扇貝食品中遺忘性貝毒素的開管電色譜快速檢測技術研究

陳清愛， 李 琳， 林旭聰

(1. 福建商業(yè)高等?？茖W校旅游系， 福建 福州 350012； 2. 福州大學化學學院， 福建 福州 350116)

扇貝食品中遺忘性貝毒素的開管電色譜快速檢測技術研究

陳清愛1， 李 琳2， 林旭聰2

(1. 福建商業(yè)高等專科學校旅游系， 福建 福州 350012； 2. 福州大學化學學院， 福建 福州 350116)

基于N-氨乙基-3-氨丙基甲基二甲氧基硅烷(AEPTS)鍵合開管柱， 研究遺忘性貝類毒素(軟骨藻酸， DA)的電色譜分離行為， 建立了DA的毛細管開管柱電色譜(OTCEC)快速分析技術. 考察并優(yōu)化了緩沖液類型、 緩沖液濃度、 pH值、 分離電壓以及進樣時間等參數(shù)影響， 在最優(yōu)條件下(20 mmol·L-1NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液, pH= 4.00， 電動進樣25 s， 進樣和分離電壓為-18 kV)， DA標準溶液在0.12～5.00 μg·mL-1范圍內(nèi)線性良好， 檢測限(S/N=3)為0.03 μg·mL-1. 應用于扇貝中DA的快速分析， 扇貝貝肉提取液無需凈化即可直接進樣， 扇貝中DA線性濃度范圍為0.50 ～ 10.00 μg·mL-1， 檢測限(S/N=3)為0.25 μg·mL-1(相當于貝肉中DA含量1.0 μg·g-1)， 扇貝樣品加標回收率為80.5%～83.1%， RSD<8.5%.

遺忘性貝毒素； 開管電色譜； 貝肉； 食品

0 引言

遺忘性貝類毒素， 主要成分為軟骨藻酸(domoic acid, DA)， 對神經(jīng)系統(tǒng)海馬區(qū)和丘腦區(qū)可能造成損傷， 導致大腦記憶喪失， 其在食品中的含量有必要進行快速、 準確的監(jiān)測[1].

軟骨藻酸的檢測技術主要包括酶聯(lián)免疫[2]、 放射性免疫[3]、 高效色譜[4]等， 其中高效液相色譜法是軟骨藻酸分析中普遍采用的方法， 包括了高效液相色譜-紫外檢測、 HPLC-激光誘導熒光、 HPLC-質(zhì)譜聯(lián)用等技術， 在實驗室確證分析中應用較為廣泛. 相對于HPLC技術， 毛細管電色譜(CEC)結合了HPLC選擇性好和電泳CE的高效分離的優(yōu)勢， 在色譜微分離應用中發(fā)展迅速. Jose[5]基于C18反相填充柱， 開展了軟骨藻酸分析， 驗證了CEC分離能力， 但在柱塞界面容易產(chǎn)生氣泡， 方法不夠穩(wěn)定. Wu等[6]通過引入輔助泵壓驅(qū)動力， 消除了柱塞產(chǎn)生氣泡的問題， 提出了加壓毛細管電色譜檢測DA的新方法. 隨著CEC技術的發(fā)展， CEC在軟骨藻酸分析中應用潛力越來越受到了重視[7].

開管毛細管電色譜(OT-CEC)是基于開管分離柱的一類CEC技術， 該方法通過鍵合或涂層吸附在毛細管內(nèi)壁從而形成固定相， 具有無需柱塞、 制備簡單、 平衡時間短等優(yōu)點， 因此得到了較為廣泛的關注[8]. 前期研究發(fā)現(xiàn)， N-氨乙基-3-氨丙基甲基二甲氧基硅烷(AEPTS)是一種性能優(yōu)良的氨基硅烷化試劑[9]， 在適當條件下解離帶有正電荷， 有助于產(chǎn)生陽離子靜電排斥作用， 可以與陰離子產(chǎn)生離子交換作用和同向電滲流. 將OT-CEC和AEPTS鍵合開管柱的有機結合， 將有助于抑制蛋白質(zhì)在管壁上的吸附、 含羧基結構化合物的快速分離.

