星點(diǎn)設(shè)計(jì)—效應(yīng)面法優(yōu)選治前膠囊的提取工藝

鄒龍等

摘要：目的 優(yōu)選治前膠囊的提取工藝，為將該制劑開(kāi)發(fā)成中藥新藥提供依據(jù)。方法 以浸泡時(shí)間、加水量、提取時(shí)間為主要影響因素，以浸膏得率和秦皮乙素浸出量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)和星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選治前膠囊的最佳提取工藝。結(jié)果 優(yōu)選的最佳提取工藝條件為：回流提取2次，第1次加10倍量水、提取2.5 h，第2次加8倍量水、提取2 h。結(jié)論 優(yōu)選的最佳提取工藝條件對(duì)秦皮乙素提取效率高，經(jīng)濟(jì)、合理、簡(jiǎn)單可行。

關(guān)鍵詞：治前膠囊；星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法；提取工藝；秦皮乙素

中圖分類(lèi)號(hào)：R283.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2015）06-0083-04

前列腺炎是男科臨床常見(jiàn)的難治性泌尿系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，因此治療前列腺炎的方藥研究越來(lái)越受到重視。治前膠囊由紫花地丁、千里光、金銀花等藥味組成，在沅陵縣中醫(yī)男性病醫(yī)院（省級(jí)重點(diǎn)專(zhuān)科-不育不孕專(zhuān)科醫(yī)院）使用20余年，療效確切。方中紫花地丁為君藥，清熱解毒、涼血消腫，具有明顯的抗菌、抗病毒、消炎作用，現(xiàn)代研究表明秦皮乙素為其主要藥效成分[1]，對(duì)治療細(xì)菌性前列腺炎有很好的療效。目前，對(duì)于提取工藝的研究多采用正交試驗(yàn)法，易忽略多個(gè)因素面間的相互影響，降低了提取效率。本試驗(yàn)以浸膏得率、秦皮乙素浸出量為考察指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選該方最佳水提工藝方法，準(zhǔn)確度高，預(yù)測(cè)指導(dǎo)性更強(qiáng)，為將治前膠囊開(kāi)發(fā)成中藥新藥提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1200高效液相色譜儀（紫外可變波長(zhǎng)檢測(cè)器，Agilent Chemstation色譜工作站）；Welchrom- C18柱；AR124CN電子天平（奧豪斯儀器上海有限公司）；RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；HH-600三用恒溫水箱（金壇市神科儀器廠）；DZF-6050真空干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

紫花地丁、金銀花、千里光、魚(yú)腥草、知母（湖南君昊中藥飲片科貿(mào)有限公司，批號(hào)130901，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院鑒定教研室劉塔斯教授鑒定，符合2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定）；秦皮乙素對(duì)照品（供含量測(cè)定用，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110741-200506）；甲醇為色譜純，水為怡寶純凈水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 秦皮乙素含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 Welchrom C18柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm），甲醇-0.1%磷酸水溶液（19∶81）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為349 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫30 ℃[2-3]。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 取秦皮乙素對(duì)照品15 mg，精密稱(chēng)定，置250 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 取提取液，配制成50%甲醇溶液，3000 r/min 離心15 min，取上清液，即得。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取濃度分別為3.1、6.2、12.4、18.6、24.8、31.0、62.0 μg/mL的對(duì)照品溶液10 μL進(jìn)樣，測(cè)定秦皮乙素峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=34.684X-11.13（r2=0.999 7），秦皮乙素在0.031～0.620 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定秦皮乙素峰面積。結(jié)果RSD=0.30%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批藥材，按“2.1.3”項(xiàng)下方法，平行6份，測(cè)定秦皮乙素峰面積。結(jié)果RSD=0.72%，說(shuō)明本方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液10 μL，分別于0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣，測(cè)定秦皮乙素峰面積，RSD=0.61%，說(shuō)明供試品在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取已知含量的提取液樣品5 mL，共6份，分別精密加入秦皮乙素對(duì)照品溶液2.5 mL，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備，吸取10 μL，注入色譜儀，測(cè)定。結(jié)果秦皮乙素的平均加樣回收率為100.51%，RSD=2.12%，說(shuō)明供試品回收率良好。

2.1.9 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 優(yōu)選最佳提取工藝

2.2.1 提取次數(shù)的選擇 因提取次數(shù)為非連續(xù)變量，回歸處理較困難，因此采用單因素試驗(yàn)[4]進(jìn)行選擇。按處方量稱(chēng)取紫花地丁30 g、魚(yú)腥草30 g、金銀花30 g、千里光30 g、知母20 g，加10倍量水提取3次，每次2 h，濾過(guò)，合并前2次提取液，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備，測(cè)定前2次合并提取液與第3次提取液中秦皮乙素的含量和浸膏得率（見(jiàn)表1）。結(jié)果表明，提取2次的秦皮乙素浸出量已超過(guò)90%，從節(jié)約生產(chǎn)成本的因素考慮，將提取次數(shù)定為2次。

2.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取浸泡時(shí)間、加水量、提取時(shí)間3個(gè)考察因素，每個(gè)因素設(shè)5個(gè)水平，并以浸膏得率和秦皮乙素浸出量為指標(biāo)，兩指標(biāo)所占百分比分別為40%、60%，進(jìn)行綜合評(píng)分，對(duì)總分進(jìn)行方差分析。用星點(diǎn)設(shè)計(jì)三因素五水平[5]安排試驗(yàn)（見(jiàn)表2），試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3，采用design-expert軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，方差分析見(jiàn)表4。

