仙附溫陽通絡飲對血栓閉塞性脈管炎模型大鼠抗中性粒細胞抗體相關抗原的影響

趙晶等

摘要：目的 觀察仙附溫陽通絡飲對血栓閉塞性脈管炎（TAO）模型大鼠抗中性粒細胞抗體（ANCA）相關抗原的影響，探討其作用機制。方法 SPF級Wistar雄性成年大鼠72只，隨機分為假手術(shù)組、模型組、脈絡寧顆粒組及仙附溫陽通絡飲低、中、高劑量組。以股動脈注射月桂酸鈉溶液方法造模。造模后次日開始給藥，假手術(shù)組、模型組給予蒸餾水灌胃，其他各組給予相應藥物灌胃。給藥15 d后取材，采用紫外分光光度法檢測血清中髓過氧化物酶（MPO）活性，免疫組化法檢測股動脈及周圍組織中蛋白酶3（PR3）和溶酶體相關膜蛋白-2（LAMP-2）蛋白表達。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中MPO活性及PR3、LAMP-2蛋白表達均升高；與模型組比較，各給藥組MPO活性及PR3、LAMP-2蛋白表達降低，其中仙附溫陽通絡飲中劑量組下降最明顯。結(jié)論 仙附溫陽通絡飲可能通過降低ANCA相關抗原水平，進一步抑制體液免疫功能亢進。

關鍵詞：仙附溫陽通絡飲；血栓閉塞性脈管炎；抗中性粒細胞抗體；髓過氧化物酶；蛋白酶3；溶酶體相關膜蛋白-2；體液免疫；大鼠

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2015）06-0080-04

血栓閉塞性脈管炎（thromboangiitis obliterans， TAO）是一種節(jié)段性、非粥樣硬化性、阻塞性血管疾病，病變主要累及肢體遠端的中小動脈和靜脈，屬中醫(yī)“脫疽”范疇。由于該病具有高致殘率及易復發(fā)特性，且流行病學調(diào)查顯示，其發(fā)病年齡有提前趨勢，非吸煙人群及女性也有發(fā)生[1]，因而引起學者的廣泛關注和深入研究。前期臨床研究表明，仙附溫陽通絡飲對TAO具有獨特的療效[2]。本研究通過觀察仙附溫陽通絡飲對TAO模型大鼠血清及組織中抗中性粒細胞抗體（ANCA）特異性抗原髓過氧化物酶（MPO）活性及蛋白酶3（PR3）、溶酶體相關膜蛋白-2（LAMP-2）蛋白表達的影響，探討其作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

Wistar雄性成年大鼠72只，體質(zhì)量（300±50）g， SPF級，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK（京）2012-0001。動物飼養(yǎng)于黑龍江省中醫(yī)藥科學院動物實驗中心屏障系統(tǒng)，水和飼料（北京科奧協(xié)力飼料有限公司）自由飲食，水為pH 3.0酸化純凈水。

1.2 藥物

仙附溫陽通絡飲方（附子、淫羊藿、黃芪、黨參、肉桂、赤芍等），江陰天江藥業(yè)有限公司，批號1405057；脈絡寧顆粒，江西銀濤藥業(yè)有限公司，批號1304015；月桂酸鈉，天津市博迪化工有限公司，批號20120529。

1.3 主要試劑與儀器

PR3（D-1）Antibody，美國Santacruz公司，貨號sc-74534；MPO測試盒，南京建成生物有限公司，貨號A044；LAMP-2（H-207）Antibody，美國Santacruz公司，貨號sc-5571；山羊抗兔IgG抗體，北京中杉金橋生物技術(shù)公司，貨號PV-6001。紫外可見分光光度計，澳大利亞GBC公司；冰凍切片機，德國Leica公司；CX40光學顯微鏡，日本Olympus公司。

2 實驗方法

2.1 分組

實驗鼠基礎飼料適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分成假手術(shù)組、模型組、脈絡寧組和仙附溫陽通絡飲低、中、高劑量組（低、中、高劑量組），每組12只。

2.2 造模

參考文獻[3]方法，采用股動脈注射月桂酸鈉溶液方法造模：腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，向右后肢股動脈遠心端注入0.1 mL濃度為10 g/mL月桂酸鈉溶液，假手術(shù)組注射生理鹽水。手術(shù)完畢后給予腹腔注射青霉素，以防感染。

2.3 給藥

假手術(shù)組、模型組給予蒸餾水灌胃，脈絡寧組和低、中、高劑量組給予脈絡寧溶液和不同劑量仙附溫陽通絡飲溶液灌胃。根據(jù)人與大鼠單位體質(zhì)量折算系數(shù)計算原藥材含量，其中脈絡寧溶液含原藥材0.27 g/mL，低、中、高劑量組給予仙附溫陽通絡飲溶液0.734、1.467、2.934 g/mL，中劑量組原藥材含量相當于臨床成人用藥量。給藥體積10 mL/（kg·d），連續(xù)15 d。

