24例TRFIA法檢測(cè)抗—HIV抗體初篩實(shí)驗(yàn)灰區(qū)帶結(jié)果的分析

摘要：目的 我室自使用時(shí)間分辨熒光免疫（TRFIA）法檢測(cè)抗-HIV抗體后，頻繁出現(xiàn)位于灰區(qū)帶的檢測(cè)結(jié)果，為明確該方法的方法可靠性及其高靈敏度的必要性。方法 通過對(duì)我室2013年5月～2014年5月的45378例血清樣本進(jìn)行TRFIA法檢測(cè)抗-HIV初篩試驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)有24例結(jié)果處于灰?guī)^(qū)的血清樣本，將這24例樣本用酶聯(lián)免疫（ELISA）法和膠體金法復(fù)查，并送攀枝花市疾控中心，用蛋白印記（WB）法做確證實(shí)驗(yàn)。結(jié)果 TRFIA法檢測(cè)出的24例灰區(qū)樣本經(jīng)ELISA和膠體金兩種方法復(fù)查結(jié)果均是陰性，攀枝花市疾控中心用WB法做確證實(shí)驗(yàn)，反饋結(jié)果顯示24例灰區(qū)樣本中1例陽(yáng)性，5例不確定，18例陰性。結(jié)論 TRFIA法有較高的靈敏度，雖然由于靈敏度的提高造成假陽(yáng)性率升高，但是有效避免了漏診，起到縮短窗口期的作用，適合HIV初篩實(shí)驗(yàn)室使用。

關(guān)鍵詞：抗-HIV；抗體；TRFIA法；ELISA法；膠體金法；灰區(qū)帶

近年來，我室HIV感染率呈明顯上升趨勢(shì)，為縮短窗口期，實(shí)現(xiàn)HIV早診斷，早治療，更好地預(yù)防和控制HIV傳播，我室于2012年將HIV初篩檢測(cè)方法由ELISA法改換成TRFIA法[1]。我們發(fā)現(xiàn)該方法的檢測(cè)結(jié)果處于灰區(qū)帶的樣本明顯增多。為明確這些灰區(qū)結(jié)果是否是假陽(yáng)性，筆者對(duì)2013年5月～2014年5月的45378例臨床血清樣本進(jìn)行TRFIA法抗-HIV初篩檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)24例處于灰區(qū)的血清樣本，將這24例樣本用ELISA法和膠體金法復(fù)查，并送攀枝花市疾控中心，用蛋白印記法做確證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果報(bào)告如下

1資料與方法

1.1一般資料 來自我室2013年5月～2014年5月的臨床血清樣本共45378份。

1.2試劑

1.2.1蘇州新波生物技術(shù)有限公司 人類免疫缺陷病毒HIV（1+2型）抗體檢測(cè)試劑盒（雙抗原夾心時(shí)間分辨熒光分析法）

1.2.2北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司 人類免疫缺陷病毒抗體診斷試劑盒（酶聯(lián)免疫法）

1.2.3英科新創(chuàng)（廈門）科技有限公司 人類免疫缺陷病毒抗體檢測(cè)試劑盒（膠體金法）

1.3儀器時(shí)間分辨熒光分析儀洗板機(jī)等

1.4方法

1.4.1TRFIA法 將45378份標(biāo)本用時(shí)間分辨熒光分析法檢測(cè)：①將標(biāo)本離心分離出血清，配制工作洗液和復(fù)溶標(biāo)記物。②分別在相應(yīng)微孔中加入陰、陽(yáng)性對(duì)照及待測(cè)樣品100μL。③室溫振蕩60min。④配制HIV抗原-EU3+工作液（第三步溫育前1h之內(nèi)配制）。⑤用工作洗液洗滌微孔板5遍，扣干。⑥每孔加入HIV抗原-EU3+工作液100μL。⑦室溫振動(dòng)40min。⑧用工作洗液洗板5遍，扣干。⑨每孔加入100μL增強(qiáng)液，振蕩5min，選擇相應(yīng)程序檢測(cè)。

1.4.2ELISA法 將TRFIA法檢出的24例灰區(qū)樣本進(jìn)行ELISA法檢測(cè)：①配制工作洗液。②分別在相應(yīng)孔中加入待測(cè)樣品及陰性、陽(yáng)性對(duì)照100μL。③用封板膜封板后，置37℃溫育60min。④小心揭掉封板膜，用洗板機(jī)洗滌5遍，最后一次盡量扣干。⑤每孔加入酶標(biāo)試劑100μL。⑥用封板膜封板后，置37℃溫育30min。⑦操作同步驟4。⑧每孔加入顯色劑A、B液各50μL，混勻，37℃顯色30min。⑨每孔加終止液50μL，混勻，10min內(nèi)測(cè)定結(jié)果。設(shè)定雙波長(zhǎng)450nm/630nm。

