HPLC—DAD同時(shí)測(cè)定黃芪生脈飲中4種成分含量

陸鋮 周盛會(huì) 李煒 鄭修麗 高慶劍 湯浩

摘要：目的 采用高效液相色譜法建立同時(shí)測(cè)定黃芪生脈飲中五味子乙素、五味子酯甲、黨參炔苷和魯斯可皂苷元含量的方法。方法 色譜柱：Agilent Eclipse C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：乙腈-0.1%冰醋酸水溶液，梯度洗脫；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm。結(jié)果 五味子乙素、五味子酯甲、黨參炔苷和魯斯可皂苷元的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性關(guān)系良好，線(xiàn)性范圍分別為0.862 5～21.562 5 μg（r2=0.999 1）、0.737 5～18.437 5 μg（r2=0.999 4）、0.095 2～2.380 0 μg（r2=0.999 6）、0.810 0～20.250 0 μg（r2=0.999 0），平均回收率分別為98.06%、99.61%、97.98%、99.30%，RSD分別為1.64%、2.72%、1.45%、1.25%。結(jié)論 該法準(zhǔn)確可靠、快速、專(zhuān)屬性強(qiáng)、結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性好。

關(guān)鍵詞：黃芪生脈飲；五味子乙素；五味子酯甲；黨參炔苷；魯斯可皂苷元；高效液相色譜法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.07.027

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2015）07-0096-04

Simultaneous Determination of Four Components in Huangqi Shengmai Decoction by HPLC-DAD LU Cheng1，2， ZHOU Sheng-hui1，2， LI Wei2， ZHENG Xiu-li2， GAO Qing-jian1，2， TANG Hao2 （1.School of Pharmacy， Ningxia Medical University， Yinchuan 750000， China；2.Gansu Provincial Hospital， Lanzhou 730000， China）

Abstract：Objective To establish a method for simultaneous determination of contents of schisandrin B， schisantherin A， lobetyolin and ruscogenin in Huangqi Shengmai Decoction with HPLC method. Methods The chromatographic column was an Agilent Eclipse C18 column （4.6 mm × 250 mm， 5 μm） that was maintained at a constant temperature of 30 ℃. The mobile phase was 0.1% acetic acid solution-acetonitrile， with gradient elution. The flow rate was 1.0 mL/min. The detection was at wavelength of 280 nm. Results The standard curves of schisandrin B， schisantherin A， lobetyolin and ruscogenin had good linearity in the ranges of 0.862 5-21.562 5 μg （r2=0.999 1）， 0.737 5-18.437 5μg （r2=0.999 4）， 0.095 2-2.380 0 μg （r2=0.999 6）， and 0.810 0- 20.250 0 μg （r2=0.999 0）， respectively. The average recoveries of the four components were 98.06% （RSD=1.64%）， 99.61% （RSD=2.72%）， 97.98% （RSD=1.45%）， and 99.30% （RSD=1.25%）， respectively. Conclusion This method is accurate， rapid and specific， achieving the stable results with high reproducibility.

Key words：Huangqi Shengmai Decoction；schisandrin B；schisantherin A；lobetyolin；ruscogenin；HPLC

黃芪生脈飲由黃芪、黨參、麥冬、五味子、南五味子5味藥組成，是由古方生脈散演變而來(lái)。生脈散處方源自張?jiān)亍夺t(yī)學(xué)啟源》，具有益氣滋陰、養(yǎng)心補(bǔ)肺功效[1]。目前已有大量關(guān)于黃芪生脈飲臨床應(yīng)用的文獻(xiàn)報(bào)道[2-3]。2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）[4]記載，黃芪甲苷、五味子乙素、五味子酯甲、黨參炔苷、魯斯可皂苷元分別是黃芪、五味子、南五味

通訊作者：湯浩，E-mail：gsyy_th@sina.cn

子、黨參和麥冬的主要有效成分。

目前，關(guān)于黃芪生脈飲中有效成分的測(cè)定多集中于黃芪甲苷[5-6]，尚未見(jiàn)對(duì)黃芪生脈飲中其余有效成分同時(shí)進(jìn)行定量分析的文獻(xiàn)報(bào)道?！吨腥A人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑（第十六冊(cè)）》僅有對(duì)黃芪生脈飲相對(duì)密度的測(cè)定，而無(wú)對(duì)該制劑有效成分的定量測(cè)定項(xiàng)[7]。因此，本試驗(yàn)采用高效液相色譜法（HPLC）同時(shí)測(cè)定黃芪生脈飲中五味子乙素、五味子酯甲、黨參炔苷和魯斯可皂苷元的含量，為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善及醫(yī)院中成藥制劑引進(jìn)的質(zhì)量測(cè)評(píng)提供參考。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀，包括G1312A二元梯度泵、G1313A自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)、G1315B二極管陣列檢測(cè)器（DAD）及Agilent LC 3D Rev A.10.02色譜工作站；AB204-N電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SK3300LHC超聲清洗儀，上?？茖?dǎo)有限公司； D-37520型臺(tái)式高速低溫離心機(jī)，德國(guó)Heraeus公司。

