類胰蛋白酶通過(guò)PAR2激活JAK-STAT通路促進(jìn)小鼠骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞向M1表型轉(zhuǎn)換

張亞?wèn)|盧涵宇陳 亮李曉波殷蓮華，王松梅△

（1復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，2生理與病理生理學(xué)系 上海 200032）

類胰蛋白酶通過(guò)PAR2激活JAK-STAT通路促進(jìn)小鼠骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞向M1表型轉(zhuǎn)換

張亞?wèn)|1盧涵宇1陳 亮1李曉波2殷蓮華1，2王松梅1△

（1復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，2生理與病理生理學(xué)系 上海 200032）

目的研究類胰蛋白酶促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的作用及其機(jī)制。方法體外分離培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞（對(duì)照組），并誘導(dǎo)為M1和M2亞型，經(jīng)類胰蛋白酶和PAR2激動(dòng)劑分別作用后，通過(guò)real-time PCR和Western blot檢測(cè)巨噬細(xì)胞亞型標(biāo)志物以及JAK-STAT信號(hào)通路的變化。結(jié)果成功分離培養(yǎng)小鼠骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞，并誘導(dǎo)其分化為M1和M2亞型。PAR2激動(dòng)劑（2-Furoyl-LIGRLO-amide）和類胰蛋白酶分別與M1型巨噬細(xì)胞分別作用后，M1型標(biāo)記物iNOS和IL-12高于對(duì)照組，而M2型標(biāo)記物arg1和mrc1與對(duì)照相比無(wú)明顯變化，提示類胰蛋白酶和PAR2激動(dòng)劑可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)化，而不會(huì)促進(jìn)M1型向M2型轉(zhuǎn)化。PAR2激動(dòng)劑和類胰蛋白酶分別與M2型巨噬細(xì)胞作用后，M2型標(biāo)記物arg1和mrc1明顯下降，而M1型標(biāo)記物iNOS和iL-12有所增加，提示類胰蛋白酶和PAR-2激動(dòng)劑均可促進(jìn)M2型向M1型轉(zhuǎn)化。類胰蛋白酶作用于M1型巨噬細(xì)胞后，JAK2磷酸化水平、STAT和p-STAT的表達(dá)水平均無(wú)明顯變化。類胰蛋白酶作用于M2型巨噬細(xì)胞后，JAK2的磷酸化隨著時(shí)間延長(zhǎng)明顯升高，STAT的磷酸化水平同時(shí)升高，提示類胰蛋白酶可以通過(guò)和PAR-2結(jié)合而激活JAK2-STAT信號(hào)通路，進(jìn)而引起M2型向M1型轉(zhuǎn)化。結(jié)論類胰蛋白酶可能通過(guò)與其受體PAR2相互作用后激活JAK-STAT通路，促進(jìn)小鼠骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞向M1亞型轉(zhuǎn)化，起到促進(jìn)炎癥發(fā)展的作用，從而進(jìn)一步加重動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。

類胰蛋白酶； PAR2； 巨噬細(xì)胞M1/M2； JAK-STAT； 小鼠

心血管疾病嚴(yán)重威脅人類生命健康，在我國(guó)每年約350萬(wàn)人死于心血管疾病，占疾病總死亡原因的41%，位居第一［1］。動(dòng)脈粥樣硬化是其最主要的病理生理學(xué)基礎(chǔ)。動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病，多種免疫細(xì)胞參與其發(fā)生發(fā)展。其中巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞浸潤(rùn)通過(guò)分泌多種因子促進(jìn)炎癥反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化的斑塊形成、發(fā)展和破裂過(guò)程中起著重要作用。

巨噬細(xì)胞在體內(nèi)不同的微環(huán)境中存在著2種分化亞型：M1型（經(jīng)典活化型）和M2型（替代活化型）。M1型巨噬細(xì)胞能分泌NO、TNF-α、IL-6、IL-12等炎性因子，促進(jìn)炎性反應(yīng)，參與正向免疫應(yīng)答。M2型則分泌一些抑炎性因子（如IL-10、TGF-β）和可溶性IL-1受體拮抗劑等，抑制炎性反應(yīng)并下調(diào)免疫應(yīng)答［2-3］。研究表明，Apo E基因敲除（ApoE-/-）小鼠的早期動(dòng)脈粥樣斑塊中的巨噬細(xì)胞全部為抑炎的M2型。隨著時(shí)間的推移和病變的進(jìn)展，促炎的M1型巨噬細(xì)胞出現(xiàn)并成為ApoE-/-小鼠晚期動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的主要巨噬細(xì)胞［4］。因此，巨噬細(xì)胞M2/M1類型轉(zhuǎn)換與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［5］。

