龍葵氯仿提取物對荷瘤鼠腫瘤生長及脾和胸腺指數(shù)的影響

鄭戴波高聚偉潘 磊陳培豐

·論 著·

龍葵氯仿提取物對荷瘤鼠腫瘤生長及脾和胸腺指數(shù)的影響

鄭戴波1高聚偉2潘 磊3陳培豐3

目的 觀察龍葵氯仿提取物對荷瘤鼠腫瘤生長及脾和胸腺指數(shù)的影響。方法 建立Lewis肺癌移植瘤模型，將小鼠隨機(jī)分為5組，荷瘤模型組予生理鹽水（0.2mL/10g）灌胃，龍葵氯仿提取物高、中、低劑量組分別按50、25、12.5mL/kg劑量的龍葵氯仿提取物灌胃，環(huán)磷酰胺組予環(huán)磷酰胺（CTX）（20mg/kg）腹腔注射（每隔2天1次），共15天。停藥后24h，處死小鼠，分別剝離瘤塊、胸腺、脾臟組織稱重，測定各組小鼠的腫瘤生長抑制率、脾指數(shù)和胸腺指數(shù)。結(jié)果 氯仿高、中、低劑量組抑瘤率分別為25.36%、38.93%、13.57%；CTX組為51.43%。環(huán)磷酰胺組及氯仿高、中、低劑量組平均瘤重分別為（1.36±0.07）g、（2.09±0.16）g、（1.71±0.11）g和（2.42±0.07）g，與荷瘤模型組（2.80± 0.04）g比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01、P＜0.05）。與荷瘤模型組比較，氯仿中劑量組的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)顯著提高（分別為130.85%、131.04%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），CTX組則顯著降低（分別為46.24%和74.69%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論 龍葵氯仿提取物具有抑制荷瘤小鼠移植瘤生長的作用，其機(jī)制可能為通過增加荷瘤小鼠的胸腺和脾臟的重量，抑制荷瘤小鼠胸腺和脾臟萎縮，增加小鼠抗腫瘤免疫反應(yīng)。

小鼠；Lewis肺癌移植瘤；龍葵氯仿提取物；抑瘤；免疫反應(yīng)

為研究龍葵的抗癌作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過建立Lewis肺癌移植瘤模型，觀察龍葵氯仿提取物對荷瘤小鼠的腫瘤生長、脾和胸腺指數(shù)的影響，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 藥 物 龍葵購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房，產(chǎn)自浙江臨安，經(jīng)該院徐錫山主任藥師鑒定為茄科（Solanaceae）茄屬（Solanum）植物龍葵（Solanum nigrum L.）的干燥全草。參考文獻(xiàn)[1-2]方法，稱取干燥的龍葵飲片5kg，用8倍量的氯仿80℃提取2h，提取液除菌，100℃水浴箱濃縮得浸膏，即為龍葵氯仿提取物，置4℃冰箱保存?zhèn)溆?。注射用環(huán)磷酰胺（CTX）（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號1033021）；生理鹽水（NS）（杭州民生藥業(yè)有限公司，批號312020910）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物及瘤株 近交系C57BL/6J純系小鼠（上海斯萊克動物有限責(zé)任公司），許可證號：SCXK（滬）2013-0003。在浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心SPF級動物房適應(yīng)性飼養(yǎng)7天。Lewis肺癌細(xì)胞株，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.3 方 法

1.3.1 建立荷瘤模型[1]將接種Lewis肺癌14天的C57BL/6J荷瘤小鼠，脫頸椎處死，無菌冰浴條件下剝離瘤組織，選取生長良好的腫塊，去除壞死組織，按腫瘤（g）∶生理鹽水（mL）為1∶3比例用組織勻漿器制備瘤細(xì)胞懸液，200目網(wǎng)篩過濾，1500r/min，5min，用PBS調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度約4×106/mL，作為制備小鼠Lewis肺癌模型的細(xì)胞懸液。建模前小鼠禁食不禁水12h。無菌條件下，75%酒精消毒小鼠右腋下皮膚3遍，用1mL無菌注射器取細(xì)胞懸液0.2mL（含8×105個(gè)活細(xì)胞），無菌條件下接種于小鼠右腋窩皮下，拔出針頭，用酒精棉球輕壓針眼處片刻，防止細(xì)胞懸液流出。將接種瘤細(xì)胞后的小鼠送同一飼養(yǎng)室繼續(xù)飼養(yǎng)。

1.3.2 分組、灌胃及取標(biāo)本 接種24h后，將荷瘤小鼠隨機(jī)分為荷瘤模型組、環(huán)磷酰胺組及龍葵氯仿提取物高、中、低劑量（50、25、12.5mg/kg）組，每組8只。