本研究基于AEPTS鍵合開管柱， 研究軟骨藻酸(DA)的電色譜分離行為， 建立DA的毛細管開管柱電色譜(OTCEC)快速分析技術. 考察緩沖液類型、 緩沖液濃度、 緩沖液pH、 電壓以及進樣時間等參數(shù)影響， 并應用于貝肉中DA的快速分析.

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

毛細管開管柱電色譜-紫外檢測裝置(實驗室自行組裝)， 系統(tǒng)包括： ±30 kV/0.3 mA 可調(diào)高壓電源(上海應用物理研究所研制)， 毛細管開管柱(內(nèi)徑50 μm， 長度60 cm)， 可變波長紫外檢測器(190～ 600 nm)； DKB-501A型超聲恒溫水槽(上海精宏實驗設備有限公司)； KDC-160HR高速冷凍離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)； 實驗室自制AEPTS鍵合開管柱， 如圖1所示.

圖1 毛細管開管柱制備Fig.1 Scheme of the preparation of open tubular column

軟骨藻酸標準品(純度≥90%， 西格瑪化學品公司, 美國)， 并于-20 ℃冰箱中避光保存； 乙腈、 甲醇(色譜純， 上海國藥化學試劑有限公司)； 磷酸二氫鈉、 磷酸氫二鈉等其他試劑均為分析純； 實驗所用水為二次蒸餾水； 貝肉樣品購自福州的大型超市.

1.2 實驗方法

實驗開始前依次使用0.1 mol·L-1HCl， 二次蒸餾水， 甲醇水溶液(50%， 體積分數(shù))沖洗AEPTS鍵合開管柱30 min， 采用緩沖液平衡柱子10 min， 再加高壓電平衡20 min. 待基線穩(wěn)定后可以開始進樣， 采集數(shù)據(jù). 為了保證實驗出峰的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性， 每次運行后需以二次蒸餾水和緩沖液各沖洗5 min. 紫外檢測波長為220 nm.

1.3 樣品處理

根據(jù)文獻 [5]， 將扇貝貝肉用勻漿機均質(zhì)， 在提取液和樣品比為4∶1(體積質(zhì)量比)的情況下輔助超聲提取， 即準確稱取4 g貝肉勻漿于離心試管中， 加入16 mL甲醇水溶液(50%， 體積分數(shù))， 混勻后， 3 300 r·min-1離心10 min. 取上層清液1 mL， 用0.22 μm微孔濾膜過濾后， 轉移到1 mL塑料容器中， 以8 000 r·min-1離心10 min. 取0.5 mL的上層清液直接用于分析檢測； 同上， 扇貝貝肉樣品中分別按照40、 20、 4 μg·g-1加入DA標準溶液進行加標回收率實驗.

2 結果與討論

2.1 分離條件優(yōu)化 2.1.1 緩沖液類型的影響

基于AEPTS開管柱特點， 在酸性條件下， AEPTS基團可能引發(fā)較大的電滲流EOF. 考察了NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液， 檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液， 醋酸鈉-醋酸緩沖液等不同體系的影響， 結果表明， 檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液和醋酸鈉-醋酸緩沖液在同等物質(zhì)量濃度下， 離子強度較小， 有利于避免產(chǎn)生較大的焦耳熱， 使整個緩沖體系較穩(wěn)定， 但是， 軟骨藻酸(DA)的電色譜分離峰形展寬且峰高偏低， 在NaH2PO4-Na2HPO4緩沖體系當中， DA電色譜峰形尖銳不拖尾， 且峰高響應較好. 綜合考慮， 選擇磷酸鹽緩沖液作為實驗運行緩沖液.

