桔梗皂苷D對(duì)人乳腺癌細(xì)胞體外殺傷效應(yīng)及機(jī)制研究

章英宏

桔梗皂苷D對(duì)人乳腺癌細(xì)胞體外殺傷效應(yīng)及機(jī)制研究

章英宏

目的 探討桔梗皂苷D對(duì)人乳腺癌細(xì)胞體外殺傷效應(yīng)及機(jī)制。方法 將人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231用桔梗皂苷D干預(yù)后，采用MTT法檢測(cè)桔梗皂苷D對(duì)這兩種乳腺癌細(xì)胞系的抑制率；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)桔梗皂苷D對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡的影響；Western blot法檢測(cè)桔梗皂苷D干預(yù)后MCF-7細(xì)胞caspase-3、Bcl-2和Bax表達(dá)水平。結(jié)果 MCF-7細(xì)胞抑制率：2.5μg/ mL桔梗皂苷D組（8.9±2.4）%，5μg/mL桔梗皂苷D組（24.6±3.6）%，10μg/mL桔梗皂苷D組（39.7± 4.1）%，20μg/mL桔梗皂苷D組（64.8±5.2）%，40μg/mL桔梗皂苷D組（82.4±6.5）%；MDA-MB-231細(xì)胞抑制率：2.5μg/mL桔梗皂苷D組（5.3±1.7）%，5μg/mL桔梗皂苷D組（17.3±2.9）%，10μg/mL桔梗皂苷D組（28.4±3.5）%，20μg/mL桔梗皂苷D組（50.5±4.0）%，40μg/mL桔梗皂苷D組（71.3± 6.1）%，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）；MCF-7細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)率：5μg/mL桔梗皂苷D組為（9.7±1.6）%，20μg/mL桔梗皂苷D組（29.8±3.1）%，高、低劑量桔梗皂苷D組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）；與相同劑量桔梗皂苷D組比較，zVAD-fmk可有效抑制桔梗皂苷D對(duì)MCF-7細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)（P＜0.05）；桔梗皂苷D能顯著降低MCF-7細(xì)胞Bcl-2表達(dá)水平（0.43±0.07、0.24±0.04 vs 0.78±0.09，P均＜0.05），但對(duì)Bax表達(dá)無影響（0.38±0.05、0.41±0.04 vs 0.42±0.05，P＞0.05）。結(jié)論 桔梗皂苷D誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞進(jìn)入caspase-3依賴的凋亡過程，其機(jī)制可能與降低Bcl-2表達(dá)，降低Bcl-2/Bax比例有關(guān)。

乳腺癌；桔梗皂苷D；凋亡；caspase-3；Bcl-2；Bax

KEY WORDSbreast cancer;platycodin D;apoptosis;caspase-3;Bcl-2;Bax

目前臨床治療乳腺癌的方法包括手術(shù)切除、化療、放療和生物治療，然而由于乳腺癌的高轉(zhuǎn)移性和耐藥性，這些治療方法都無法治愈乳腺癌[1-2]。本研究觀察桔梗皂苷D對(duì)人乳腺癌體外殺傷效應(yīng)，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDAMB-231購(gòu)于上海中科院細(xì)胞庫(kù)，培養(yǎng)在RPMI-1640培養(yǎng)基中，含10%胎牛血清，培養(yǎng)環(huán)境為37℃恒溫且通入5%的CO2。

1.2 試 劑 RPIM-1640培養(yǎng)基購(gòu)自于美國(guó)Gibco公司，胎牛血清于杭州四季青生物工程有限公司。桔梗皂苷D，MTT（噻唑藍(lán)），AnnexinⅤ-FITC凋亡試劑盒購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。Cleaved caspase-3、βactin、Bcl-2，Bax兔抗人抗體購(gòu)自美國(guó)Cell signaling公司。

1.3 MTT法檢測(cè)桔梗皂苷D對(duì)乳腺癌細(xì)胞系的抑制活性 將MCF-7，MDA-MB-231細(xì)胞分別接種于96孔板，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，分別加入2.5、5、10、20、40μg/mL的桔梗皂苷D培養(yǎng)48h，對(duì)照組為相同培養(yǎng)條件下不加桔梗皂苷D培養(yǎng)48h。之后加5mg/mL MTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄上清，往孔中加150μL二甲亞砜，570nm波長(zhǎng)下檢測(cè)OD值，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率按以下公式計(jì)算：抑制率=[OD（對(duì)照組）-OD（藥物組）/OD（對(duì)照組）]×100%。

