千金子水煎液中4種有效成分含量測定

吳瑞環(huán) 張振凌 王瑞生 沈莎莎 劉小鳴

河南中醫(yī)學院，呼吸疾病診療與新藥研發(fā)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450008

摘要：目的 測定千金子水煎液中4種有效成分的含量，為千金子臨床應用入煎劑提供依據(jù)。方法 采用已建立的一測多評法測定千金子水煎液中3種二萜醇酯類成分千金子甾醇、千金子素L2、千金子素L3的含量，采用高效液相色譜法測定千金子水煎液中香豆素類成分秦皮乙素的含量。結(jié)果 千金子打碎水煎液中千金子甾醇、千金子素L2、千金子素L3含量分別0.015 9%、0.005 9%、0.024 1%，千金子整個入煎劑未檢出以上3種成分；千金子打碎水煎液中秦皮乙素含量（0.693 6%）>千金子整個水煎液中秦皮乙素含量（0.288 2%）。結(jié)論 千金子中二萜醇酯類成分水煎溶出效果不佳，臨床使用千金子瀉下利尿時不宜水煎；千金子打碎水煎時秦皮乙素溶出效果較好，臨床用于抗菌消炎可入煎劑。

關鍵詞：千金子；水煎液；二萜醇酯；香豆素

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.07.025

中圖分類號：R284.1 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2015）07-0089-04

Content Determination of Four Effective Constituents in Euphorbiae Semen Decoction WU Rui-huan， ZHANG Zhen-ling， WANG Rui-sheng， SHEN Sha-sha， LIU Xiao-ming （Collaborative Innovation Center for Respiratory Disease Diagnosis and Treatment & Chinese Medicine Development of Henan Province， Henan University of Chinese Medicine， Zhengzhou 450008， China）

Abstract：Objective To determine the contents of four effective constituents in Euphorbiae Semen decoction；To provide evidence for Euphorbiae Semen decoction into clinical application. Methods Established quantitative analysis multi-components by single marker method was used to determine the contents of diterpenoids constituents， such as euphorbia storoid， euphorbia factor L2， and euphorbia factor L3. HPLC method was used to determine the contents of aesculetin. Results Contents of euphorbia storoid， euphorbia factor L2， and euphorbia factor L3 in smashed Euphorbiae Semen decoction were 0.015 9%， 0.005 9% and 0.024 1%， respectively. However， the contents of the above three constituents could not be detected in whole Euphorbiae Semen decoction. The content of aesculetin （0.693 6%） in smashed Euphorbiae Semen decoction was more than that in whole Euphorbiae Semen decoction （0.288 2%）. Conclusion Decoction digestion effect of diterpenoids constituents in Euphorbiae Semen decoction is not good. Decocting with water is not suitable for the clinical application of Euphorbiae Semen for purgation and diuresis. Aesculetin in smashed Euphorbiae Semen decoction has good decoction digestion effect， in which clinical use for antisepsis and anti-inflammation is effective.

Key words：Euphorbiae Semen；decoction；diterpenoids；coumarin

千金子為大戟科植物續(xù)隨子Euphorbia Lathyris L.的干燥成熟種子，有毒，具有逐水消腫、破血散結(jié)功效，用于二便不通、水腫、痰飲、積滯脹滿、血瘀經(jīng)閉等癥[1]。千金子種子中含有48%～50%的脂肪油[2]，為其主要有效成分，同時又是其主要毒性成

基金項目：中醫(yī)藥行業(yè)科研專項（201107008）

通訊作者：張振凌，E-mail：zhangzl6758@163.com

分?，F(xiàn)代研究表明，千金子除含有大量脂肪油外，還含有香豆素類[3]、二萜醇酯類[4]等化學成分。2010年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定千金子生品“去殼，去油用，多入丸散服。外用適量，搗爛敷患處”，千金子霜“多入丸散服。外用適量”，均未提及水煎使用。然而，目前臨床上有千金子生品入煎劑服用，針對此用藥方法尚缺乏試驗依據(jù)。本研究采用已經(jīng)建立的“一測多評法”[5]和高效液相色譜法（HPLC）測定千金子水煎液中4種有效成分的含量，闡釋千金子入煎劑服用的合理性，為臨床用藥提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