2.1.2 緩沖液pH值的影響

軟骨藻酸(DA)含有三個羧基和一個氨基基團， pKa值分別為2.10、 3.72、 4.93、 9.82， 根據(jù)緩沖液pH值的不同， DA擁有不同的荷電狀態(tài)和電離能力. 如圖2所示， 當pH為3.00時， AEPTS正電荷化程度大， 電滲流強度大， 此時DA解離程度低， 負電荷量較少， 電泳速度小， 導致DA與背景中溶劑物質(zhì)(水峰)合在一起， 峰高響應極弱； pH值為3.50時， AD仍主要處于一級解離， 解離程度有所增強， 與pH 3.00相比峰高有所增加； 當pH值為4.00時， AEPTS正電荷化程度受到弱化， DA分子中有兩個羧基解離， 帶負電量明顯增大， DA電泳速度有所提高， DA峰在水峰之前， 峰高響應明顯增強； pH值為4.50時， 流動相洗脫能力隨著pH值降低而變?nèi)酰?DA洗脫減少， 響應信號有所降低； 當pH值增大為5.00和5.50時， AEPTS正電荷化程度受到弱化， DA解離程度加大， 可以帶有三個單位負電荷， DA電泳速度大幅增強， 線性速度超過EOF， AD出峰變快(遷移時間約6 min). 由于pH 值為5.00和5.50時， 流動相洗脫能力隨著pH值降低而變?nèi)酰?固定相表面吸附的DA洗脫減少， 故而DA響應比pH 值為4.00時降低明顯. 綜上情況， 實驗選擇pH 值為4.00的條件， 在電泳作用和電滲流作用二者的共同作用下， DA出峰時間較快， 峰響應強度高.

圖2 緩沖液pH值對軟骨藻酸遷移的影響Fig.2 Effects of pH value of running buffer on migration time of DA

c緩沖鹽/mmol·L-1峰高/mV半峰寬/s100．8704．8201．18911．8301．11213．3

2.1.3 緩沖液鹽濃度的影響

隨著緩沖鹽濃度的增加， 焦耳熱增大， 電滲流降低， 帶電溶質(zhì)在開管柱內(nèi)的遷移速率變慢， 遷移時間延長. 實驗優(yōu)化了不同濃度緩沖液(10～30 mmol·L-1)， 當緩沖液濃度為30 mmol·L-1時， 緩沖液離子強度大， 表觀電流顯著增大， 焦耳熱增大， 溶質(zhì)擴散加劇， 峰形展寬； 當使用較低濃度緩沖液(10 mmol·L-1)時， DA遷移時間雖然較快， 但是緩沖液與樣品的鹽度差異降低， 場放大效應降低， 峰高響應有所降低， DA檢出靈敏度下降(見表1). 在20 mmol·L-1的鹽濃度條件下， DA峰高響應良好， 且基線噪音也較小， 檢測體系較穩(wěn)定. 同時， 考慮到貝類樣品分析時， 提液中背景基質(zhì)濃度也會相對較高， 實驗選擇緩沖液鹽濃度為20 mmol·L-1.

2.1.4 分離電壓的影響

分離電壓主要影響分析時間與分離效果兩個方面. 分離電壓越高， 樣品的遷移時間越短， 但分離的效果會下降； 如果分離電壓過低， 又會使遷移時間變長. 經(jīng)過實驗考察， 發(fā)現(xiàn)當分離電壓為-18 kV時， DA分析時間最短， 峰形、 出峰時間最理想. 當電壓高于-18 kV時， 由于此時焦耳熱效應明顯， 基線波動較大， 使整個檢測體系較不穩(wěn)定. 綜合考慮分析時間和體系的穩(wěn)定性， 實驗選擇了-18 kV為最佳分離電壓.

