乳沒接骨丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

毛和平，路寧維，謝六生，劉光斌，董鈺明

1酒鋼醫(yī)院藥學(xué)部，甘肅嘉峪關(guān)735100；2蘭州大學(xué)藥學(xué)院；

3淮陰工學(xué)院江蘇省介入醫(yī)療器械研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

乳沒接骨丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

毛和平1，路寧維2，3，謝六生1，劉光斌1，董鈺明2△

1酒鋼醫(yī)院藥學(xué)部，甘肅嘉峪關(guān)735100；2蘭州大學(xué)藥學(xué)院；

3淮陰工學(xué)院江蘇省介入醫(yī)療器械研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

目的：建立乳沒接骨丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用顯微鑒別法對(duì)制劑中沒藥、續(xù)斷、紅花和土鱉蟲進(jìn)行定性鑒別；采用薄層色譜法對(duì)紅花和當(dāng)歸進(jìn)行定性鑒別；采用高效液相色譜法測(cè)定制劑中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素含量。色譜柱為Iner tsi l C18(150mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相為甲醇-水(52∶48，v/v)；流速為0.80mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為246 nm。結(jié)果：顯微鑒別結(jié)果清晰；薄層色譜斑點(diǎn)清晰，分離度良好，陰性無干擾，專屬性強(qiáng)，重復(fù)性良好；補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素分別在5.20～83.6μg/mL(r=0.999 1)和4.95～79.2μg/mL(r=0.9995)范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系；平均回收率分別為99.1%(RSD=1.55%，n=9)和99.5%(RSD=2.08%，n=9)。結(jié)論：本方法簡(jiǎn)便、可靠、準(zhǔn)確，可用于乳沒接骨丸的質(zhì)量控制。

乳沒接骨丸；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；補(bǔ)骨脂素；異補(bǔ)骨脂素；顯微鑒別；薄層色譜；高效液相色譜

乳沒接骨丸是在酒鋼醫(yī)院使用多年的固定處方基礎(chǔ)上，進(jìn)一步應(yīng)用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)科學(xué)方法，經(jīng)多年基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究和五年以上臨床應(yīng)用研究，根據(jù)現(xiàn)代制劑工藝制備的水泛丸。由乳香、沒藥、紅花、當(dāng)歸、自然銅、補(bǔ)骨脂、川續(xù)斷和土鱉蟲8味藥物組成，經(jīng)粉碎、加工制成中藥丸劑，具有活血化瘀、消腫生肌、續(xù)筋接骨之功效。臨床上主要用于跌打損傷、筋斷骨折、瘀滯腫痛的治療。

乳香和沒藥活血止痛，消腫生肌為君藥［1-4］；當(dāng)歸和紅花活血化瘀，疏通經(jīng)脈為臣藥［5-7］；土鱉蟲破血逐瘀，續(xù)筋接骨為佐藥［8-9］；自然銅、補(bǔ)骨脂，川續(xù)斷助土鱉蟲續(xù)筋接骨為使藥［10-13］，全方活血化瘀，消腫生肌，續(xù)筋接骨為主。

本實(shí)驗(yàn)采用顯微鑒別方法對(duì)制劑中沒藥、紅花、續(xù)斷和土鱉蟲進(jìn)行鑒別；采用薄層色譜法(TLC)對(duì)紅花和當(dāng)歸進(jìn)行鑒別；采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量，為全面有效控制乳沒接骨丸的質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

戴安Dinonex Ul timate 3000高效液相色譜儀，二極管陣列紫外檢測(cè)器，手動(dòng)進(jìn)樣器，Chromeleon色譜工作站(美國(guó)Dionex公司)；Inertsi l C18(150×4.6 mm，5μm)色譜柱；分析天平(上海奧豪斯Discovery專業(yè)性分析天平)；KH-300DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；Motic B5系列無限遠(yuǎn)校正光學(xué)系統(tǒng)顯微鏡(麥克迪奧實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)；ZF-3型三用紫外分析儀(上海顧村電光儀器廠)。

自制乳沒接骨丸(批號(hào)：20110201、20110202、20110203)；紅花對(duì)照藥材(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：120907-201010)；當(dāng)歸對(duì)照藥材(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：120927-201014)；補(bǔ)骨脂素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110739-200814)；異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110738-201012)；甲醇(色譜純，山東禹王試劑)；二次重蒸餾水(蘭州大學(xué)GLP實(shí)驗(yàn)中心)，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別［14］取乳沒接骨丸，研細(xì)，挑取適量樣品，置載玻片中央，滴加水合氯醛試液2滴，透化后制片。置顯微鏡下觀察：不規(guī)則碎塊淡黃色，半透明，滲出油滴，加熱后油滴溶化，現(xiàn)正方形草酸鈣結(jié)晶(沒藥)；草酸鈣簇晶甚多，直徑15～50μm，散在或存在于皺縮的薄壁細(xì)胞中，有時(shí)數(shù)個(gè)排列成緊密的條狀(續(xù)斷)；花粉粒類圓形、橢圓形或橄欖形，直徑約至60μm，具3個(gè)萌發(fā)孔，外壁有齒狀突起。草酸鈣方晶存在于薄壁細(xì)胞中，直徑2～6μm(紅花)；體壁碎片黃色或棕紅色，有圓形毛窩，直徑8～24μm，可見長(zhǎng)短不一的剛毛，有的具縱直紋理(土鱉蟲)，見圖1。