給藥劑量參照人鼠給藥劑量換算公式方法[2]計(jì)算：dB=dA×RB/RA×（WA/WB）1/3，式中：dB、dA是AB兩種動物的每kg體質(zhì)量劑量（mg/kg）；RB、RA是動物體型系數(shù)，小鼠為59，人為100；WA、WB是動物的體質(zhì)量（kg）值。分組后開始給藥，1天1次，連續(xù)15天。具體用藥劑量分別為：荷瘤模型組予生理鹽水0.2mL/10g灌胃；高、中、低劑量組分別予50、25、12.5mg/kg龍葵氯仿提取物灌胃；環(huán)磷酰胺組于接種后每3天1次按20mg/kg腹腔注射環(huán)磷酰胺，每次0.2mL，共5次。停藥1天后，稱取小鼠體質(zhì)量并處死，剝離瘤塊、胸腺及脾臟，分別稱重。

1.4 觀察指標(biāo) 按瘤重計(jì)算腫瘤抑制率：腫瘤抑制率（%）=[（對照組平均瘤重g-給藥組平均瘤重g）/對照組平均瘤重g]×100%。依據(jù)下列公式計(jì)算小鼠胸腺、脾指數(shù)：胸（脾）腺指數(shù)（mg/10g）=[胸（脾）腺重量（mg）/去瘤體質(zhì)量（g）]×10

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料均以（±s） 描述，兩組間比較采用配對t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對荷瘤小鼠腫瘤重量及抑瘤率的影響 荷瘤模型組小鼠平均瘤重（2.80±0.04）g，龍葵氯仿提取物各組小鼠平均瘤重均有不同程度降低，其中中劑量組抑瘤率最大，達(dá)38.93%，與荷瘤模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

表1 龍葵氯仿提取物對荷瘤小鼠腫瘤重量的影響（±s）

表1 龍葵氯仿提取物對荷瘤小鼠腫瘤重量的影響（±s）

注：與荷瘤模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

荷瘤模型組環(huán)磷酰胺組氯仿高劑量組氯仿中劑量組氯仿低劑量組88888 -20 50 25 12.5 88888 78888 2.80±0.04 1.36±0.07** 2.09±0.16** 1.71±0.11** 2.42±0.07* 0 51.43 25.36 38.93 13.57

2.2 對荷瘤小鼠胸腺和脾指數(shù)的影響 荷瘤模型組小鼠的胸腺指數(shù)、脾指數(shù)分別為（13.58±1.95）、（147.40± 13.90）mg/10g。龍葵氯仿提取物中、低劑量組胸腺指數(shù)、脾指數(shù)均較模型組有提高，以中劑量組提高最明顯，胸腺指數(shù)、脾指數(shù)增長率分別達(dá)130.85%、131.04%，與荷瘤模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。而氯仿高劑量組和氯仿低劑量組則無明顯差異，環(huán)磷酰胺組較荷瘤模型組降低（P＜0.01）。氯仿提取物各劑量組與環(huán)磷酰胺組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 龍葵氯仿提取物對荷瘤小鼠胸腺指數(shù)及脾指數(shù)的影響（±s）

表2 龍葵氯仿提取物對荷瘤小鼠胸腺指數(shù)及脾指數(shù)的影響（±s）

注：與荷瘤模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與環(huán)磷酰胺組比較，△P＜0.05

組別荷瘤模型組環(huán)磷酰胺組氯仿高劑量組氯仿中劑量組氯仿低劑量組只數(shù)88888劑量（mg/kg）-20 50 25 12.5例數(shù)78888胸腺指數(shù)（mg/10g）13.58±1.95 6.28±0.74** 10.59±1.78△17.77±0.89*△15.6±1.12△脾指數(shù)（mg/10g）147.40±13.90 110.10±8.12* 169.79±8.33△193.16±15.44**△173.98±8.34△胸腺指數(shù)增長率（%）0 46.24 77.98 130.85 114.87脾指數(shù)增長率（%）0 74.69 115.19 131.04 118.03

3 討 論

龍葵是茄科（Solanaceae）茄屬植物龍葵（Solanum nigrum Linne）的全草。龍葵味苦，性寒、微甘，有小毒，歸肺，胃、膀胱經(jīng)，有清熱解毒、活血化瘀、利水消腫、止咳祛痰等功效[3]，主治感冒、牙痛、痢疾、慢性支氣管炎等[4]。近年還發(fā)現(xiàn)有抑癌作用，對多種惡性腫瘤有抑制作用。吳鉅凌等[5]用龍葵葶藶湯內(nèi)服配合順鉑胸腔內(nèi)灌注化療治療肺癌大量惡性胸腔積液，與對照組（單純順鉑胸腔內(nèi)灌注）相比，可顯著提高臨床療效，降低化療不良反應(yīng)發(fā)生率，提高機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。顧錦華等[6]用以龍葵、姜黃為主要成分的復(fù)方龍葵膠囊灌胃S180肉瘤小鼠及HepA肝癌小鼠，發(fā)現(xiàn)其對S180肉瘤的抑制率和對HepA肝癌小鼠生命延長率均明顯優(yōu)于模型對照組（單純使用羧甲基纖維素鈉）和陽性對照組（單純使用環(huán)磷酰胺），其機(jī)制與促進(jìn)S180腫瘤細(xì)胞凋亡，使腫瘤細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，減少腫瘤細(xì)胞在S期的DNA合成有關(guān)。黃東彬等[7]用龍葵合劑聯(lián)合化療治療中晚期大腸癌，患者的免疫功能及生活質(zhì)量均得到顯著提高，毒副作用明顯降低，取得良好的臨床療效。