2.1.5 進樣時間和進樣電壓的影響

圖3 進樣時間對軟骨藻酸峰高的影響 Fig.3 Effects of injection time on the OTCEC-UV analysis of DA

實驗采用電動進樣， 進樣時間與進樣電壓的變化與樣品峰高的響應大小有關. 在進樣電壓為-18 kV時， 考察了不同進樣時間對DA出峰情況的影響. 如圖3所示， 隨著進樣時間的延長， 峰高響應增強， 峰面積增大， 峰形出現(xiàn)明顯的展寬. 當進樣時間為30 s時， DA峰形展寬最為嚴重. 進樣時間為10 s時， 峰高響應較弱， 峰形對稱， 且無明顯展寬. 當進樣時間一定(25 s)， 如果進樣電壓小， 則樣品的進樣量也少， 則峰高響應較弱. 進樣電壓過大， 雖然會使得峰高增大， 但也會使樣品峰出現(xiàn)展寬拖尾情況.

實驗考察了進樣電壓為-13～-18 kV時DA的出峰情況， 結果表明， 當進樣時間一定， 進樣電壓為-18 kV時， DA的峰高響應最好， 當進樣電壓高于-18 kV時， DA的峰高響應增加不明顯， 峰形卻嚴重展寬. 綜合考慮DA檢測靈敏度和峰形， 實驗選擇了進樣電壓為-18 kV、 進樣時間為25 s.

2.2 線性范圍、 檢測限與重現(xiàn)性

在最優(yōu)條件下， 開管柱電色譜對一系列不同濃度的DA標準混合液進行分析測定， 以譜圖上的峰面積所對應的DA質(zhì)量濃度進行線性回歸分析， 所得的線性范圍、 線性回歸方程、 相關系數(shù)和檢測限見表2. 由表2可知， DA在0.12～5.00 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關系良好， 檢測限(S/N=3)為0.03 μg·mL-1. 考察實驗的重復性， 將1 μg·mL-1DA標準溶液， 在一天內(nèi)連續(xù)進樣5次和連續(xù)3 d內(nèi)分別對相同濃度的DA溶液進行分析， 通過測定相對標準偏差 RSD (%)檢測軟骨藻酸遷移時間和峰強度的重現(xiàn)性， 測得遷移時間和峰面積的日內(nèi)相對標準偏差(RSD)分別為3.9%和4.2%， 日間RSD分別為5.2%和6.8%.

在最佳分析條件下， 按照1.3中的扇貝樣品處理步驟， 對扇貝未加標的提取液進行分析， 未能檢出DA. 采用質(zhì)譜對照分析， 扇貝未加標的提取液測定結果相同， DA未檢出. 實驗將此樣品視為空白樣， 在空白扇貝樣中， 對于未經(jīng)凈化的提取液， 鹽濃度和背景基質(zhì)濃度較高， 存在若干氨基酸等雜質(zhì)峰， 但是并未對DA樣品峰產(chǎn)生干擾， 分離情況良好. 為了準確測定實際樣品環(huán)境中DA的含量， 往此空白提取液中依次加入DA標準溶液， 建立了一系列濃度的樣品加標樣， 測定了扇貝樣品的DA工作曲線， 如表3， DA檢出限為0.25 μg·mL-1， 即相當于1 μg·g-1軟骨藻酸貝肉.

表2 軟骨藻酸線性范圍及檢測限*

注*：實驗條件為: 柱子, 60 cm×50 μm i.d.; 流動相, 20 mmol·L-1NaH2PO4-Na2HPO4(pH4.00)； 分離電壓, -18 kV； 電動進樣 (-18 kV， 25 s)

**：y為峰面積；x為分析物濃度(μg·mL-1)

表3 扇貝提取液中DA測定工作曲線

注： 實驗條件同表2

2.3 樣品分析

對扇貝提取液直接進行分析， 如圖4所示， 在空白扇貝樣中， 對于未經(jīng)凈化的提取液， 存在若干雜質(zhì)峰(具有紫外吸收的色氨酸等氨基酸)， 但并未對DA樣品峰產(chǎn)生干擾， 分離情況良好. 向提取液中加入10.0、 5.0、 1.0 μg·mL-1(等效于按照40、 20、 4 μg·g-1)的軟骨藻酸DA標準樣， 通過開管柱電色譜分析檢測， 并進行回收率測定. DA實際樣品加標的回收率為80.5%～83.1%， RSD<8.5%(見表4)， 結果良好.

