烏司他丁對腦出血模型兔血清基質(zhì)金屬蛋白酶-9、半胱天冬氨酸蛋白酶-3的影響

佟麗妍胡才寶許 莉馮為民

烏司他丁對腦出血模型兔血清基質(zhì)金屬蛋白酶-9、半胱天冬氨酸蛋白酶-3的影響

佟麗妍1胡才寶2許 莉3馮為民1

目的 觀察烏司他丁對腦出血模型兔血清基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、半胱天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）的影響，探討烏司他丁的腦保護(hù)作用。方法 將造模成功的20只新西蘭兔隨機(jī)分為腦出血模型組（模型組）和烏司他丁治療組（治療組），每組10只。分別給予生理鹽水和烏司他丁注射液，靜脈推注，共7天。應(yīng)用ELISA法測定各組兔腦出血后第1、3、5、7天動(dòng)脈血基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、半胱天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）含量。結(jié)果 與模型組比較，治療第1天治療組MMP-9[（951.72±216.35）ng/L]、Caspase-3[（58.11±5.07）μmol/mL]差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；治療第3、5、7天，治療組MMP-9[分別為（887.02±205.77）ng/L、（892.79±123.94）ng/L、（858.90± 97.37）ng/L]及Caspase-3[分別為（58.00±4.99）μmol/mL、（49.05±9.30）μmol/mL、（48.22±10.28）μmol/ mL]含量均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。結(jié)論 烏司他丁可下調(diào)腦出血模型兔血清MMP-9及Caspase-3含量，對腦出血具有一定的腦保護(hù)作用。

兔；腦出血；烏司他??；基質(zhì)金屬蛋白酶-9；半胱天冬氨酸蛋白酶-3

腦出血（cerebral hemorrhage，CH）后出血灶周圍腦組織水腫是導(dǎo)致繼發(fā)性神經(jīng)元損害的重要因素。其中主要為血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）的破壞和神經(jīng)細(xì)胞凋亡。研究[1]發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）在腦組織損傷后明顯升高，是導(dǎo)致血管源性腦水腫和繼發(fā)性腦損傷的重要環(huán)節(jié)。半胱天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）是凋亡信號傳導(dǎo)途徑中重要的調(diào)控基因[2]。烏司他?。╱linastatin，UTI）是從人類尿液中提取精制而成的糖蛋白，具有抑制多種酶、穩(wěn)定細(xì)胞膜和溶酶體膜，抑制溶酶體酶的活性及釋放等作用。研究表明，UTI對缺血性再灌注后腦組織損傷具有腦保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)旨在探討UTI在腦出血方面的腦保護(hù)作用。

表1 兩組血清MMP-9水平比較（ng/L，±s）

表1 兩組血清MMP-9水平比較（ng/L，±s）

注：與模型組比較，△P＜0.05

組別模型組治療組只數(shù)10 10 1d 1080.54±165.90 951.72±216.35 3d 1745.65±133.48 887.02±205.77△5d 1576.69±129.85 892.79±123.94△7d 1271.37±109.31 858.90±97.37△

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng) 物 選用健康成年新西蘭兔20只，雌雄不限，體質(zhì)量（3.0±0.2）kg，由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，許可證號：SCXK（浙）2010-0047。飼養(yǎng)期間給予嚙齒類動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料及飲水，自主進(jìn)食。溫度（23± 10℃），濕度50%～70%，正常晝夜節(jié)律，噪音＜50dB，通風(fēng)，單籠飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)過程中對動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 藥 物 烏司他丁注射液（規(guī)格：10萬U/支，批號031301064）購自廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司。兔基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（R&D公司，批號Ra45991L）及兔半胱天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（R&D公司，批號Ra34851L）均購自杭州達(dá)文生物有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組 將造模成功的20只新西蘭兔根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)平行分為腦出血模型組（模型組）和烏司他丁治療組（治療組），每組10只。

