我的碩士生發(fā)了篇博士水平的論文

馬中良

2015年諾貝獎(jiǎng)獲得者屠呦呦先生，做的是關(guān)于中草藥青蒿中提取青蒿素的研究。這不禁讓我想起自己帶的一名研究生張冰潔同學(xué)，三年前她開始了中藥組份丹參酮的研究，而丹參酮是從丹參根部提取的有效組分。這個(gè)課題并不簡單，也注定了是一條艱辛的道路，因此對于這個(gè)從上海大學(xué)本科保送的學(xué)生來說，我的夢想是她能夠做出一些成績，最低要求是能發(fā)表一篇SCI文章，這在當(dāng)時(shí)已經(jīng)相當(dāng)不錯(cuò)了。

選了個(gè)難得課題

2012年，剛剛?cè)雽W(xué)的張冰潔同學(xué)主動(dòng)要求開始課題。此時(shí)我們課題組的李艷利老師剛從哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院回來不久，她曾參與過丹參酮在腫瘤中作用的相關(guān)課題，研究認(rèn)為丹參酮可以通過抑制一種癌基因的表達(dá)水平，從而抑制胰腺癌。而當(dāng)時(shí)，我們課題組主攻目標(biāo)是微小RNA（microRNA）在肺癌中的作用，而且這個(gè)藥物能否抑制肺癌也是未知。也因此，我給她確定的課題是：丹參酮-microRNA-腫瘤之間的關(guān)系。這個(gè)課題無論從基礎(chǔ)理論還是將來的應(yīng)用來看，都有相當(dāng)?shù)囊饬x，但困難也可想而知。而我們之所以選擇這樣一個(gè)課題，是認(rèn)為這個(gè)題目將來的理論及應(yīng)用潛力巨大：研究肺癌如何發(fā)生的；開發(fā)治療肺癌的相關(guān)藥物，并找到一些藥物的標(biāo)靶分子。

得到了這個(gè)課題后，張冰潔躍躍欲試又憂心忡忡。躍躍欲試是因?yàn)樗诒究茖?shí)習(xí)的時(shí)候接觸過腫瘤及細(xì)胞生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)，如果能夠做好這個(gè)課題，將來對科學(xué)研究可能興趣大增；憂心忡忡則是因?yàn)檎n題難度太大，她擔(dān)心三年時(shí)間做不完，因?yàn)檫@個(gè)題目之前課題組中沒有人開展過，是一項(xiàng)開創(chuàng)性的工作。

迎戰(zhàn)各種攔路虎

對于一名一年級的研究生同學(xué)來說，要想獨(dú)立開展一項(xiàng)課題非常不容易。為了做好課題，張同學(xué)首先查閱了大量的相關(guān)文獻(xiàn)，在最短時(shí)間掌握了相關(guān)實(shí)驗(yàn)技能，比如課題涉及到的分子生物學(xué)技術(shù)：蛋白檢測技術(shù)（wester blotting）、RNA提取及檢測、實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)以及生物信息學(xué)預(yù)測技術(shù)等等。

在真正展開研究之前，需要對課題進(jìn)行調(diào)研并做可行性驗(yàn)證。在這個(gè)過程中，張同學(xué)遇到了很多問題。比如丹參酮處理了腫瘤細(xì)胞以后到底哪些microRNA發(fā)生了改變（表達(dá)量上升或下降）？這個(gè)問題如果放在現(xiàn)在，當(dāng)然非常簡單，只要送到公司，花錢做個(gè)細(xì)胞測序就好了。但在當(dāng)時(shí)我們是想做探索，不可能也沒有那么多錢做這個(gè)工作。所以，張同學(xué)又閱讀了大量的文獻(xiàn)，在一些公開發(fā)表的數(shù)據(jù)庫資料的基礎(chǔ)上做相關(guān)分析。與此同時(shí)，我也檢索了一些文獻(xiàn)。最終我們確定了一些癌基因功能，以及抑癌基因功能的microRNA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，比如當(dāng)時(shí)已經(jīng)公認(rèn)的p53基因，miR-34和let-7等。