1.4 細(xì)胞凋亡試驗(yàn) MCF-7細(xì)胞凋亡檢測(cè)分組如下：5μg/mL桔梗皂苷D組，20μg/mL桔梗皂苷D組，5μg/mL桔梗皂苷D+10μmol/L zVAD-fmk組，20μg/ mL桔梗皂苷D+10μmol/L zVAD-fmk組。分組加藥后培養(yǎng)48h，對(duì)照組為不加藥物培養(yǎng)48h。收集細(xì)胞，用生理鹽水洗2次，加195μL凋亡試劑盒中的結(jié)合緩沖液及5μL Annexin-V在暗處孵育10min，之后加入10μL碘化丙啶（PI）孵育10min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)MCF-7細(xì)胞凋亡，凋亡率為Annexin V陽性細(xì)胞占所有細(xì)胞的比例。

1.5 Western blot試驗(yàn) 在MCF-7細(xì)胞中分別加入5μg/mL或20μg/mL桔梗皂苷D培養(yǎng)48h，對(duì)照組為不加藥物培養(yǎng)48h，收集細(xì)胞，將細(xì)胞裂解后取裂解液進(jìn)行聚丙烯酰氨凝膠電脈（SDS-PAGE），之后將分離后的蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，將膜在Cleaved caspase-3，β-actin，Bcl-2或Bax一抗稀釋液中孵育過夜，將膜清洗后在羊抗兔二抗稀釋液中孵育2h，用ECL顯色試劑盒顯色，X線膠片曝光后，目標(biāo)蛋白表達(dá)量由它們?cè)谀z片上顯色后的灰度與相應(yīng)β-actin的灰度比表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示，應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，采用t檢驗(yàn)以及單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 桔梗皂苷D對(duì)人乳腺癌細(xì)胞系的抑制作用 與不加桔梗皂苷D的對(duì)照組比較，不同劑量的桔梗皂苷D均能明顯抑制MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)（P＜0.05），且MCF-7細(xì)胞對(duì)桔梗皂苷D的敏感性高于MDA-MB-231細(xì)胞系（P＜0.05），見表1。

2.2 桔梗皂苷D誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡 高、低劑量的桔梗皂苷D均能顯著誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞caspase-3的活化，使激活型（cleaved caspase-3）表達(dá)顯著增加，進(jìn)而誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞發(fā)生凋亡（P＜0.05）。caspase特異性抑制劑zVAD-fmk能顯著抑制桔梗皂苷D誘導(dǎo)的caspase-3活化和凋亡的發(fā)生（P＜0.05），見表2。

2.3 桔梗皂苷D下調(diào)Bcl-2表達(dá) 與不加桔梗皂苷D的對(duì)照組比較，高、低劑量的桔梗皂苷D均可顯著抑制MCF-7細(xì)胞Bcl-2表達(dá)（P＜0.05），但對(duì)Bax表達(dá)無影響（P＞0.05）。高、低劑量桔梗皂苷D均使MCF-7細(xì)胞的Bcl-2/Bax比值下降，見表3。

表1 桔梗皂苷D體外MCF-7細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞抑制作用（±s）

表1 桔梗皂苷D體外MCF-7細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞抑制作用（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與同濃度桔梗皂苷D處理的MCF-7比較，△P＜0.05

組別對(duì)照組2.5μg/mL桔梗皂苷D組5μg/mL桔梗皂苷D組10μg/mL桔梗皂苷D組20μg/mL桔梗皂苷D組40μg/mL桔梗皂苷D組孔數(shù)333333桔梗皂苷D濃度（μg/mL）0 2.5 5 10 20 40 MCF-7細(xì)胞抑制率（%）0 8.9±2.4* 24.6±3.6* 39.7±4.1* 64.8±5.2* 82.4±6.5* MDA-MB-231細(xì)胞抑制率（%）0 5.3±1.7* 17.3±2.9*△28.4±3.5*△50.5±4.0*△71.3±6.1*△

表2 桔梗皂苷D對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡的影響（±s）

表2 桔梗皂苷D對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡的影響（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與5μg/mL桔梗皂苷D組比較，▲P＜0.05；與20μg/mL桔梗皂苷D組比較，#P＜0.05

組別對(duì)照組5μg/mL桔梗皂苷D組20μg/mL桔梗皂苷D組5μg/mL桔梗皂苷D+zVAD-fmk組20μg/mL桔梗皂苷D+zVAD-fmk組孔數(shù) 桔梗皂苷D濃度（μg/mL）zVAD-fmk濃度（μmol/L）33333 05 20 5 20 0001 0 10凋亡率（%）1.8±0.3 9.7±1.6* 29.8±3.1* 3.8±1.1▲8.9±1.5*#灰度比（cleaved caspase-3/β-actin）0.08±0.02 0.21±0.06* 0.42±0.11* 0.12±0.03▲0.19±0.04*#

表3 桔梗皂苷D對(duì)MCF-7細(xì)胞Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)的影響（±s）

表3 桔梗皂苷D對(duì)MCF-7細(xì)胞Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)的影響（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05