2.2 模型制備 將符合實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的新西蘭兔，參照文獻(xiàn)[3]的方法加以改良：以戊巴比妥鈉（30mg/kg）耳緣靜脈麻醉,頭部剃毛,俯臥位固定于兔腦立體定位儀上。手術(shù)暴露顱骨十字縫和人字縫。參照Sawyer兔腦立體定位圖譜確定內(nèi)囊位置：AP1mm，R6mm，H13mm。選取十字縫交叉點(diǎn)為基點(diǎn)沿冠狀縫向右旁開6mm再平行矢狀縫向前1mm為穿刺進(jìn)針點(diǎn)。在兔耳中央動(dòng)脈采取自體未凝動(dòng)脈血0.5mL，用9號腰穿針快速垂直于顱骨穿入腦實(shí)質(zhì)，進(jìn)針深度13mm，3min之內(nèi)緩慢注入，停針5min后緩慢拔針。局部壓迫止血，縫合皮膚，造模完成。

2.3 給 藥 模型組造模成功后連續(xù)7天，予以生理鹽水2mL，靜脈推注，1天3次；治療組造模成功后連續(xù)7天予以烏司他丁注射液1.7萬U/kg（相當(dāng)于成人用藥量3倍劑量）加入2mL生理鹽水中，靜脈推注，1天3次。

2.4 觀察指標(biāo)及方法 于造模后第1、3、5、7天，分別為各組動(dòng)物采集動(dòng)脈血，離心后收集血清，嚴(yán)格按照試劑盒說明書采用ELISA法檢測血清MMP-9、Caspase-3水平。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用表示，采用單因素方差分析及t檢驗(yàn)法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 兩組血清基質(zhì)金屬蛋白酶-9水平比較 與模型組比較，治療第1天治療組MMP-9略低，但兩組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；治療第3、5、7天，治療組MMP-9水平均下降，與同時(shí)段模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見表1。

3.2 兩組血清半胱天冬氨酸蛋白酶-3水平比較

與模型組相比，治療第1天治療組Caspase-3略上升，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；治療第3、5、7天，治療組Caspase-3水平下降，與同時(shí)段模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見表2。

表2 兩組血清Caspase-3水平比較（μmol/mL，±s）

表2 兩組血清Caspase-3水平比較（μmol/mL，±s）

注：與模型組比較，△P＜0.05

模型組治療組10 10 58.01±6.28 58.11±5.07 76.58±13.05 58.00±4.99△68.25±11.71 49.05±9.30△66.09±10.55 48.22±10.28△

3 討論

近年研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）對神經(jīng)系統(tǒng)的作用和影響十分廣泛。MMPs是一組降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白（extracellular matrix，ECM）的鋅依賴蛋白酶，正常狀態(tài)下以酶原形式存在，且被控制在較低水平，在某些病理生理情況下，其活性明顯增加，參與組織的損傷與修復(fù)。Gao等[4]發(fā)現(xiàn),腦缺血及再灌注后出現(xiàn)MMPs增加，而Yang等[5]發(fā)現(xiàn)在此過程中MMP-9增加最明顯。MMP-9通過降解基底膜的ECM破壞血腦屏障，導(dǎo)致腦損傷，同時(shí)還通過誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞變性死亡等機(jī)制造成腦損害。研究發(fā)現(xiàn)，腦出血（CH）后MMP-9水平變化與CH患者腦水腫的演變規(guī)律相一致[6]。CH能誘導(dǎo)內(nèi)源性的MMP-9在腦組織中表達(dá)，破壞血腦屏障，使得循環(huán)中的大、小分子包括血漿蛋白、多種毒性物質(zhì)、代謝產(chǎn)物及炎性細(xì)胞等進(jìn)入腦內(nèi)，進(jìn)一步促進(jìn)血管源性腦水腫的形成[7]。給予外源性MMP抑制劑,可在一定程度上減輕缺血和再灌注損傷,緩解繼發(fā)于腦出血時(shí)的血管源性腦水腫[8]。

烏司他丁具有穩(wěn)定溶酶體膜，減少炎癥因子（IL-8、IL-6、TNF-α等）釋放，抑制炎癥反應(yīng)的作用[9]。在對重癥急性胰腺炎相關(guān)性腦損傷的實(shí)驗(yàn)研究中證實(shí)有較好的腦保護(hù)作用[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兔腦出血后，MMP-9明顯升高，應(yīng)用UTI治療第3天后MMP-9明顯下降，至第7天，降至接近正常水平，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)中UTI可能通過抑制溶酶體酶，穩(wěn)定細(xì)胞膜和溶酶體膜的作用，保護(hù)ECM，抑制了MMP-9對ECM的破壞作用，從而維持血腦屏障的完整。因而，UTI可能通過上述途徑起到腦保護(hù)作用。