對(duì)照品五味子乙素（批號(hào)110765-201311）、五味子酯甲（批號(hào)111529-200604）、黨參炔苷（批號(hào)111732-201206）、魯斯可皂苷元（批號(hào)111909- 201204），中國(guó)食品藥品檢定研究院；黃芪生脈飲（浙江新光藥業(yè)有限公司，批號(hào)130802、130815、130824、130904、141024），購(gòu)自蘭州市眾友大藥房；甲醇（色譜純，批號(hào)20140306），天津市大茂化學(xué)試劑廠；乙腈（色譜純，批號(hào)20140510），天津市大茂化學(xué)試劑廠；冰醋酸（分析純，批號(hào)20030419），天津市泰興試劑廠；乙醚（分析純，批號(hào)110105），天津市富宇精細(xì)化工有限公司；乙酸乙酯（分析純，批號(hào)910104），天津市化學(xué)試劑二廠；水為三蒸水，實(shí)驗(yàn)室自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取五味子乙素、五味子酯甲、黨參炔苷、魯斯可皂苷元對(duì)照品適量，置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成每1 mL含五味子乙素862.50 μg、五味子酯甲737.50 μg、黨參炔苷95.20 μg、魯斯可皂苷元810.00 μg的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.2 供試品溶液的制備

精密量取黃芪生脈飲樣品0.5 mL，加乙醚2 mL、乙酸乙酯2 mL，13 000 r/min離心10 min，取上清液，置于5 mL容量瓶中，加熱蒸干，加甲醇定容至刻度，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.3 陰性對(duì)照溶液的制備

按供試品的處方和制法，分別制成不含五味子、南五味子、黨參、麥冬的陰性樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.4 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse C18柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%冰醋酸水溶液，梯度洗脫條件見(jiàn)表1；柱溫：30 ℃；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；進(jìn)樣量：10 μL。對(duì)照品及樣品色譜圖見(jiàn)圖1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

時(shí)間 乙腈（%） 0.1%冰醋酸水溶液（%）

0 min 5 95

5 min 7 93

10 min 10 90

20 min 25 75

50 min 60 40

A

B

C

注：A.供試品；B.混合對(duì)照品；C.陰性對(duì)照；

1.黨參炔苷；2.魯斯可皂苷元；3.五味子乙素；4.五味子酯甲

圖1 黃芪生脈飲中4種成分HPLC圖

2.5 線(xiàn)性關(guān)系考察

分別精密吸取混合對(duì)照品溶液1、5、10、15、20、25 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積積分值，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，對(duì)照品溶液進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程，見(jiàn)表2。結(jié)果表明，五味子乙素在0.862 5～21.562 5 μg、五味子酯甲在0.737 5～18.437 5 μg、黨參炔苷在0.092 5～2.380 0 μg、魯斯可皂苷元0.810 0～20.250 0 μg范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

表2 黃芪生脈飲4種成分線(xiàn)性關(guān)系考察結(jié)果

成分 回歸方程 r2 線(xiàn)性范圍（μg）

五味子乙素 Y=1578.80X-4086.2 0.999 1 0.862 5～21.562 5

五味子酯甲 Y=1152.70X-3415.8 0.999 4 0.737 5～18.437 5

黨參炔苷 Y=488.59X-82.370 0.999 6 0.095 2～2.380 0

魯斯可皂苷元 Y=1172.70X-4007.9 0.999 0 0.810 0～20.250 0

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，在“2.4”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積積分值。結(jié)果五味子乙素RSD=1.23%、五味子酯甲R(shí)SD=1.29%、黨參炔苷RSD=1.87%、魯斯可皂苷元RSD=1.20%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一樣品（批號(hào)130815），按“2.2”項(xiàng)下方法制得供試品溶液，分別于0、4、8、12、24 h測(cè)定。結(jié)果顯示，供試品溶液中五味子乙素、五味子酯甲、黨參炔苷、魯斯可皂苷元的峰面積RSD分別為1.35%、1.78%、1.46%、1.13%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一樣品（批號(hào)130815）5份，按“2.2”項(xiàng)下方法制得供試品溶液，在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果樣品中五味子乙素、五味子酯甲、黨參炔苷、魯斯可皂苷元（n=5）的RSD分別為1.09%、1.78%、1.63%、1.14%。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密量取2 mL已知含量的五味子乙素、五味子酯甲、黨參炔苷、魯斯可皂苷元樣品（批號(hào)130815）6份，分別精密加入1 mL不同濃度五味子乙素（215.6、431.3、862.5 μg/mL）、五味子酯甲（184.4、368.8、737.5 μg/mL）、黨參炔苷（23.8、47.5、95.2 μg/mL）、魯斯可皂苷元（101.3、202.5、405.5 μg/mL）對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法制備，依法測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 黃芪生脈飲中4種成分加樣回收率試驗(yàn)