在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中存在大量浸潤(rùn)的肥大細(xì)胞，被激活后可釋放大量的內(nèi)容物和因子，其中含量最多的是一種四聚體絲氨酸蛋白酶，即類胰蛋白酶（tryptase）。類胰蛋白酶可通過(guò)多個(gè)途徑和環(huán)節(jié)參與并促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展［6-8］。肥大細(xì)胞和巨噬細(xì)胞之間存在著復(fù)雜的相互關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞周圍有大量脫顆粒的肥大細(xì)胞及類胰蛋白酶存在［9］，且肥大細(xì)胞的數(shù)量在不穩(wěn)定斑塊中遠(yuǎn)多于穩(wěn)定斑塊中，主要位于臨近巨噬細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)中。本課題組之前的研究還發(fā)現(xiàn)，類胰蛋白酶可通過(guò)激活巨噬細(xì)胞表面蛋白酶激活受體2（protease activated receptor 2，PAR2），抑制LXRα的活性，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞的泡沫化［8］。而類胰蛋白酶是否能通過(guò)和PAR2受體的相互作用，促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1/M2兩個(gè)亞型的轉(zhuǎn)化，目前尚不明確。因此本研究利用類胰蛋白酶及PAR2激動(dòng)劑作用于小鼠骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞，探索類胰蛋白酶對(duì)M1和M2兩個(gè)亞型相互轉(zhuǎn)化的作用及其機(jī)制，探討這一過(guò)程在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的意義。

材料和方法

試驗(yàn)材料SPF級(jí)C57小鼠購(gòu)自復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部，飼養(yǎng)過(guò)程和實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理規(guī)范》；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；實(shí)時(shí)PCR試劑購(gòu)自上海天根生物有限公司，抗體p-STAT、STAT、p-JAK2、Tublin、F4/80購(gòu)自Santa Cruz公司。LPS、IFNγ、IL-4購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，二抗和熒光二抗購(gòu)自上海天根生物有限公司。Trizol、RIPA購(gòu)自日本TAKARA公司，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。PAR2激動(dòng)劑2-Furoyl-LIGRLO-amide購(gòu)自美國(guó)Sigma公司（批號(hào)F3681）。

小鼠骨髓巨噬細(xì)胞的分離、培養(yǎng)10周齡C57小鼠，雄性，體質(zhì)量約20 g，4%水合氯醛麻醉，75%乙醇浸泡消毒15 min，無(wú)菌條件下取完整股骨。在股骨兩端用針頭打孔，DMEM培養(yǎng)液沖洗出全部骨髓細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，離心洗滌，接種于事先配好的條件培養(yǎng)基內(nèi)（DMEM+20%胎牛血清+20%L929細(xì)胞培養(yǎng)上清），置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天，換液去除懸浮細(xì)胞。繼續(xù)用條件培養(yǎng)基培養(yǎng)3天，用免疫熒光法檢測(cè)巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志F4/80以鑒定所分離出的巨噬細(xì)胞（對(duì)照組）。具體方法為：PBS清洗細(xì)胞，甲醇固定，1%Triton溶液作用30 min，F(xiàn)4/80抗體1∶100孵育2 h，PBS清洗5次，熒光二抗孵育1 h，PBS清洗5次，熒光顯微鏡檢測(cè)。

M1和M2亞型巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)向培養(yǎng)的小鼠骨髓巨噬細(xì)胞中加入LPS（終濃度100 ng/m L）和IFN-γ（終濃度20 ng/m L）誘導(dǎo)培養(yǎng)16 h，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察及real-time PCR檢測(cè)M1標(biāo)記物iNOS、IL-12，鑒定其分化成M1型；另外，向培養(yǎng)的小鼠骨髓巨噬細(xì)胞中加入IL-4（終濃度20 ng/m L）誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察及real-time PCR檢測(cè)M2標(biāo)記物arg1、mrc1，鑒定其分化成M2型。