島津LC-2010AHT高效液相色譜儀，PDA檢測器；島津LC-20AT高效液相色譜儀；METTLER TOLEDO- XS205十萬分之一天平（瑞士梅特勒托利多公司）；BS210S型萬分之一電子天平（北京賽多斯有限責任公司）；KQ-250DV型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海比郎儀器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠）；SZ-93自動雙重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）。

千金子藥材購自安徽亳州，經(jīng)河南中醫(yī)學院陳隨清教授鑒定為大戟科植物續(xù)隨子Euporbia lathyris L.的干燥成熟種子。千金子素甾醇對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號111789- 200901，純度99.3%），秦皮乙素對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號20120515，純度≥98%），正己烷（天津市科密歐化學試劑有限公司，色譜純），乙酸乙酯（西隴化工股份有限公司，色譜純），乙腈（Dikma Technologies Inc.，色譜純），甲醇（天津市四友精細化學品有限公司，色譜純），甲醇（天津市登科化學試劑有限公司，分析純），冰醋酸（天津市致遠化學試劑有限公司，分析純），石油醚（天津市富宇精細化工有限公司，分析純），雙蒸水（自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 水煎液的制備

稱取凈千金子種子4份，每份約10 g，精密稱定，分為2組，一組打碎（碎1、2號），一組不打碎（整1、2號），各2份，置于燒杯中，加入10倍量蒸餾水，浸泡30 min，加熱，保持微沸30 min，過濾，濾渣再加8倍量蒸餾水，加熱，保持微沸20 min，過濾，合并2次濾液，冷卻后定容于250 mL容量瓶中，即得。

2.2 3種二萜醇酯類成分含量測定

2.2.1 色譜條件 Agilent Zorbax-SIL色譜柱（5 μm， 4.6 mm×250 mm），流動相為正己烷-乙酸乙酯-乙腈（83.5∶14∶2.5），柱溫30 ℃，檢測波長275 nm，流速1.0 mL/min，進樣量5 μL，檢測時間20 min。色譜圖見圖1。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取千金子甾醇對照品0.003 41 g，置100 mL容量瓶中，加乙酸乙酯溶解并定容至刻度，搖勻，即得0.034 1 mg/mL對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密量取千金子水煎液25 mL，置于蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，用乙酸乙酯溶解，定容于5 mL容量瓶中，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

A

B

C

注：A.混合對照品；B.打碎入煎劑；C.整個入煎劑；

1.千金子素L3；2.千金子素L2；3.千金子甾醇

圖1 千金子水煎液中3種二萜醇酯類成分HPLC圖

2.2.4 線性關系考察 精密吸取千金子甾醇對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μL進樣，在“2.2.1”項色譜條件下測定，以峰面積為縱坐標，千金子甾醇的量（μg）為橫坐標，繪制標準曲線，進行線性回歸，得回歸方程Y=1 421 507.331 4X+3484.400 0，r2=0.999 8，千金子甾醇在0.034 1～0.170 5 μg范圍內(nèi)線性關系良好。

2.2.5 含量測定 按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，放入進樣瓶中，按“2.2.1”項下色譜條件測定，采用外標法，以峰面積計算千金子甾醇含量，根據(jù)已建立的3種二萜醇酯類成分的“一測多評”方法[5]， f千金子素L2/千金子甾醇=1.26，f千金子素L3/千金子甾醇=0.9，分別計算千金子水煎液中千金子素L2和千金子素L3的含量，結(jié)果見表1。千金子（打碎）水煎液中千金子甾醇、千金子素L2、千金子素L3含量分別為0.015 9%、0.005 9%、0.024 1%，千金子整個入煎劑未檢出以上3種成分。

