半夏瀉心湯及其拆方對胃電節(jié)律失常大鼠胃組織縫隙連接蛋白Cx43表達(dá)的影響

李翠等

摘要：目的 探討半夏瀉心湯調(diào)節(jié)胃運動的配伍規(guī)律。方法 選取90只健康SD雄性大鼠，分為正常組10只和模型組80只。復(fù)制大鼠胃電節(jié)律失常模型，經(jīng)胃電生理學(xué)指標(biāo)評價后，根據(jù)半夏瀉心湯的配伍特點，將其拆分為辛開、苦降、甘補、辛開苦降、辛開甘補、苦降甘補組，每組10只。各給藥組按相同藥物濃度不等體積連續(xù)灌胃4周。給藥后進行胃電參數(shù)分析，采用免疫組化法、RT-PCR檢測胃組織Cx43及其mRNA表達(dá)。結(jié)果 與正常組比較，模型組Cx43及其mRNA表達(dá)升高；與模型組比較，各給藥組胃電慢波頻率變異系數(shù)降低，各給藥組Cx43及其mRNA表達(dá)降低，其中辛開甘補組作用最為顯著。結(jié)論 半夏瀉心湯調(diào)節(jié)胃運動機制可能與其降低縫隙連接蛋白Cx43及其mRNA表達(dá)有關(guān)，從而改變紊亂的胃電節(jié)律，達(dá)到改善胃運動功能的作用。

關(guān)鍵詞：半夏瀉心湯；Cx43蛋白；縫隙連接；胃運動；大鼠

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2015）06-0075-05

胃腸道運動功能紊亂是大多胃腸道疾病的重要臨床表現(xiàn)和發(fā)病機制，其發(fā)病率高。半夏瀉心湯出自《傷寒論》，具有降逆止嘔、消痞散結(jié)的作用。前期研究表明，半夏瀉心湯對胃電節(jié)律失常大鼠胃壁SCF基因表達(dá)水平、胃肌間神經(jīng)叢c-kit陽性間質(zhì)細(xì)胞（ICC）含量表達(dá)均有影響[1]。胃腸神經(jīng)-ICC-平滑肌細(xì)胞（SMC）網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和功能的變化對胃腸道動力障礙性疾病有重要的病理生理學(xué)意義。在胃腸道中，縫隙連接（GJ）是介導(dǎo)SMC和ICC細(xì)胞間電化學(xué)信息交流，保證肌肉活動的協(xié)調(diào)性和同步性的特殊通道。Cx43是構(gòu)成GJ最重要的連接蛋白，廣泛存在于胃腸Cajal與SMC之間。Cx43基因發(fā)生突變、數(shù)量減少，會影響細(xì)胞膜上GJ通道的數(shù)量，從而妨礙細(xì)胞間信號的傳遞，導(dǎo)致胃腸道運動功能障礙。本研究以Cx43為切入點，根據(jù)半夏瀉心湯辛開苦降甘補的配伍特點，按照藥味特點與中醫(yī)病機結(jié)合分組的原則，采用析因?qū)嶒炘O(shè)計研究半夏瀉心湯及其拆方對ICC細(xì)胞Cx43的影響，進一步揭示半夏瀉心湯調(diào)節(jié)胃運動的分子機制，闡釋經(jīng)方配伍規(guī)律。

1 實驗材料

1.1 動物

健康4周齡SD雄性大鼠90只，體質(zhì)量（180±20）g，北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號0309256。所有動物均給予大鼠全價營養(yǎng)顆粒飼料，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院屏障動物實驗室。

1.2 藥物

半夏瀉心湯方的藥物劑量比例按文獻(xiàn)[2]換算。法半夏55.7 g，黃芩、干姜、人參、炙甘草各46.875 g，黃連15.62 g，大棗42 g。根據(jù)“法依病機，拆方依法”的研究思路[3]，將半夏瀉心湯拆分為辛開組（法半夏、干姜）、苦降組（黃芩、黃連）、甘補組（人參、炙甘草、大棗）、辛開苦降組（法半夏、干姜、黃芩、黃連）、辛開甘補組（法半夏、干姜，人參、炙甘草、大棗）及苦降甘補組（黃芩、黃連、人參、炙甘草、大棗）。所有藥物均為免煎顆粒，北京康仁堂藥業(yè)有限公司。

