分光光度法測(cè)定葛根葉中總黃酮的含量

王翰華　陸元?jiǎng)住『鷫?mèng)月　周松青　金雯

摘 要：目的：建立葛根葉中總黃酮含量的測(cè)定方法。方法：以蘆丁為對(duì)照品，選擇510nm為測(cè)定波長(zhǎng)，采用分光光度法測(cè)定葛根葉中總黃酮的含量。結(jié)果：蘆丁在0.01208mg/mL-0.07248mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.9996），平均回收率為98.72%，RSD為2.6%。結(jié)論：分光光度法精密度高，重復(fù)性好，可用于葛根葉中總黃酮含量的測(cè)定。

關(guān)鍵詞：葛根葉；總黃酮；含量測(cè)定；分光光度法

中藥葛根為豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd） Ohwi或甘葛藤Pueraria thomsonii Benth的干燥根。在我國(guó)具有悠久的歷史，在《本經(jīng)》、《別錄》等均有記載。味甘、辛、涼，歸脾、胃經(jīng)，具有解肌退熱、生津、透疹、升陽(yáng)止瀉之功效。由于葛根具有抗炎解熱、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈血管、增加冠狀動(dòng)脈血流量及降低血壓等作用[1，2]，含有多糖及多種微量元素[3]，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于保健食品中，是我國(guó)衛(wèi)生部批準(zhǔn)的第一批藥食同源的植物[4，5]。臨床上主要用于冠心病、高血壓、心絞痛、高黏血癥、腦梗死、椎-基底動(dòng)脈供血不足等多種疾病的治療。[6]目前，未見(jiàn)有葛根葉的相關(guān)研究報(bào)道。為了擴(kuò)大葛根的藥用部位，文章采用分光光度法測(cè)定葛根葉中總黃酮含量，為葛根葉的后續(xù)研究和開(kāi)發(fā)打下基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

TU-1818型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；BS124S型電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；KQ-100B型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥材與試劑

葛根葉藥材購(gòu)于安徽省亳州市藥材市場(chǎng)。蘆丁對(duì)照品（中國(guó)生物制品檢定所，批號(hào)：100080-200707）。所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取蘆丁對(duì)照品15.1mg，置于50mL容量瓶中，加入60%乙醇適量，溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2 供試品溶液的制備。取葛根葉粉末5g，精密稱定，置錐形瓶中，加入60%乙醇50mL，稱重，超聲30min，60%乙醇補(bǔ)足失重，濾紙過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各1.0mL，置25mL容量瓶中，先加入5%的亞硝酸鈉溶液1.0mL，搖勻，放置5min，再加入10%的硝酸鋁溶液1.0mL，搖勻，放置5min，再加入4%的氫氧化鈉溶液10.0mL，加60%的乙醇至刻度，混勻，靜置l5min。以上述不加蘆丁對(duì)照品液的混合液為空白參照，在200nm-800nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)為510nm。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。精密吸取對(duì)照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL，分別置于25mL容量瓶中，照“2.3”項(xiàng)下方法，自“加入5%亞硝酸鈉溶液”起依法測(cè)定各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度，以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度C為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A=0.1529C-0.0023，r=0.9996，表明蘆丁在0.01208mg/mL-0.07248mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.4.2 精密度試驗(yàn)。精密吸取對(duì)照品溶液3.0mL，共6份，分別置于25mL容量瓶中，照“2.3”項(xiàng)下方法操作，測(cè)定吸光度，結(jié)果吸光度的RSD為0.98%，表明本方法精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)。取葛根葉粉末6份，按“2.2”項(xiàng)的方法制備供試品溶液，精密量取供試品溶液1mL，置25mL容量瓶中，按“2.3”項(xiàng)下的方法操作，測(cè)定吸光度，計(jì)算葛根葉中總黃酮含量的RSD值為1.3%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)。精密吸取葛根葉供試品溶液1.0mL，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，在0min、5min、10min、15min、20min、30min時(shí)依法測(cè)定吸光度，RSD值為1.6%，表明本法在30min內(nèi)測(cè)定是穩(wěn)定的。

2.4.5 加樣回收率。精密稱取已知總黃酮含量的葛根葉，分別精密加入高、中、低濃度蘆丁對(duì)照品適量，照“2.3”項(xiàng)下方法操作，每個(gè)濃度平行三份，測(cè)定吸光度，以計(jì)算的檢測(cè)量減去本底，比上加入量算得回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.5 樣品的測(cè)定

取葛根葉6份，按照“2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，依法測(cè)定吸光度，計(jì)算得總黃酮含量9.08mg/g，RSD=1.9%。

3 討論

目前關(guān)于總黃酮含量的測(cè)定方法有比色法、紫外分光光度法、薄層色譜法等，其中以比色法最常用，且多以蘆丁為對(duì)照品。該法操作簡(jiǎn)便，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好，因此本實(shí)驗(yàn)選擇以蘆丁為對(duì)照品的比色法為測(cè)定方法。

在供試品的提取過(guò)程中，比較了回流提取和超聲提取兩種方法，結(jié)果表明回流提取效率高。同時(shí)考察了不同比例的乙醇溶劑，發(fā)現(xiàn)60%乙醇提取效率高。

葛根因含葛根素，大豆苷及大豆苷元，金雀異黃素和芒柄花黃素等異黃酮類成分，近年來(lái)葛根在防治骨質(zhì)疏松癥方面的作用得到廣泛關(guān)注。[7，8]綜合國(guó)內(nèi)外數(shù)據(jù)庫(kù)檢索的結(jié)果，未見(jiàn)有葛根葉的相關(guān)報(bào)道?；谕曛参锖邢嗤瘜W(xué)成分的原理，對(duì)葛根葉的研究開(kāi)發(fā)，有利于擴(kuò)大葛根的藥用部分，有利于葛根的深入開(kāi)發(fā)和研究，有利于推進(jìn)抗骨質(zhì)疏松藥物的研究。

參考文獻(xiàn)

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[8]Wong R，Rabie B.Efect of puerarin on bone formation[J].Osteoarthritis Cartilage，2007，15（8）：894-899.

作者簡(jiǎn)介：王翰華（1982-），男，浙江寧波人，碩士，浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校講師，從事中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究和中藥相關(guān)課程教學(xué)。