2.3 秦皮乙素含量測定

2.3.1 色譜條件 ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為甲醇-0.1%冰醋酸（18∶82），流速1.0 mL/min，檢測波長340 nm，柱溫40 ℃，進樣量10 μL。色譜圖見圖2。

表1 千金子水煎液中3種二萜醇酯類成分含量測定結(jié)果

編號 稱樣量（g） 千金子甾醇 千金子素L2 千金子素L3

含量（%） 平均含量（%） 含量（%） 平均含量（%） 含量（%） 平均含量（%）

碎1號 10.024 2 0.016 096 0.005 961 0.0244 05

10.024 2 0.015 614 0.015 9 0.005 516 0.005 9 0.0240 01 0.024 1

碎2號 10.001 0 0.015 980 0.006 108 0.0239 24

10.001 0 0.016 007 0.005 832 0.0241 62

整1號 10.050 8 - - -

10.050 8 - - -

整2號 10.022 8 - - -

10.022 8 - - -

注：“-”為未檢出

A

B

C

注：A.對照品；B.打碎入煎劑；C.整個入煎劑

圖2 千金子水煎液中秦皮乙素HPLC圖

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱定秦皮乙素對照品0.000 57 g，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，搖勻，制成57 ?g/mL的對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 精密量取水煎液5 mL，置于蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，用甲醇溶解，定容于25 mL容量瓶中，0.45 ?m微孔濾膜過濾，即得。

2.3.4 線性關系考察 精密吸取57 ?g/mL秦皮乙素對照品溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10、12、14 ?L進樣，在“2.3.1”項色譜條件下測定，以峰面積為縱坐標，秦皮乙素的量（?g）為橫坐標，繪制標準曲線，進行線性回歸，得到回歸方程Y=1 896 653.714 8X-11922.302 4，r2=0.999 5，秦皮乙素在0.057～0.798 ?g范圍內(nèi)線性關系良好。

2.3.5 含量測定 按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，放入進樣瓶中，按“2.3.1”項下色譜條件測定，計算千金子水煎液中秦皮乙素含量，結(jié)果見表2。千金子（打碎）水煎液中秦皮乙素含量為0.288 2%，千金子（整個）水煎液中秦皮乙素含量為0.693 6%。

表2 千金子水煎液中秦皮乙素含量測定結(jié)果

編號 稱樣量（g） 峰面積 含量（%） 平均含量（%）

碎1號 10.024 8 1 070 736.8 0.711 8

10.024 8 1 027 418.7 0.683 3 0.693 6

碎2號 10.041 5 1 060 884.3 0.704 1

10.041 5 1 016 910.5 0.675 3

整1號 10.007 3 408 466.6 0.276 9

10.007 3 436 210.0 0.295 1 0.288 2

整2號 10.037 1 423 191.4 0.285 7

10.037 1 437 366.8 0.295 0

3 討論

本研究結(jié)果表明，4種有效成分含量千金子打碎入煎劑>千金子整個入煎劑，二萜醇酯類成分煎出較少，秦皮乙素煎出較多。千金子中含有的3種二萜醇酯類成分極性較小，用水煎煮難以溶出，所以千金子（打碎）水煎液中3種二萜醇酯類成分含量較低，千金子整個入煎劑未檢出；千金子中含有的秦皮乙素為簡單香豆素類成分，能部分溶于沸水中，因此，千金子水煎液中秦皮乙素含量較高。

千金子中二萜醇酯類成分主要為千金子甾醇、千金子素L2、千金子素L3，其中千金子甾醇對胃腸道有強烈刺激作用，可產(chǎn)生峻瀉作用，千金子素L3也具有一定的提高小鼠小腸推進率的作用[2，6]。由于這3種成分水煎溶出不佳，因此，臨床使用千金子瀉下利尿時不