細(xì)胞總RNA的提取及real-timePCR用5～10 m L PBS清洗細(xì)胞1次，用Trizol裂解液提取RNA，用DEPC處理的水溶解。260 nm/280 nm測(cè)定RNA濃度和純度。用天根公司通用型一步法RT-PCR試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用兩步法進(jìn)行real-time PCR擴(kuò)增，使用CFX96 PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司），退火延長(zhǎng)溫度為62℃，共25個(gè)循環(huán)，引物序列見(jiàn)表1。

表1 real-time PCR引物序列Tab 1 Primer senses for real-time PCR

細(xì)胞總蛋白的提取及Westernblot分析用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，4℃下9 600×g離心10 min，取上清，BCA法進(jìn)行蛋白定量。取20～30μL樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜。用含5%脫脂奶粉的TTBS緩沖液4℃封閉過(guò)夜。將一抗1∶1 000室溫孵育2 h。TTBS清洗膜5次，每次15 min。二抗1∶1 000室溫孵育1 h，洗膜5次。最后用ECL發(fā)光系統(tǒng)顯色，用圖像分析軟件BandScan 5.0進(jìn)行圖像掃描及相對(duì)定量分析。

統(tǒng)計(jì)方法 用SPSS 16.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，分析基因、蛋白表達(dá)水平的差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

成功分離培養(yǎng)小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞并誘導(dǎo)其分化成M1型、M2型F4/80是一種細(xì)胞表面糖蛋白，也是成熟小鼠巨噬細(xì)胞的標(biāo)記物。采用免疫熒光的方法檢測(cè)細(xì)胞表面的F4/80表達(dá)情況，顯微鏡視野內(nèi)可見(jiàn)90%以上的細(xì)胞均顯示出熒光（圖1），提示巨噬細(xì)胞分離培養(yǎng)成功。

圖1 F4/80免疫熒光染色檢測(cè)分離培養(yǎng)的小鼠來(lái)源的巨噬細(xì)胞Fig 1 Immunofluorescence staining of F4/80 in macrophages derived from murine bone marrow

培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞中加入1∶1 000的LPS、IFN-γ誘導(dǎo)培養(yǎng)16 h后，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，較多偽足，呈現(xiàn)M1亞型形態(tài)特征（圖2B）。real time-PCR結(jié)果顯示：M1亞型的標(biāo)志基因iNOS、IL-12表達(dá)明顯上調(diào)，而M2亞型標(biāo)志基因arg1、mrc1表達(dá)沒(méi)有變化（圖2D），提示巨噬細(xì)胞已被成功誘導(dǎo)為M1亞型。

向培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞中加入IL-4誘導(dǎo)24 h后，細(xì)胞形態(tài)多呈現(xiàn)圓形，少有偽足，表現(xiàn)出M2亞型的形態(tài)特征（圖2C）。real-time PCR結(jié)果顯示：M2亞型的標(biāo)志基因arg1、mrc1表達(dá)明顯上調(diào)，而M1亞型標(biāo)志基因i NOS、IL-12表達(dá)沒(méi)有變化（圖2E），提示巨噬細(xì)胞已被成功誘導(dǎo)為M2亞型。

圖2 LPS、IFNγ和IL-4分別誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化為M1和M2亞型Fig 2 Macrophages induced into M1 and M2 subtype by LPS、IFNγand IL-4

PAR2激動(dòng)劑和類胰蛋白酶對(duì)巨噬細(xì)胞向M1、M2亞型轉(zhuǎn)化的影響為了觀察類胰蛋白酶對(duì)巨噬細(xì)胞M1、M2亞型的轉(zhuǎn)化作用，分別將PAR2激動(dòng)劑2-Furoyl-LIGRLO-amide和類胰蛋白酶加入M1、M2巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中，使其終濃度為10 ng/m L，分別作用6 h和12 h，收取細(xì)胞檢測(cè)M1、M2標(biāo)記物的m RNA表達(dá)水平（圖3、4）。

圖3 2-Furoyl-LIGRLO-amide和類胰蛋白酶對(duì)M1型巨噬細(xì)胞的作用Fig 3 The effect of 2-Furoyl-LIGRLO-amide and tryptase on M1 macroghages

圖4 2-Furoyl-LIGRLO-amide和類胰蛋白酶對(duì)M2型巨噬細(xì)胞的作用Fig 4 The effect of 2-Furoyl-LIGRLO-amide and tryptase on M2 macrophages

