosis and management of non－alcoholic fatty liver disease：Practice Guideline by the American Association for the Study of Liver Diseases，American College of Gastroenterology，and the American Gastroenterological Association.Hepatology，2012，55：2005－2023.

2 Starley BQ，Calcagno CJ，Harrison SA.Nonalcoholic fatty liver disease and hepatocellular carcinoma：a weighty connection.Hepatology，2010，51：1820－1832.

3 Grattagliano I，de Bari O，Bernardo T C，et al.Role of mitochondria in nonalcoholic fatty liver disease－from origin to propagation.Clinical biochemistry，2012，45：610－618.

4 Wei Y，Rector RS，Thyfault JP，et al.Nonalcoholic fatty liver disease and mitochondrial dysfunction.World journal of gastroenterology，2008，14：193.

5 Serviddio G，Giudetti AM，Bellanti F，et al.Oxidation of hepatic carnitinepalmitoyltransferase－I （CPT－I）impairs fatty acid betaoxidation in rats fed a methionine－choline deficient diet.PLoS One，2011，6：e24084.

6 García－Ruiz C，Baulies A，Mari M，et al.Mitochondrial dysfunction in non－alcoholic fatty liver disease and insulin resistance：cause or consequence？Free radical research，2013，47：854－868.

7 Nassir F，Ibdah JA.Role of mitochondria in nonalcoholic fatty liver disease.International journal of molecular sciences，2014，15：8713－8742.

8 Handa P1，Maliken BD，Nelson JE，et al.Reduced adiponectin signaling due to weight gainresults in nonalcoholic steatohepatitis through impaired mitochondrial biogenesis.Hepatology，2014，60：133－145.

9 Serviddio G，Bellanti F，Tamborra R，et al.Alterations of hepatic ATP homeostasis and respiratory chain during development of non‐alcoholic steatohepatitis in a rodent model.European journal of clinical investigation，2008，38：245－252.

10 Garciía－Ruiz I，F(xiàn)ernaández－Moreira D，Soliís－Mun?oz P，et al.Mitochondrial complex I subunits are decreased in murine nonalcoholic fatty liver disease：implication of peroxynitrite.Journal of proteome research，2010，9：2450－2459.

11 Pérez－Carreras M，Del Hoyo P，Martín M A，et al.Defective hepatic mitochondrial respiratory chain in patients with nonalcoholic steatohepatitis.Hepatology，2003，38：999－1007.

12 Ciapaite J，Van Eikenhorst G，Bakker S J L，et al.Modular Kinetic Analysis of the Adenine Nucleotide Translocator–Mediated Effects of Palmitoyl－CoA on the Oxidative Phosphorylation in Isolated Rat Liver Mitochondria.Diabetes，2005，54：944－951.

13 Aguirre E，Rodríguez－Juárez F，Bellelli A，et al.Kinetic model of the inhibition of respiration by endogenous nitric oxide in intact cells.BiochimicaetBiophysicaActa （BBA）－Bioenergetics，2010，1797：557－565.

14 Vial G，Dubouchaud H，Couturier K，et al.Effects of a high－fat diet on energy metabolism and ROS production in rat liver.Journal ofHepatology，2011，54：348－356.

15 Han KL，Choi JS，Lee JY，et al.Therapeutic potential of peroxisome proliferators－activated receptor－/ dual agonist with alleviation of endoplasmic reticulum stress for the treatment of diabetes.Diabetes，2008，57：737－745.

16 Huang J，Jia Y，F(xiàn)u T，et al.Sustained activation of PPARαby endogenous ligands increases hepatic fatty acid oxidation and prevents obesity in ob/ob mice.The FASEB Journal，2012，26：628－638.

17 Nagaya T，Tanaka N，Suzuki T，et al.Down－regulation of SREBP－1c is associated with the development of burned－out NASH.Journal of hepatology，2010，53：724－731.

18 Crescenzo R，Bianco F，F(xiàn)alcone I，et al.Increased hepatic de novo lipogenesis andmitochondrial efficiency in a model of obesity induced by diets rich in fructose.European journal of nutrition，2013，52：537－545.

19 Satapati S，Sunny NE，Kucejova B，et al.Elevated TCA cycle function in the pathology of diet－induced hepatic insulin resistance and fatty liver.Journal of lipid research，2012，53：1080－1092.

20 Diamond DL，Jacobs JM，Paeper B，et al.Proteomic profiling of human liver biopsies： hepatitis C virus－induced fibrosis and mitochondrial dysfunction.Hepatolofy，2007，46：649－657.