2.2.3 模型擬合與方差分析 采用design-expert 7.0.0軟件處理數(shù)據(jù)，以綜合評(píng)分為指標(biāo)進(jìn)行二項(xiàng)式擬合，得到二項(xiàng)式擬合方程R=74.85+0.70A+19.21B+4.45C+0.72AB+0.36AC-1.83BC+1.60A2-4.98B2+2.89C2（r2=0.980 5）。結(jié)果表明，多元二項(xiàng)式擬合方程相關(guān)系數(shù)較高，擬合效果較好。其中，A、B、C、A2、B2、C2項(xiàng)為三因素的單獨(dú)影響，而AB、AC、BC項(xiàng)為因素間的交互作用。采用ANOVA分析效應(yīng)面回歸參數(shù)，由表4可知，A（浸泡時(shí)間）沒(méi)有顯著影響，B（加水量）、C（提取時(shí)間）有極顯著影響，所有交互項(xiàng)沒(méi)有顯著影響。二項(xiàng)式回歸方程失擬項(xiàng)沒(méi)有顯著差異，擬合項(xiàng)差異極顯著，說(shuō)明模型的擬合效果很好，可以對(duì)不同條件下的提取工藝進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2.2.4 效應(yīng)面優(yōu)化、預(yù)測(cè)與驗(yàn)證 根據(jù)二次多項(xiàng)式模型，繪制三因素綜合評(píng)分與各因素間的三維效應(yīng)面圖，見(jiàn)圖2。

采用design-expert軟件對(duì)模型進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)各因素水平的范圍，選擇效應(yīng)值極大值，篩選得到最佳的提取工藝條件：浸泡時(shí)間1.59 h，加水量18.76倍，提取時(shí)間4.69 h，此時(shí)綜合評(píng)分預(yù)測(cè)值為97.85。考慮到生產(chǎn)實(shí)際及浸泡時(shí)間沒(méi)有顯著影響，對(duì)各因素進(jìn)行調(diào)整，確定最佳的提取工藝條件：浸泡時(shí)間0 h，提取2次，第1次加10倍量水、提取2.5 h，第2次加8倍量水，提取2 h。

在選取的最佳工藝條件下，按處方量稱(chēng)取紫花地丁30 g、魚(yú)腥草30 g、金銀花30 g、千里光30 g、知母20 g，平行進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)（見(jiàn)表5），進(jìn)行理論值與實(shí)測(cè)值的比較：理論值為97.85，實(shí)測(cè)值為99.09，偏差率[（實(shí)測(cè)值-理論值）÷理論值×100%]為1.27%，表明所建立的數(shù)學(xué)模型具有良好的預(yù)測(cè)性[6]，所選的最佳工藝條件重現(xiàn)性好。

3 討論

目前針對(duì)制劑提取工藝的研究多數(shù)采用正交設(shè)計(jì)的方法，考察的是線和線之間的關(guān)系，對(duì)面間的關(guān)系考察不足，沒(méi)有考慮到各因素間的相互作用，但在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，各因素間往往存在著較大的共同作用[7]。星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)是在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上建立的，確定中心點(diǎn)，避免最佳值與預(yù)測(cè)值間的偏離，且考慮到了面和面間相互的影響作用，對(duì)優(yōu)選最佳工藝條件的預(yù)測(cè)性好。采用design-expert軟件對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行安排，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，簡(jiǎn)單方便，可信度高，與正交設(shè)計(jì)、均勻設(shè)計(jì)相比更加直觀、全面。

本試驗(yàn)采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選治前膠囊的最佳提取工藝，以浸泡時(shí)間、加水量、提取時(shí)間為主要影響因素，以浸膏得率、秦皮乙素浸出量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行加權(quán)綜合評(píng)分，對(duì)面間的關(guān)系進(jìn)行考察，充分考慮到了各因素之間的相互影響。最終確定治前膠囊的最佳提取工藝條件為：回流提取2次， 第1次加10倍量水、提取2.5 h，第2次加8倍量水、提取2 h。結(jié)果表明，本工藝方法簡(jiǎn)單可行、經(jīng)濟(jì)、合理，對(duì)秦皮乙素的提取效率高，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 胥愛(ài)麗，江潔儀，羅文匯，等.HPLC法測(cè)定紫花地丁配方顆粒中秦皮乙素的含量[J].江西中醫(yī)藥，2013，44（3）：61-62.

[2] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：254.

[3] 王冬萍，周建華，蔣慧.HPLC法測(cè)定二丁片中秦皮乙素的含量[J].中國(guó)保健營(yíng)養(yǎng)，2012，22（10）：1566-1567.

[4] 陳衛(wèi)衛(wèi)，馮看，彭晶蕊.星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選抗炎退熱顆粒的提取工藝[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（9）：41-43.

[5] 涂瑤生，李紹林，孫冬梅，等.星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選苦參提取工藝[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（5）：34-37.

[6] 劉艷杰，項(xiàng)榮武.星點(diǎn)設(shè)計(jì)效應(yīng)面法在藥學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的應(yīng)用[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2007，24（6）：455-457.

[7] 歐陽(yáng)小光，楊璐.星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選五味子提取工藝[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2012，19（4）：58-60.

（收稿日期：2014-10-28；編輯：陳靜）