2-Furoyl-LIGRLO-amide和類胰蛋白酶分別與M1巨噬細(xì)胞作用后，均可見(jiàn)M1的標(biāo)記物iNOS和IL-12的表達(dá)水平高于對(duì)照組。而M2的標(biāo)記物arg1和mrc1與對(duì)照相比無(wú)明顯變化（圖3A、3B）。說(shuō)明類胰蛋白酶和2-Furoyl-LIGRLO-amide處理后，具有M1亞型標(biāo)記物的細(xì)胞有所增加，而具有M2亞型標(biāo)記物的細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯變化，提示類胰蛋白酶和2-Furoyl-LIGRLO-amide可以促進(jìn)向M1巨噬細(xì)胞的分化，而不會(huì)促進(jìn)M1向M2轉(zhuǎn)化。

2-Furoyl-LIGRLO-amide和類胰蛋白酶分別與M2巨噬細(xì)胞作用后，M2標(biāo)記物arg1和mrc1均明顯下降。PAR2激動(dòng)劑和類胰蛋白酶處理后，M1巨噬細(xì)胞的標(biāo)記物iNOS和IL-12均有所增加（圖4A、4B）。說(shuō)明PAR2激動(dòng)劑和類胰蛋白酶處理M2亞型巨噬細(xì)胞后，具有M2亞型標(biāo)記物的細(xì)胞明顯減少，而M1亞型標(biāo)記物的細(xì)胞略有增多，提示類胰蛋白酶和PAR2激動(dòng)劑明顯促進(jìn)了M2亞型向M1亞型的轉(zhuǎn)化。

類胰蛋白酶對(duì)M1、M2巨噬細(xì)胞JAK-STAT信號(hào)通路的影響為了研究類胰蛋白酶促進(jìn)M2型向M1型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化的機(jī)制，我們檢測(cè)了類胰蛋白酶處理后的M1、M2亞型巨噬細(xì)胞中磷酸化JAK2（p-JAK2）以及磷酸化STAT（p-STAT）的蛋白水平（圖5）。

圖5 類胰蛋白酶分別作用于M1和M2亞型巨噬細(xì)胞后p-JAK2、STAT和p-STAT的表達(dá)水平的變化Fig 5 The expressions of p-JAK2，STAT and p-STAT in M1 and M2 macrophages treated with tryptase

類胰蛋白酶作用于M1亞型后，JAK2磷酸化水平無(wú)明顯變化，同時(shí)STAT和p-STAT的表達(dá)水平變化也不明顯（圖5）；而M2亞型經(jīng)類胰蛋白酶作用后，JAK2的磷酸化水平隨著時(shí)間有明顯的升高，在處理后45 min時(shí)達(dá)到最高峰，同時(shí)STAT的磷酸化水平也有升高，提示類胰蛋白酶可以通過(guò)和PAR2結(jié)合，激活JAK2-STAT信號(hào)通路，進(jìn)而引起M2型向M1型轉(zhuǎn)化，起促炎作用。

討 論

近年來(lái)，肥大細(xì)胞類胰蛋白酶在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用越來(lái)越受到關(guān)注。本課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)類胰蛋白酶可作為一個(gè)前炎性因子，促進(jìn)參與動(dòng)脈粥樣硬化形成的血管內(nèi)皮細(xì)胞中IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α及SCF等促炎因子的表達(dá)與釋放，而且該作用是類胰蛋白酶激活內(nèi)皮細(xì)胞表面PAR2，通過(guò)PI3K-PKB-NF-κB或p38/MAPK-AP-1信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的［7］。類胰蛋白酶可以通過(guò)抑制核受體LXRα （Liver X receptorα）活化來(lái)促進(jìn)巨噬細(xì)胞泡沫化；此外，類胰蛋白酶可通過(guò)影響凝血與抗凝血平衡，促進(jìn)血管新生等途徑來(lái)促進(jìn)粥樣斑塊內(nèi)出血。類胰蛋白酶還可以通過(guò)激活基質(zhì)金屬蛋白酶MMPs促進(jìn)粥樣斑塊纖維帽的降解，進(jìn)而導(dǎo)致不穩(wěn)定斑塊的形成及急性血管事件的發(fā)生?？梢?jiàn)類胰蛋白酶在動(dòng)脈粥樣硬化的多個(gè)環(huán)節(jié)中起到不同的作用，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展有很大的影響。