1.3 主要試劑與儀器

4%多聚甲醛，solarbio公司；免疫組化通用試劑盒（鼠/兔）、DAB顯色試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；一抗Connexin43 Antibody（鼠抗人，單克隆抗體）、二抗goat anti- mouse IgM-HRP，Santa cruz公司；Trizol，Invitrogen公司；氯仿，索萊寶公司；異丙醇，北京益奧明科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，Promega公司；SYBR Green PCR Master Mix，ABI公司；所有引物均由北京諾賽基因組研究中心有限公司合成。多導(dǎo)生理儀EGG100C（BioPac公司，美國），SPOT software V3.0Ⅱ圖像拍攝系統(tǒng)（Diagnostic instruments，美國），LD5-2A離心機（北京京立離心機有限公司），超聲勻漿機（Pharmacia Biotech），紫外分光光度儀（Pharmacia，美國），實時熒光定量PCR儀MX3000P（Stratagene，美國）。

2 實驗方法

2.1 分組、造模與給藥

將大鼠隨機分為正常組和模型組。正常組10只，常規(guī)飼養(yǎng)。模型組80只，不規(guī)則喂養(yǎng)4周，即大鼠每逢單日正常進食、雙日禁食，以打亂其正常的飲食節(jié)律。自由飲水，水中加入鹽酸（每升水加10 mol/L鹽酸10 mL），以破壞胃內(nèi)酸堿環(huán)境，制備大鼠胃電節(jié)律失常模型[4]。大鼠不規(guī)則喂養(yǎng)4周后，參考文獻(xiàn)[4]進行胃電生理學(xué)評價，分析胃電慢波節(jié)律。模型大鼠胃電節(jié)律異常，胃動過速、胃動過緩和節(jié)律紊亂，與正常組比較有顯著差異，提示造模成功。將標(biāo)記好的80只模型大鼠隨機分為模型組、辛開組、苦降組、甘補組、辛開苦降組、辛開甘補組、苦降甘補組、全方組，每組10只。相當(dāng)于人單位體質(zhì)量原藥材量的10倍，即得大鼠每日喂食用藥量。各給藥組每日按相同藥物濃度不等體積（5 mL/kg）給予相應(yīng)藥液灌胃，每日1次，連續(xù)4周。正常組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃。

2.2 胃電生理學(xué)評價

給藥4周后，大鼠禁食18 h，腹腔注射3.5%水合氯醛（1 mL/100 g）麻醉，固定后腹部備皮，常規(guī)消毒，于劍突下正中切開腹壁1～2 cm，暴露胃竇部，在距幽門0.5 cm處漿膜下埋置一對Ag-AgCl電極，兩電極間距3 mm，還原暴露的胃組織，接地電極插入大鼠腿部肌肉處固定。將三股電極連接于多導(dǎo)生理儀上。打開Acqknowledge4.1，胃電橫軸時間以1 min為單位，縱軸振幅以2 mV為單位進行胃電記錄，每次記錄30 min。胃電記錄完畢，用2/0縫合線縫合切口，碘伏擦拭。術(shù)后大鼠腹腔注射青霉素40萬U/（d·只），連續(xù)3 d。術(shù)后1周取材。胃電記錄以每10 min為1個時間段，計算每只大鼠每個時間段的慢波頻率以及每只大鼠慢波頻率變異系數(shù)[4]，進行胃電參數(shù)分析。

2.3 免疫組織化學(xué)法檢測胃組織Cx43表達(dá)

大鼠禁食18 h后，3.5%水合氯醛（1 mL/100 g）腹腔注射麻醉，背位固定，取出胃組織，生理鹽水沖洗干凈后，4%多聚甲醛固定。采用SABC免疫組化檢測法胃組織Cx43表達(dá)，具體步驟按照試劑盒說明書進行。采用SPOT software V3.0Ⅱ圖像拍攝系統(tǒng)，將染色后的病理切片在10倍光鏡下觀察后，在40倍鏡下每例標(biāo)本隨機選擇肌間神經(jīng)叢的5個最能反映胃壁全貌的視野，觀察Cx43表達(dá)分布情況，結(jié)果進行半定量分析，檢測平均光密度值，計算積分光密度值（IOD）。以細(xì)胞質(zhì)有明確棕色或棕黃色著色而細(xì)胞核無著色為陽性表達(dá)。

2.4 RT-PCR檢測大鼠胃壁Cx43基因表達(dá)

取胃組織30 mg，置于冰上，加Trizol勻漿，按照常規(guī)操作順序提取總RNA，紫外分光光度計檢測OD260和OD280，計算總RNA的濃度及純度。取2 μg總RNA，在鳥類成髓細(xì)胞瘤反轉(zhuǎn)錄酶（AMV）和Oligo（dT）條件下進行反轉(zhuǎn)錄，70 ℃×10 min，4 ℃×5 min，42 ℃×30 min，95 ℃×5 min，4 ℃×5 min，獲得cDNA。以cDNA為模板進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μL，含2 μL cDNA，10 μmol/L上下游引物各1 μL，5×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL。