成分 原有量

（μg） 加入量

（μg） 測(cè)得量

（μg） 回收率

（%） 平均回

收率（%） RSD

（%）

五味子乙素 505.0 215.6 718.9 99.76

505.0 215.6 719.9 99.90

505.0 431.3 898.3 95.94 98.06 1.64

505.0 431.3 904.5 96.61

505.0 862.5 1342.4 98.16

505.0 862.5 1339.7 97.96

五味子酯甲 425.6 184.4 593.7 97.33

425.6 184.4 591.5 96.97

425.6 368.8 787.1 99.09 99.61 2.72

425.6 368.8 781.4 98.37

425.6 737.5 1191.7 102.46

425.6 737.5 1203.9 103.43

黨參炔苷 143.7 23.8 165.9 99.04

143.7 23.8 164.0 97.91

143.7 47.5 189.9 99.31 97.98 1.45

143.7 47.5 189.3 98.97

143.7 95.2 231.5 96.90

143.7 95.2 228.7 95.73

魯斯可皂苷元 811.8 101.3 912.5 99.93

811.8 101.3 911.2 99.79

811.8 202.5 982.4 96.85 99.30 1.25

811.8 202.5 1011.9 99.76

811.8 405.0 1207.6 99.24

811.8 405.0 1219.7 100.24

2.10 樣品含量測(cè)定

取5批黃芪生脈飲，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣，測(cè)得峰面積積分值，計(jì)算黃芪生脈飲中五味子乙素、五味子醇甲、黨參炔苷、魯斯可皂苷元的質(zhì)量濃度，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=5）

批號(hào) 五味子乙素 五味子酯甲 黨參炔苷 魯斯可皂苷元

含量（μg/mL） RSD（%） 含量（μg/mL） RSD（%） 含量（μg/mL） RSD（%） 含量（μg/mL） RSD（%）

130802 256.7 1.10 218.6 1.81 71.8 1.86 405.9 1.15

130815 253.4 1.04 211.7 1.52 71.3 1.29 408.7 1.09

130824 249.3 1.43 209.1 1.19 69.9 1.42 406.2 1.29

130904 250.9 1.27 214.7 1.07 71.1 2.03 403.0 1.83

141024 252.2 1.09 212.8 1.11 73.1 1.23 411.7 1.01

3 討論

本試驗(yàn)采用HPLC同時(shí)測(cè)定黃芪生脈飲中五味子乙素、五味子酯甲、黨參炔苷、魯斯可皂苷元，方法簡(jiǎn)便可靠、靈敏性高、專(zhuān)屬性強(qiáng)，可為完善該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

本試驗(yàn)分別考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%冰醋酸水溶液、甲醇-0.1%冰醋酸水溶液作為流動(dòng)相體系，以各待測(cè)物基線(xiàn)分離、分離度>1.5為優(yōu)；同時(shí)對(duì)乙腈、乙醚、乙酸乙酯、乙腈-乙醚、乙腈-乙酸乙酯、乙醚-乙酸乙酯的樣本富集溶劑體系進(jìn)行優(yōu)化，測(cè)定不同方案下所選指標(biāo)待測(cè)物含量，以所選指標(biāo)成分測(cè)定含量最高為優(yōu)。最終確定流動(dòng)相系統(tǒng)為乙腈- 0.1%冰醋酸水溶液，供試品制備溶劑系統(tǒng)為乙醚-乙酸乙酯（1∶1）。

魯斯可皂苷元為麥冬主要有效成分，但關(guān)于魯斯可皂苷元的含量測(cè)定方法多集中于毛細(xì)管電泳法[8-9]，采用HPLC對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定的報(bào)道相對(duì)缺乏。本試驗(yàn)所建立的色譜方法可為麥冬中主要成分魯斯可皂苷元的HPLC含量測(cè)定提供簡(jiǎn)單、有效的檢測(cè)手段。

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（收稿日期：2015-01-30）

（修回日期：2015-03-07；編輯：陳靜）