在眾多動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制中，免疫炎癥學(xué)說(shuō)一直都得到大家公認(rèn)和肯定，免疫系統(tǒng)包括先天性和適應(yīng)性免疫兩種，巨噬細(xì)胞屬于先天性免疫系統(tǒng)，巨噬細(xì)胞的亞型分化現(xiàn)象在腫瘤、肥胖、心血管疾病等疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中廣泛存在，并具有多種調(diào)節(jié)機(jī)制。研究表明，與磷脂酰肌醇3-激酶相關(guān)的細(xì)胞激酶和磷酸酶能調(diào)節(jié)M1、M2的定向分化［10］。在肥胖的研究中，全長(zhǎng)脂聯(lián)素可以通過(guò)脂聯(lián)素受體激活I(lǐng)L-4/STAT6通路，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2抗炎表型的轉(zhuǎn)化［11］。由此提示，在不同的生理病理炎癥環(huán)境中，調(diào)控巨噬細(xì)胞亞型分化的因素可能不同。

巨噬細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。研究表明，如果缺少巨噬細(xì)胞，Apo E基因敲除導(dǎo)致的嚴(yán)重高膽固醇血癥尚不足以使小鼠發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化病變。斑塊中巨噬細(xì)胞的增多與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，主要表現(xiàn)在：（1）進(jìn)入動(dòng)脈內(nèi)膜下的巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生許多物質(zhì)如脂肪酶、活性氧或自由基，進(jìn)一步使LDL分子氧化形成氧化型LDL（ox-LDL），通過(guò)其表達(dá)的清道夫受體不斷攝取ox-LDL，最終形成泡沫細(xì)胞，構(gòu)成動(dòng)脈粥樣硬化的病理基礎(chǔ)；（2）巨噬細(xì)胞還可分泌大量的細(xì)胞因子（如TNF、單核細(xì)胞集落刺激因子等），參與炎性反應(yīng)，并可促進(jìn)自身增殖和單核細(xì)胞進(jìn)一步聚集；（3）巨噬細(xì)胞還可表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解，增加斑塊的不穩(wěn)定性。

巨噬細(xì)胞是一種極具異質(zhì)性的細(xì)胞群體，在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過(guò)程的微環(huán)境中存在一系列連續(xù)的功能狀態(tài)，而M1型和M2型巨噬細(xì)胞是這一連續(xù)狀態(tài)的兩個(gè)極端。研究表明，在ApoE基因敲除（ApoE-/-）小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展過(guò)程中，斑塊中的巨噬細(xì)胞會(huì)從抑炎的M2型轉(zhuǎn)變?yōu)榇傺椎腗1型［4］。因此，巨噬細(xì)胞M2/M1類型轉(zhuǎn)換與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

在動(dòng)脈粥樣硬化的斑塊周圍存在大量的肥大細(xì)胞浸潤(rùn)，并分泌大量的顆粒物，包括類胰蛋白酶，這就是巨噬細(xì)胞存在的環(huán)境，因此巨噬細(xì)胞的亞型分化必然受到周圍環(huán)境的影響。本研究發(fā)現(xiàn)類胰蛋白酶和2-Furoyl-LIGRLO-amide作用于小鼠骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞，可以促進(jìn)M1型上調(diào)和M2型下降。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，這種表型的變化存在著不同的調(diào)節(jié)機(jī)制，類胰蛋白酶可以使M2亞型細(xì)胞中JAK2/STAT的磷酸化水平增高，從而激活了這一通路，而對(duì)于M1亞型卻沒(méi)有這種作用。因此，類胰蛋白酶可能通過(guò)激活M2型巨噬細(xì)胞的JAK/STAT信號(hào)通路，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向炎性亞型M1的轉(zhuǎn)化，這一發(fā)現(xiàn)將為繼續(xù)研究類胰蛋白酶和巨噬細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用提供一個(gè)新的方向。

［1］王文，朱曼璐，王擁軍，等.中國(guó)心血管病報(bào)告2012摘要［J］.中國(guó)循環(huán)雜志，2013，28（6）：408-412.

［2］Mantovani A，Sica A，Sozzani S，et al.The chemokine system in diverse forms of macrophage activation and polarization［J］.Trends Immunol.2004，25（12）：677-686.

［3］Gordon S.Alternative activation of macrophages［J］.Nat Rev Immunol，2003，3（1）：23-35.