1.4.3膠體金法 將TRFIA法檢出的24例灰區(qū)樣本進(jìn)行膠體金法檢測(cè)：①取60μL血清樣本滴加于加樣處。②在1～30min之內(nèi)判讀結(jié)果。

1.4.4 WB法 把24例樣本送攀枝花市疾控中心做WB法確證實(shí)驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1TRFIA法結(jié)果判讀

2.1.1臨界值計(jì)算 陰性對(duì)照平均熒光強(qiáng)度記為NCx，陽(yáng)性對(duì)照平均熒光強(qiáng)度記為PCx，Cutoff=PCx×0.03+NCx。

2.1.2若S/CO<1，判為HIV抗體陰性；若S/CO≥1，判為HIV抗體陽(yáng)性。

2.1.3實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控的S=0.234，灰區(qū)范圍設(shè)置為1±0.468。

2.2 ELISA法結(jié)果判斷

2.2.1臨界值計(jì)算：臨界值=陰性對(duì)照孔A均值+0.12。

2.2.2樣品A值<臨界值者為HIV抗體陰性，樣品A值>臨界值者為HIV抗體陽(yáng)性。

2.3膠體金法結(jié)果判斷 檢測(cè)區(qū)和對(duì)照區(qū)各出現(xiàn)一條紫紅色色帶，則判為陽(yáng)性；若檢測(cè)區(qū)無色帶，對(duì)照區(qū)出現(xiàn)一條色帶，則判為陰性；若對(duì)照區(qū)未出現(xiàn)色帶，則檢測(cè)無效。

2.4 24例灰區(qū)標(biāo)本用4種方法檢測(cè)結(jié)果，見表1。

3討論

TRFIA法是近年來使用廣泛的一種檢測(cè)技術(shù)，其原理是利用三價(jià)稀土金屬銪作為標(biāo)記物，抗原抗體反應(yīng)完成后通過時(shí)間分辨熒光分析儀檢測(cè)標(biāo)記物的熒光強(qiáng)度來對(duì)待測(cè)抗體進(jìn)行定量分析。與ELISA等定性方法相比，TRFIA定量測(cè)定除了能檢測(cè)出低濃度陽(yáng)性指標(biāo)外，還能給臨床一個(gè)量化的指標(biāo)，使結(jié)果更直觀。從上文比較可以看出24例灰區(qū)標(biāo)本最終確證實(shí)驗(yàn)1例陽(yáng)性，5例不確定，這六例標(biāo)本ELISA法和膠體金法均是陰性。HIV的窗口期較長(zhǎng)，初篩實(shí)驗(yàn)應(yīng)更加強(qiáng)調(diào)方法的靈敏度，以便篩查出處于感染早期的抗體滴度較低的HIV感染者，縮短窗口期，以達(dá)到早發(fā)現(xiàn)，早治療，控制流行和傳播的目的。而對(duì)于其他確證結(jié)果為陰性的灰區(qū)結(jié)果，造成假陽(yáng)性的原因可能是非特異性的熒光干擾，例如空氣灰塵中或水質(zhì)中存在的熒光物質(zhì)干擾，另外一些疾病特別是自身免疫性疾病也可能是假陽(yáng)性產(chǎn)生的原因[2，3]。

參考文獻(xiàn)：

[1]文進(jìn)，張斌.ELISA法對(duì)抗-HIV灰區(qū)標(biāo)本的再檢測(cè)分析[J].臨床輸血與檢驗(yàn)，2005，4（7）.

[2]楊彩霞，傅繼華，畢振強(qiáng)，等.HIV-1感染者免疫學(xué)及血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)[J].中國(guó)公共衛(wèi)生，2008，24（6）：695-696.

[3]阮樂幸，袁國(guó)平，謝芳.抗-HIV假陽(yáng)性結(jié)果分析[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2005，32（12）：1763.

[4]中國(guó)疾病控制中心.全國(guó)艾滋病檢測(cè)技術(shù)規(guī)范[S]（2009年修訂版），2010，10，05.

編輯/孫杰