除了自己埋頭苦干，在涉及到肺癌方面的具體實(shí)驗(yàn)時(shí)，張同學(xué)還不忘向?qū)＜彝姓埥獭１热缱瞿[瘤模型小鼠的數(shù)據(jù)分析、microRNA在肺癌中的可能調(diào)控途徑分析時(shí)，我?guī)е埥塘松虾Ｉ圃荷?xì)胞所季宏斌研究員，季宏斌研究員也認(rèn)為中藥單體的研究是非常有前途的，這個(gè)課題非常有意義，這也給了我們很大的鼓勵(lì)。在這個(gè)過程中，我們還得到了課題組組長、原生化與分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)主任金由辛教授的肯定。得到專家學(xué)者們的積極反饋，也讓我們堅(jiān)信這個(gè)課題是有美好的前景的。雖很辛苦，但值得一試。

一波三折的實(shí)驗(yàn)進(jìn)展

2013年4月到2014年7月，我去美國（MD Anderson Cancer Center）做高級訪問學(xué)者。那時(shí)張同學(xué)已經(jīng)進(jìn)入研究生二年級下半年，時(shí)間已經(jīng)很緊迫了，而課題進(jìn)展卻遇到了瓶頸，有些實(shí)驗(yàn)重復(fù)多次也得不到理想的結(jié)果。

身在異國，我采取的方法并且可能是唯一可行的方法就是，定期進(jìn)行視頻交流，根據(jù)情況制定后續(xù)的任務(wù)。當(dāng)時(shí)的一個(gè)主要難點(diǎn)是確定藥物處理后有哪些microRNA發(fā)生了變化，從而確認(rèn)抑制癌癥功能的microRNA。而張同學(xué)匯報(bào)的結(jié)果是：所有檢測的microRNA表達(dá)水平都是上升的。對于這個(gè)結(jié)果，我認(rèn)為是不可能的。因?yàn)樵谝粋€(gè)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)中，不可能所有因素都上調(diào)。于是，我確定了兩個(gè)方案：一是檢查實(shí)驗(yàn)主要是實(shí)時(shí)定量PCR的步驟是否有誤，做重復(fù)實(shí)驗(yàn)，每次改變一個(gè)影響因素，再進(jìn)行檢測；二是重新用藥物處理，從收集細(xì)胞到RNA提取、檢查每一步，進(jìn)行詳細(xì)分析，查找原因。

這樣經(jīng)過一個(gè)月的不斷交流、實(shí)驗(yàn)，張同學(xué)終于發(fā)現(xiàn)問題可能的所在：實(shí)驗(yàn)中對實(shí)驗(yàn)技術(shù)的要求很高，尤其是對實(shí)時(shí)定量PCR的樣品要求很高，一不小心就容易出錯(cuò)。在我的關(guān)注下，張同學(xué)的實(shí)驗(yàn)不斷有了的進(jìn)展，最終發(fā)現(xiàn)丹參酮處理后miR-32有了明顯改變。半年以后，我們做了個(gè)總結(jié)，基本上確定了可以以miR-32為研究目標(biāo)，以闡明丹參酮處理腫瘤細(xì)胞時(shí)miR-32表達(dá)上升，而由于miR-32可以發(fā)揮抑癌基因的功能，最終抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。

進(jìn)入研究生三年級之后，張同學(xué)的時(shí)間越來越緊張了，不過，我們的課題也進(jìn)入了快車道，實(shí)驗(yàn)得心應(yīng)手，一般每周都能有很好的進(jìn)展。這些都?xì)w功于在長期的研究過程中，她閱讀科學(xué)文獻(xiàn)能力和理解能力的突出，不僅有大量的科學(xué)文獻(xiàn)做基礎(chǔ)，還會積極主動(dòng)跟進(jìn)最新課題進(jìn)展，包括國際上最新的相關(guān)文獻(xiàn)，同時(shí)能將看到的有用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)或者思路運(yùn)用到自己的課題中。因此，她對研究內(nèi)容的領(lǐng)悟很快，有時(shí)還能提出讓我吃驚的看法。比如，她說microRNA-25家族和Let-7家族（另一個(gè)著名的microRNA家族，主要是抑癌基因功能）應(yīng)該有相互協(xié)調(diào)或相互反饋調(diào)控作用，并在實(shí)驗(yàn)中主動(dòng)加入這些抑制腫瘤的microRNA進(jìn)行研究。其實(shí)我也注意到了這個(gè)現(xiàn)象，但是不敢和她提起來。因?yàn)檫@個(gè)工作應(yīng)該是一個(gè)博士生的工作，或者兩個(gè)碩士研究生接力去研究的內(nèi)容。