［4］Khallou-Laschet J，Varthaman A，F(xiàn)ornasa G，et al. Macrophage plasticity in experimental atherosclerosis［J］. PLoS ONE，2010，5（1）：e8852.

［5］Johnson JL，Newby AC.Macrophage heterogeneity in atherosclerotic plaques［J］.Curr Opin Lipidol，2009，20 （5）：370-378.

［6］Lu C，Zhao F，Li X，et al.Up regulation of interleukin-8 expressions induced by mast cell tryptase via protease activated receptor-2 in endothelial cell line［J］.Chin Med J（Engl），2005，118（22）：1900-1906.

［7］Ma Y，Zhang B，Qian R，et al.Tryptase activates PKB in inflammatory reaction in ECV304 cells［J］.Biochim Biophys Acta，2006，1763（3）：313-321.

［8］Yeong P，Ning Y，Xu Y，et al.Tryptase promotes human monocyte-derived macrophage foam cell formation by suppressing LXRαactivation［J］.Biochimica Biophys Acta，2010，1801（5）：567-576.

［9］Kaartinen M，Penttil?A，Kovanen PT.Mast cells of two types differing in neutral protease composition in the human aortic intima.Demonstration of tryptase and tryptase/chymase-containing mast cells in normal intimas，fatty streaks，and the shoulder region of atheromas［J］. Arterioscler Thromb，1994，14（6）：966-972.

［10］Martinez FO.Regulators of macrophage activation［J］. Eur J Immunol，2011，41（6）：1531-1534.

［11］Mandal P，Pratt BT，Barnes M，et al.Molecular mechanism for adiponectin-dependent M2 macrophage polarization：link between the metabolic and innate immune activity of full-length adiponectin［J］.J Biol Chem，2011，286（15）：13460-13469.

Tryptase transforms murine bone marrow derived macrophages to M1 macrophages subtype by activating JAK-STAT pathway through PAR2 in mice

ZHANG Ya-dong1，LU Han-yu，CHEN Liang，LI Xiao-bo2，YIN Lian-hua1，2，WANG Song-mei1△
（1Training Center of Medical Experiments，2Department of Physiology and Pathophysiology，School of Basic Medical Sciences，F(xiàn)udan University，Shanghai 200032，China）

ObjectiveTo investigate the effects and mechanism of tryptase in macrophages phenotype transformation in mice.MethodsThe molecular markers of macrophages subtype were detected by real-time PCR，and the activation of JAK-STAT pathway was detected by Western blot.ResultsThe murine bone marrow derived macrophages were isolated and induced to M1 or M2 subtype successfully.After PAR2 agonist（2-Furoyl-LIGRLO-amide）or tryptase were added into M1 macrophages，the expression levels of the M1 markers iNOSand IL-12 were increased obviously，while the M2 markers arg 1 or mrc1 had no obvious change.It suggested that tryptase and PAR2 agonistpromoted macrophages differentiating to M1，but did not promote the transformation from M1 to M2. On the other hand，after adding PAR2 agonist or tryptase into M2 macrophages，the expression levels of the M2 markers arg1 and mrc1 were decreased obviously，meanwhile the expression level of M1 markers iNOS and IL-12 increased.It indicated that tryptase or PAR-2 agonists promoted M2 transformating to M1.The expression levels of p-STAT，STAT or JAK2 were not change after tryptase incubated with M1 macrophages.However，incubated with tryptase，the phosphorylation levels of JAK2 and STAT were significantly increased in M2 macrophages，which indicated that tryptase may activated the JAK2-STAT signaling pathway by binding to PAR-2，and then resulted in the conversion M2 to M1 macrophages.ConclusionsTryptase may activate JAK-STAT pathway through the interaction with its receptor PAR2，which results in the murine bone marrow derived macrophages differentiating to M1.This effect plays a role in promoting the development of inflammation，further aggravates the development of atherosclerosis.

tryptase； PAR2； macrophage M1/M2； JAK-STAT； mouse

TQ 925+.2

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2015.05.008

2015-04-04；編輯：段佳）

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81270490，81170253）；復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院項(xiàng)目（J1210041）

△Corresponding author E-mail：smwang2@fudan.edu.cn

*This work was supported by the General Project of National Natural Science Foundation of China（81270490，81170253）andthe Project of Shanghai Medical College，F(xiàn)udan University（J1210041）