腦損傷后細(xì)胞凋亡過程中最終都會(huì)激活細(xì)胞的半胱天冬氨酸蛋白酶。Jiang等[11]發(fā)現(xiàn)UTI能抑制失血性休克大鼠回腸組織Caspase-3蛋白的表達(dá)，抑制組織細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生細(xì)胞保護(hù)作用。對CH大鼠腦片進(jìn)行TUNEL染色的研究[12]發(fā)現(xiàn)，TUNEL染色陽性凋亡細(xì)胞在CH后6h開始出現(xiàn)，1～3天大量形成，3天達(dá)高峰，推測凋亡的內(nèi)皮細(xì)胞可能促進(jìn)血腦屏障破壞和血管神經(jīng)源性水腫。吳倩佳等[13]研究顯示，UTI可明顯降低腦缺血再灌注中腦組織Caspase-3蛋白的表達(dá)，減少腦細(xì)胞凋亡。近年研究表明，在腦缺血再灌注損傷的過程中Caspase-3蛋白參與了腦缺血后神經(jīng)元損傷的病理過程，并起著重要的作用[14]。UTI可能使細(xì)胞線粒體破壞程度減輕，從而減慢凋亡進(jìn)程，及早應(yīng)用可以有效保護(hù)腦細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兔腦出血后應(yīng)用UTI，血清Caspase-3下降明顯，并與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示UTI可能抑制Caspase-3的激活，減少出血灶周圍神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，產(chǎn)生腦保護(hù)作用。

綜上所述，烏司他丁可下調(diào)腦出血模型兔動(dòng)脈血MMP-9及Caspase-3含量，可減輕血管源性腦水腫，維持血腦屏障完整，減少細(xì)胞凋亡，對腦出血具有一定的腦保護(hù)作用。烏司他丁對腦出血后腦細(xì)胞保護(hù)的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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（收稿：2015-01-15 修回：2015-01-27）

Effect of Ulinastatin on M atrix M etallopeptidase 9 and Caspase-3 in Rabbits w ith Cerebral Hemorrhage

TONG Liyan1,HU Caibao2,XU li3,FENG Weimin1. 1Department of Neurology,Hangzhou Traditional Chinese Medical Hospital,Hangzhou (310007),China;2Department of Cardiology,Zhejiang Hospital,Hangzhou(310000), China;3ICU Ward&Department of Cardiology,First People's Hospital of Yuhang District,Hangzhou,Hangzhou (310000),China

Objective To investigate the effect of ulinastatin（UTI）on matrix metallopeptidase 9（MMP-9）and caspase-3 in cerebral hemorrhage model of rabbits,in an attempt to explore the neuroprotective effect of UTI. M ethods Twenty New Zealand rabbits with cerebral hemorrhage were randomly divided into 2 groups:model group and UTI group,with 10 rabbits in each group.Model group was given intravenous normal saline（2mL,b.i.d）and UTI group received intravenous injection of UTI（17000U/kg,b.i.d）for 7d.Blood samples were obtained to measure the contents of MMP-9 and caspase-3 with ELISA on Day 1,3,5,and 7.Results Compared with model group,the contents of MMP-9（951.72±216.35ng/L）and caspase-3（58.11±5.07μmol/mL）in UTI group on Day 1 were not significantly different（P＞0.05）,while those on Day3,5,and 7 were decreased significantly（MMP-9: 887.02±205.77ng/L,892.79±123.94ng/L,858.90±97.37ng/L;caspase-3:58.00±4.99μmol/mL,49.05±9.30μmol/mL, 48.22±10.28μmol/mL;all P＜0.05）.Conclusion UTI can reduce the contents of MMP-9 and caspase-3 during cerebral hemorrhage in model rabbits,indicating that UTI has cerebral protective effect on cerebral hemorrhage.

rabbits;cerebral hemorrhage;ulinastatin;matrix metallopeptidase 9;caspase-3

天普科學(xué)研究基金資助項(xiàng)目（No.01200919）；浙江省科技廳重癥醫(yī)學(xué)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（No.2011R50018-02）

1杭州市中醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（杭州 310007）；2浙江醫(yī)院心內(nèi)科（杭州 310000）；3杭州市余杭區(qū)第一人民醫(yī)院ICU重癥監(jiān)護(hù)室（杭州 311100）

胡才寶，Tel：13958169315；E-mail：zjicu1996@163.com