根據(jù)文獻(xiàn)[5]設(shè)計引物。Cx43引物序列：上游5'-ACTTCAGCCTCCAAGGAGTTC-3'，下游5'-CATGTCTGG GCACCTCTCTTT-3'，產(chǎn)物長度80 bp；以GAPDH作為內(nèi)參照。上游5'-GCTCTCTGCTCCTCC CTGTTCTAGA-3'，下游5'-CCGTTCACACCGACCTTCACCAT-3'，產(chǎn)物長度95 bp。2條引物擴增效率均為90%～100%。GAPDH、Cx43擴增條件為：95 ℃×5 min預(yù)變性；95 ℃×30 s，55 ℃×30 s，72 ℃×30 s，40個循環(huán)；95 ℃×1 min，55 ℃×30 s，95 ℃×30 s，1個循環(huán)。

每個樣品設(shè)立3個復(fù)孔，取均值。將所得Ct值按照2-ΔΔCt的方法進行均一化處理后進行統(tǒng)計學(xué)分析。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)用—x±s表示，所有數(shù)據(jù)剔除隨機誤差及人為因素導(dǎo)致的過高或過低的測量值，隨后進行正態(tài)性檢驗，非正態(tài)分布時，采用非參數(shù)K個獨立樣本檢驗；服從正態(tài)分布時，進行方差齊性檢驗，方差齊時采用方差分析，方差不齊采用非參數(shù)檢驗；各給藥組與模型組比較采用Dunnett's T3檢驗；各給藥組之間兩兩比較采用Tukey's Multiple Comparison Test檢驗；各給藥組之間是否有交互作用采用析因分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 半夏瀉心湯及其拆方對大鼠胃電慢波頻率變異系數(shù)的影響

如圖1所示，正常組大鼠胃電節(jié)律正常，模型組大鼠胃電節(jié)律異常，胃動過速或過緩，節(jié)律紊亂。模型組大鼠胃電慢波頻率變異系數(shù)最大，與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），各給藥組胃電節(jié)律均有不同程度改善，胃電慢波頻率變異系數(shù)低于模型組，各組慢波頻率變異系數(shù)為辛開苦降組<辛開甘補組<全方組<甘補組<苦降甘補組<苦降組<辛開組<模型組，但僅全方組、甘補組、辛開苦降組、辛開甘補組與之比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01），見表1。提示半夏瀉心湯及其拆方各組具有不同程度糾正胃電節(jié)律失常的作用。

4.2 半夏瀉心湯及其拆方對大鼠胃組織Cx43表達(dá)的影響

Cx43陽性表達(dá)為環(huán)形肌層間夾雜的深淺不同的棕黃色著色，Cx43陽性表達(dá)水平用IOD表示，IOD值越高其陽性表達(dá)水平越高，即Cx43蛋白含量越高。與正常組比較，模型組、各給藥組Cx43的棕黃色陽性表達(dá)增高，Cx43 IOD值增高，其中模型組肌間神經(jīng)叢Cx43陽性表達(dá)最為密集，且圖片顯示分布不均勻，并以環(huán)形肌之間為多，模型組陽性表達(dá)IOD值顯著增高（P<0.05）。與模型組比較，各給藥組Cx43的棕黃色陽性表達(dá)降低，Cx43 IOD值降低。各給藥組中，辛開甘補組Cx43表達(dá)顯著降低，散在分布于肌層間。各組胃組織Cx43陽性表達(dá)排序為：辛開甘補組<甘補組<辛開苦降組<辛開組<全方組<苦降甘補組<苦降組<模型組。見表2、圖2。

4.3 半夏瀉心湯及其拆方對大鼠胃組織Cx43 mRNA表達(dá)的影響

模型組大鼠胃組織Cx43 mRNA表達(dá)明顯高于正常組（P<0.05）；各給藥組Cx43 mRNA表達(dá)均低于模型組（P<0.001），其中苦降組、甘補組、辛開苦降組、全方組、辛開甘補組、苦降甘補組與之比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。析因分析結(jié)果顯示，各給藥組間無明顯差異，甘補組在全方配伍中起主要作用，各給藥組間不存在交互作用。見表3。