精益求精改稿件

課題進(jìn)展得比較順利之后，張同學(xué)開始在我的指導(dǎo)下撰寫英文文章。每過一段時(shí)間我們還會根據(jù)實(shí)驗(yàn)最近進(jìn)展修改，增補(bǔ)文章，這段時(shí)間持續(xù)了大約半年多。2014年11月，我們的研究得到了課題組李艷利老師，金由辛教授大力支持和幫助。在2014年11月中旬，我們將稿件投稿到英文期刊Oncotarget（腫瘤標(biāo)靶）。這本期刊在當(dāng)時(shí)的影響因子（IF）為6.67， 也就是說如果能在該期刊發(fā)表文章，基本達(dá)到了一個(gè)博士生畢業(yè)的要求。

2015年1月，我們得到了編輯部的反饋。針對審稿人的意見，我們又一起進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的補(bǔ)充，修改意見的答復(fù)。比如審稿人要求證明丹參酮是否影響miR-32的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控？這其實(shí)這是個(gè)連鎖問題：我們得先確定哪個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，才能確定丹參酮對轉(zhuǎn)錄因子是有作用的。而且，這個(gè)作用與之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果必須要吻合。

于是，我和張同學(xué)一起分析這些問題。張同學(xué)說，她曾經(jīng)在一篇文章中看到有介紹雄性激素（AR）作為轉(zhuǎn)錄因子的內(nèi)容，我們可以試試AR，另外再確定另一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子做備選。在接下來半個(gè)月時(shí)間內(nèi)，她做出了實(shí)驗(yàn)結(jié)果，該結(jié)果也著實(shí)讓人非常激動(dòng)，它完全了符合我們的預(yù)期：丹參酮抑制了AR，這樣一來miR-32表達(dá)水平上升，最后起到了抑制肺癌的作用。最后我們提出如下機(jī)理圖， 這也是國際上首次從microRNA角度闡明中藥組份丹參酮抑制腫瘤機(jī)理：

（Oncotarget，2015 Aug 21；6（24）：20111-20，DOI：10.18632/oncotarget.3933）

即丹參酮（Tanshinone）給藥處理后，引起miR-32上升，miR-32抑制癌基因AURKA（圖中）；初步驗(yàn)證丹參酮促進(jìn)miR-34a表達(dá)上升，抑制癌基因TGFβ2（圖右）。丹參酮促進(jìn)let-7表達(dá)（圖左）。這些都抑制了非小細(xì)胞肺癌肺癌（NSCLC）。

經(jīng)過我們的再次修改，文章發(fā)出的第二天，主編就告知我們決定錄用，這是最快的一種接受方式，說明我們的工作得到了最大的認(rèn)可。2015年5月，文章在線發(fā)表。

2015年6月19日，是個(gè)讓人緊張的日子，我指導(dǎo)的碩士研究生張冰潔同學(xué)要進(jìn)行碩士論文答辯了。最終答辯取得非常好的效果，給來自中國科學(xué)院上海生化與細(xì)胞所及蘇州醫(yī)工所的專家們留下深刻的印象。這個(gè)來自上海大學(xué)的學(xué)生終于出色地畢業(yè)了，此刻，我心里終于踏實(shí)了，夢想也最終成為了現(xiàn)實(shí)。

致謝：感謝張冰潔同學(xué)（現(xiàn)供職于上海某大型藥企）提供的資料。特別感謝李艷利老師，金由辛教授及課題組老師在學(xué)生培養(yǎng)過程給予的幫助。

責(zé)任編輯：曹曉晨