2.4 指標檢測

10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉后，經(jīng)腹主動脈采集血液標本，EDTA抗凝，4 ℃、3000 r/min離心6 min，取上清液分裝，按MPO測試盒于說明進行樣本前處理，應用紫外分光光度計檢測各組實驗大鼠血清對照管及測定管的光密度（OD值），并計算MPO活性[（測定OD值-對照OD值）÷11.3×取樣中所含血清量]。

患肢分離后取月桂酸注射處以下部位的股動脈及周圍肌肉組織，置于4%多聚甲醛固定，待組織被完全浸透后取出室溫晾干，經(jīng)二甲苯透明、梯度乙醇組織復水、抗原修復、石蠟包埋切片，行組織化學染色、脫水封片等常規(guī)免疫組化方法處理后，于鏡下觀察大鼠股動脈及周圍組織PR3、LAMP-2蛋白表達變化，并拍照留存，應用ImagePro Plus6.0軟件進行蛋白表達半定量分析。

3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

4 結(jié)果

4.1 仙附溫陽通絡飲對模型大鼠血清中髓過氧化物酶活性的影響

與假手術(shù)組比較，大鼠造模后血清中MPO活性升高（P<0.01），說明TAO造模成功。與模型組比較，各給藥組MPO活性降低（P<0.05，P<0.01），其中，中劑量組下降最明顯。結(jié)果見表1。

4.2 仙附溫陽通絡飲對模型大鼠股動脈及周圍組織中蛋白酶3、溶酶體相關膜蛋白-2蛋白表達的影響

高倍鏡下觀察，模型組大鼠股動脈及周圍組織中PR3、LAMP-2蛋白表達增加，主要集中于中性粒細胞的胞漿內(nèi)，圍繞在細胞核周圍，見圖1、圖2。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠PR3、LAMP-2蛋白表達量顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，中、高劑量組PR3、LAMP-2蛋白表達量降低（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見表2。

5 討論

TAO的發(fā)病機制至今尚未明確，但免疫學方面的研究進展提示該病的發(fā)生存在體液免疫功能的異常[4]。其中ANCA被廣泛認為在TAO發(fā)病機制中起重要作用，是臨床檢驗常用的重要指標之一[5]。迄今為止，已有10余種中性粒細胞胞漿成分被證實為ANCA的靶抗原，其中較為經(jīng)典的是MPO和PR3[6]。研究表明，LAMP-2在細胞黏附、抗原遞呈和維持細胞穩(wěn)態(tài)中起重要作用[7]。盡管ANCA的抗原種類繁多，但不同的抗原系統(tǒng)與不同的疾病發(fā)生相關，迄今為止，大多數(shù)學者研究認為，TAO的發(fā)生與MPO、PR3和LAMP-2密切相關。

中醫(yī)認為，肝腎虧虛、精血不足是脫疽發(fā)生的重要因素，臨床以溫陽通絡為基本治療法則。仙附溫陽通絡飲以附子、淫羊藿為君藥，以黃芪、肉桂、黨參、赤芍等為臣藥，立旨于溫腎散寒、活血行氣、通絡止痛?，F(xiàn)代藥理研究表明，方中君藥附子能顯著增強腎上腺皮質(zhì)激素的分泌，調(diào)節(jié)體液免疫中各種免疫球蛋白代謝，從而增強機體的免疫功能[8]；淫羊藿中的主要化學成分淫羊藿總黃酮亦可通過直接增加免疫細胞數(shù)量，促進免疫細胞分泌淋巴因子，提高體液免疫和細胞免疫能力，進而增強機體免疫力[9]；臣藥黃芪能提高免疫球蛋白的分泌和排泄、促進抗體產(chǎn)生、對B淋巴細胞免疫功能具有明顯的增強作用[10]?？v觀全方，仙附溫陽通絡飲可以通過直接影響細胞內(nèi)物質(zhì)代謝或誘導機體細胞產(chǎn)生相關體液因子等途徑調(diào)節(jié)機體的免疫功能。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，TAO模型大鼠血清中MPO活力、股動脈血管及周圍肌肉組織中PR3和LAMP-2蛋白表達顯著升高（P<0.01），與文獻報道的MPO、PR3和LAMP-2抗原與TAO發(fā)生有關相符。與模型組比較，各給藥組上述指標均不同程度降低（P<0.05），中劑量組治療后效果最為顯著（P<0.01）。表明臨床劑量仙附溫陽通絡飲對月桂酸所致的TAO模型大鼠具有較好的治療作用，其作用機制可能與降低ANCA相關抗原水平、進一步抑制體液免疫功能亢進相關。

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（收稿日期：2014-12-11；編輯：華強）