龍葵化學(xué)成分復(fù)雜，含苷類甾體生物堿、龍葵多糖、礦物質(zhì)、維生素、色素、氨基酸等[8-9]。丁霞等[10]對龍葵不同部位體外抗腫瘤作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)龍葵水提物和醇提物具有體外抗腫瘤作用，其石油和正丁醇部位是其活性部位。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)龍葵氯仿提取物對荷瘤小鼠移植瘤的生長有一定抑制作用，其中中劑量組抑瘤率為38.93%（P＜0.01）。

T淋巴細(xì)胞在宿主對腫瘤組織的免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵的作用，而胸腺和脾臟是T淋巴細(xì)胞成熟、增殖和分化的主要部位，其臟器指數(shù)是衡量機(jī)體免疫功能的初步指標(biāo)[11]。本研究結(jié)果表明，龍葵氯仿提取物有一定的提高胸腺和脾臟指數(shù)的作用，其中以中劑量組最為明顯，胸腺和脾臟指數(shù)增長率分別為130.85%和131.04%。其作用機(jī)制可能與中劑量組更大程度地激活脾臟邊緣區(qū)及活化T淋巴細(xì)胞，從而引起更為強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答有關(guān)。本研究提示龍葵氯仿提取物對荷瘤小鼠的免疫器官有一定的保護(hù)作用，有可能通過增加荷瘤小鼠的胸腺和脾臟的重量，抑制了腫瘤侵襲所造成的胸腺和脾臟的萎縮，增加機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)，以抑制腫瘤的生長，其機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

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［2］孫敬方.動物實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：357.

［3］梅全喜.廣東地產(chǎn)藥材研究［M］.廣州：廣東科技出版社，2011：247-249.

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［5］吳鉅凌，顧亮.龍葵葶藶湯治療肺癌大量惡性胸腔積液及對患者細(xì)胞免疫的影響［J］.中國中醫(yī)急癥，2014，23（2）：242-243.

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（收稿：2014-11-05 修回：2015-01-26）

EffectsofChloroformExtractfromSolanumNlgrumL.onTumorGrowth,SpleenIndexandThymusIn-dexofMicewithLewisLungCarcinomaXenografts

ZHENG Daibo1,GAO Juwei2,PAN Lei3,CHEN Peifeng3. 1First Clinical Medical College of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou (310053),China;2Department of Oncology,Third Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310007),China;3Department of Oncology,First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310006),China

Objective To investigate the effects of chloroform extract from Solanum nlgrum L.on the growth of tumor,spleen index and thymus index of mice.M ethods C57BL/6Jmice were inoculated with Lewis lung carcinoma cells and then were randomly divided into 5 groups:model group,high-,middle-and low-dosage chloroform extract groups,and cyclophosphamide group,with 8 mice in each group.Chloroform extract groups were given 50, 25,12.5ml/kg chloroform extract of Solanum nlgrum L.by gavage,respectively.Cyclophosphamide group was given 20mg/kg of the drug by intraperitoneal injection every 3 days.Model group was given normal saline（0.2mL/10g）by gavage.The process lasted for 15d.After drug withdrawal for 24h,the mice were sacrificed and the tumor mass, thymus and spleen were taken out to be weighted for evaluation of inhibition rate,spleen index and thymus index. Results The inhibition rates were 25.36%,38.93%,13.57%,and 51.43%in high-,middle-,and low-dosage chloroform extract groups and cyclophosphamide group.The average tumor weights of cyclophosphamide group and high-,middle-,and low-dosage chloroform extract groups were 1.36±0.07g,2.09±0.16g,1.71±0.11g,2.42±0.07g, respectively,which significantly differ from that of model group（2.80±0.04;P＜0.01 or P＜0.05）.Compared with those of model group（13.58±1.95mg/10g and 147.40±13.90mg/10g）,the thymus and spleen indexes of middledosage chloroform extract group increased 130.85%and 131.04%,respectively（P＜0.01）,and those of cyclophosphamide group decreased 46.24%and 74.69%,respectively（P＜0.01）.Conclusion Chloroform extract from Solanumnlgrum L.may inhibit the growth of tumor in mice by enhancing the anti-tumor immune response of body through increasing thymus and spleen weights and suppressing their atrophy caused by tumor.

mice;Lewis lung carcinoma xenografts;chloroform extract from Solanum nlgrum L.;anti-tumor; immune response

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2009CA015）

1浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院（杭州 310053）；2浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院腫瘤科（杭州 310007）；3浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科（杭州 310006）

陳培豐，Tel：0571-87072196；E-mail：CPF12345@163.com