5 討論

胃運動功能障礙可歸屬于中醫(yī)“痞證”范疇，半夏瀉心湯為治療痞證的經(jīng)典方，研究其調(diào)節(jié)胃運動的分子機制對進一步闡明胃腸道運動功能障礙機制具有重要意義。對胃電節(jié)律失常引起的胃運動功能亢進，半夏瀉心湯及其拆方是否有調(diào)節(jié)作用及其相應(yīng)作用機制，目前尚未見相關(guān)文獻(xiàn)研究。胃電節(jié)律的改變與Cajal間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的減少或增加密切相關(guān)，胃壁Cajal數(shù)量表達(dá)是否正常對調(diào)節(jié)胃運動至關(guān)重要。ICC、胃腸神經(jīng)以及SMC間可形成網(wǎng)絡(luò)狀連接。胃腸神經(jīng)-ICC-平滑肌網(wǎng)絡(luò)是胃腸動力的基本功能單位，可以傳導(dǎo)電興奮，介導(dǎo)神經(jīng)遞質(zhì)的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)，對揭示多種胃腸道功能障礙性疾病的發(fā)病機制具有重要作用，這種細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)即通過GJ實現(xiàn)。

Cx43是構(gòu)成GJ最重要的連接蛋白，與胃腸運動有密切關(guān)系。修復(fù)ICC和促進ICC的再生能夠上調(diào)Cx43蛋白的表達(dá)，增加神經(jīng)纖維的數(shù)目，從而保持胃腸神經(jīng)-ICC-SMC網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的完整，恢復(fù)胃腸動力[6]。有研究表明，糖尿病胃輕癱大鼠胃縱肌層內(nèi)ICC分布減少，環(huán)形肌內(nèi)Cx43的表達(dá)下降，而補充胰島素可逆轉(zhuǎn)糖尿病大鼠ICC、Cx43病變從而改善胃動力障礙[7]，提示Cx43表達(dá)增高對胃運動有促進作用。因此，通過探究Cx43在胃腸運動障礙性疾病中的作用機制，對進一步揭示半夏瀉心湯治療胃電節(jié)律紊亂的作用機制，探究經(jīng)方配伍規(guī)律意義較大。

本實驗結(jié)果表明，模型組與正常組比較慢波頻率變異系數(shù)顯著增高，各給藥組與模型組比較慢波頻率變異系數(shù)有不同程度降低，提示半夏瀉心湯及其各拆方組具有調(diào)節(jié)胃電節(jié)律的作用。電節(jié)律紊亂的模型組其Cx43在胃組織上的分布表達(dá)顯著高于正常組，且分布不均勻，提示胃電節(jié)律紊亂引起的胃動過速可能與Cx43異常增高表達(dá)有密切關(guān)聯(lián)。半定量分析結(jié)果顯示，各給藥組均對Cx43表達(dá)量有不同程度降低作用，辛開甘補組Cx43陽性表達(dá)顯著降低。各給藥組與模型組比較，Cx43陽性表達(dá)均有不同程度的降低，提示各給藥組對胃組織縫隙連接Cx43的表達(dá)分布均具有不同程度降低作用。

本實驗結(jié)果還表明，半夏瀉心湯及其拆方干預(yù)可以影響Cx43 mRNA的表達(dá)，各給藥組都可以有效降低胃組織Cx43 mRNA的異常增高表達(dá)，其中苦降甘補組對Cx43 mRNA的抑制最顯著，提示半夏瀉心湯組方抑制Cx43 mRNA表達(dá)，主要通過苦降藥物與甘補藥物的協(xié)同配伍來實現(xiàn)。相關(guān)研究表明，采用苦寒瀉下法建立的大鼠脾氣虛模型，胃肌層Cx43表達(dá)降低[8]，也提示苦瀉藥物對Cx43的表達(dá)有抑制作用。綜合上述結(jié)果，模型組慢波頻率變異系數(shù)增高，Cx43表達(dá)增強，基于Cx43表達(dá)增高對胃腸運動有促進作用。因此，我們推測Cx43表達(dá)異常增高會誘導(dǎo)胃電節(jié)律紊亂引起胃動過速，從而導(dǎo)致胃運動功能亢進。半夏瀉心湯通過辛開、苦降、甘補藥物協(xié)同配伍作用從而降低Cx43的表達(dá)。由此我們推測半夏瀉心湯方不僅能治療胃動過緩導(dǎo)致胃運動功能障礙的心下痞證，還能通過抑制Cx43過表達(dá)有效抑制胃電節(jié)律紊亂引起的胃動過速，從而改善胃運動功能亢進癥狀，對胃運動功能起雙向調(diào)節(jié)的作用。各拆方組間協(xié)同作用機制還有待進一步研究。

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（收稿日期：2015-01-07）

（修回日期：2015-02-05；編輯：華強）