組別對(duì)照組5μg/mL桔梗皂苷D組20μg/mL桔梗皂苷D組孔數(shù) 桔梗皂苷D濃度（μg/mL）333 052 0灰度比（Bcl-2/β-actin）0.78±0.09 0.43±0.07* 0.24±0.04*灰度比（Bax/β-actin）0.42±0.05 0.38±0.05 0.41±0.04 Bcl-2/Bax 1.86±0.18 1.13±0.08 0.59±0.06

3 討論

桔梗皂苷D是桔?？傇碥盏闹饕钚猿煞?，具有抗炎、鎮(zhèn)痛和免疫調(diào)節(jié)的作用，最近也有文獻(xiàn)報(bào)道桔梗皂苷D具有顯著的抗肝癌和肺癌的生物活性，能誘導(dǎo)肝癌和肺癌細(xì)胞凋亡和周期阻滯[3-5]。

誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡是腫瘤治療藥物殺傷腫瘤細(xì)胞的關(guān)鍵機(jī)制，能否顯著造成腫瘤細(xì)胞凋亡往往是腫瘤藥物治療成功與否的標(biāo)志，而腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的抵抗則常常表現(xiàn)為對(duì)凋亡的抵抗[6-7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)桔梗皂苷D能誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞caspase-3的活化同時(shí)顯著誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞發(fā)生凋亡，當(dāng)用zVAD-fmk抑制caspase-3的活化后，桔梗皂苷D對(duì)MCF-7細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)下降。證實(shí)桔梗皂苷D能誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，且依賴于caspase-3的活化。

Bcl-2蛋白家族是細(xì)胞內(nèi)重要的凋亡調(diào)控因子，當(dāng)Bcl-2與Bax的比值下降時(shí)，細(xì)胞線粒體膜孔道會(huì)開放，細(xì)胞色素C釋出，進(jìn)而激活caspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡[8-9]。Western blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)桔梗皂苷D盡管不能誘導(dǎo)Bax表達(dá)，但能顯著增加Bcl-2表達(dá)水平，使Bcl-2/Bax比值顯著下降。這可能是桔梗皂苷D誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制之一。

綜上所述，桔梗皂苷D具有良好的體外抗乳腺癌生長(zhǎng)的活性，并能誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。

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（收稿：2014-12-26 修回：2015-02-14）

Viability Inhibition of Human Breast Cancer Cells Treated w ith Platycodin D in Vitro and the UnderlyingM echanism

ZHANG Yinghong. Clinical Laboratory,Xinchang Hospital of Traditional Chinese Medicine, Xingchang(312500),China

Objective To investigate the anticancer activity of platycodin D in breast cancer cells and the mechanism.M ethods Human breast cancer cell lines MCF-7 and MDA-MB-231 were treated with platycodin D. Cell viability was then measured by using the MTT assay.Apoptosis of MCF-7 treated with platycodin D was determined by flow cytometry.The expression of cleaved caspase-3,Bcl-2 and Bax on MCF-7 was detected by western blot.Results The viability inhibition rate of MCF-7 were as follows:8.9%±2.4%in 2.5μg/mL platycodin D group，24.6%±3.6%in 5μg/mL platycodin D group,39.7%±4.1%in 10μg/mL platycodin D group,64.8%±5.2% in 20μg/mL platycodin D group,82.4%±6.5%in 40μg/mL platycodin D group.The viability inhibition rate of MDA-MB-231 were as follows:5.3%±1.7%in 2.5μg/mL platycodin D group,17.3%±2.9%in 5μg/mL platycodin D group,28.4%±3.5%in 10μg/mL platycodin D group,50.5%±4.0%in 20μg/mL platycodin D group,71.3%± 6.1%in 40μg/mL platycodin D group.Statistical differences was found between MCF-7 and MDA-MB-231 treated with platycodin D group and control group（P＜0.05）.The apoptosis rate of MCF-7 cells was 9.7%±1.6%in 5μg/mL platycodin D group and 29.8%±3.1%in 20μg/mL platycodin D group,which were significantly different from that of control group（P＜0.05）.Compared to the equal dose of platycodin D group,Zvad-fmk significantly inhibited the apoptosis induced by platycodin D（P＜0.05）.Pplatycodin D decreased the expression of Bcl-2 on MCF-7 cells（0.43±0.07 and 0.24±0.04 vs 0.78±0.09,P＜0.05）,while it did not affect the expression of Bax on MCF-7 cells（0.38±0.05 and 0.41±0.04 vs 0.42±0.05,P＞0.05）. Conclusion Platycodin D can induce caspase-3-dependant apoptosis of breast cancer cells by down-regulating the expression of Bcl-2 and the ratio of Bcl-2 to Bax.

浙江省新昌縣中醫(yī)院檢驗(yàn)科（新昌 312500）