圖4 扇貝中軟骨藻酸的加標樣品OTCEC分析 Fig.4 Electrochromatogram of extracting samples of scallop tissue spiked with DA standard solution

分析物加標量/μg·mL-1回收率/%標準偏差/%DA10．082．76．65．083．17．41．080．58．3

注： 實驗條件同表2

3 結語

基于N-氨乙基-3-氨丙基甲基二甲氧基硅烷(AEPTS)鍵合開管柱， 探索了軟骨藻酸DA在AEPTS鍵合開管柱中的電色譜分離行為， 結合簡便的UV檢測技術， 建立了遺忘性貝類毒素(軟骨藻酸)的OTCEC快速微分離技術， 實現(xiàn)了貝肉食品中軟骨藻酸(DA)的快速分析. 所建立的方法中貝肉提取液不必經(jīng)過凈化即可直接進樣， DA的檢測限為0.25 μg·mL-1(等效于貝肉中DA的濃度1.0 μg·g-1)， 低于貝肉中DA的濃度20 μg·g-1的食品安全最大限量， 方法簡單， 在10 min左右實現(xiàn)DA實際樣品的分析， 速度較快， 加標回收率為80.5%～83.1%， RSD<8.5%， 結果良好. 對于貝類食品中的微量軟骨藻酸的監(jiān)測具有良好意義.

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(責任編輯： 洪江星)

Rapid profile of amnesic shellfish toxin in shellfish food by open-tubular capillary electrochromatography

CHEN Qing’ai1, LI Lin2, LIN Xucong2

(1.Tourism Department, Fujian Commercial College, Fuzhou, Fujian 350012, China;2. College of Chemistry, Fuzhou University, Fuzhou, Fujian 350116, China)

A rapid profile of amnesic shellfish toxin (viz. domoic acid, DA) in shellfish meat has been gained by open-tubular capillary electrochromatography (OTCEC) using an open-tubular column functionalized by 3-[2-(2-Aminoethylamino-ethylamino]propyl trimethoxysilane (AEPTS). The chromatographic behavior of DA in OTCEC was studied, and the effects of several analytical parameters including the composition, pH value and concentration of the buffer solution, separation voltage, and the injection value were investigated and optimized. Under the optimal conditions (NaH2PO4-Na2HPO4bufffer, 20 mmol·L-1， pH 4.00, injection voltage -18 kV， separation voltage -18 kV, injection time 25 s)， a linear relationship between the DA concentration and CE peak intensity could be obtained in the range of 0.12 to 5.00 μg·mL-1with a detection limit (S/N=3) of 0.03 μg·mL-1. Applied to shellfish foods， the extraction samples of scallop meats could be directly detected without any purification treatment. The calibration curve of real extraction samples of scallop tissue was obtained from 0.50 to 10.00 μg·mL-1, and the detection limit (S/N=3)of 0.25 μg·mL-1(equal to the content of DA at 1.0 μg·g-1in total tissues ) . Satisfactory recoveries of fortified samples ranged from 80.5% to 83.1% were obtained with the RSD less than 8.5%.

amnesic shellfish toxin; open-tubular capillary electrochromatography; shellfish meat; food

10.7631/issn.1000-2243.2015.04.0560

1000-2243(2015)04-0560-05

2015-05-08

林旭聰(1976- )， 博士， 教授， 主要從事環(huán)境和食品安全分析研究， xulin@fzu.edu.cn

國家自然科學基金資助項目(21277026); 福建省科技計劃重點資助項目(2013Y0061)

O657.7

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