圖1 乳沒接骨丸顯微鑒別圖譜

2.2 TLC鑒別

2.2.1 紅花TLC鑒別［14］取乳沒接骨丸適量，碾碎，稱取粉末2.0 g，加80%丙酮溶液6mL，密塞，振搖15分鐘，靜置，取上清液作為供試品溶液。另取紅花對(duì)照藥材粉末0.5 g，加80%丙酮溶液5mL。同法制成對(duì)照藥材溶液。另按處方比例制備不含紅花的陰性制劑，同法制成陰性對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅥB)實(shí)驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠HF254薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(7∶2∶3∶0.4)為展開劑，展開，取出，晾干，觀察斑點(diǎn)。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品在此處無干擾，見圖2。

圖2 乳沒接骨丸中紅花TLC色譜圖

2.2.2 當(dāng)歸的TLC鑒別［14］取乳沒接骨丸適量，碾碎，稱取粉末6.0 g，加甲醇20mL，超聲處理(120W，40 kHz)15分鐘，濾過，濾液濃縮至1mL，作為供試品溶液。另取當(dāng)歸對(duì)照藥材1.0 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。另按處方比例制備不含當(dāng)歸的陰性制劑，同法制成陰性對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅥB)實(shí)驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各1μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯(9∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品在此處無干擾，見圖3。

圖3 乳沒接骨丸中當(dāng)歸TLC色譜圖

2.3 補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素HPLC測(cè)定［14］

2.3.1 色譜條件Iner tsi l C18色譜柱(150mm× 4.6mm，5μm)，以甲醇-水(52∶48，v/v)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為246 nm，柱溫25℃，流速0.80mL/min，進(jìn)樣量10μL。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品適量，加甲醇溶解并稀釋制成每1mL中約各含10μg的溶液，即得對(duì)照品溶液。

2.3.3 供試品及陰性對(duì)照品溶液的制備 取乳沒接骨丸適量，研細(xì)，取粉末約5.0 g(相當(dāng)于補(bǔ)骨脂0.50 g)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇50mL，密塞，超聲處理40分鐘(120W，40 kHz)，待冷卻至室溫后濾過，并用甲醇洗滌3次，10mL/次，濾液再經(jīng)微孔濾膜(0.22μm)濾過，最后定容至100mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋1倍，即得供試品溶液。取按處方比例及工藝制備缺補(bǔ)骨脂樣品，同供試品溶液制備方法制得陰性對(duì)照品溶液。

2.3.4 專屬性實(shí)驗(yàn) 分別取對(duì)照品溶液，供試品溶液及陰性對(duì)照品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，供試品溶液在該色譜條件下分離度良好，陰性無干擾，見圖4。

圖4 乳沒接骨丸HPLC色譜圖

2.3.5 線性關(guān)系考察 精密稱取補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品各約20 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲使溶解并稀釋至刻度，搖勻備用。精密量取該溶液適量，加流動(dòng)相分別稀釋25、50、100、200、400倍，分別得到5個(gè)濃度的對(duì)照品溶液。0.22μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，按“2.3.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定峰面積。分別取上述溶液各10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，量取峰面積。以對(duì)照品濃度(C)為橫坐標(biāo)，峰面積平均值(A)為縱坐標(biāo)，計(jì)算，得回歸方程。補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的回歸方程分別為A=3.742 93C+81.277 01 (r=0.999 1)和A=1.59 802 C+39.091 63(r=0.999 5)。結(jié)果表明，補(bǔ)骨脂素在濃度為5.20～83.6μg/mL范圍內(nèi)，異補(bǔ)骨脂素在濃度為4.95～79.2μg/mL范圍內(nèi)，其濃度與色譜峰峰面積線性關(guān)系良好。

2.3.6 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10μL，按上述條件重復(fù)測(cè)定6次，結(jié)果補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素峰面積RSD分別為1.25%(n=6)和1.38% (n=6)，保留時(shí)間RSD分別為0.15%(n=6)和0.12% (n=6)，表明方法精密度良好。

2.3.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液分別于0，2，6，8，12小時(shí)測(cè)定補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量，測(cè)得峰面積RSD分別為1.59%(n=5)和 1.90%(n=5)，保留時(shí)間RSD分別為0.18%(n=5)和0.15%(n=5)。結(jié)果表明供試品溶液在12小時(shí)內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批號(hào)(20110201)樣品6份，按“2.3.3”項(xiàng)下供試品制備方法分別處理，按“2.3.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定樣品中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量，測(cè)得補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素含量RSD分別為1.34%(n=6)和1.47%(n=6)，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已測(cè)定的乳沒接骨丸樣品(批號(hào)：20110201)9份，每份約5.0 g，精密稱定，分別精密加入一定量的補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品，按“2.3.3”項(xiàng)下制備樣品，測(cè)定補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量，分別計(jì)算回收率，見表1—2。

2.3.10 含量測(cè)定 取3個(gè)不同批號(hào)(批號(hào)：20110201、20110202、20110203)樣品，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。分別精密吸取10μL，依法測(cè)定補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量，結(jié)果3批樣品中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量(g/g)分別為0.046%和0.037%，0.047%和0.038%，0.048%和0.039%。

表1 乳沒接骨丸中補(bǔ)骨脂素加樣回收率實(shí)驗(yàn)(n=9)

表2 乳沒接骨丸中異補(bǔ)骨脂素加樣回收率實(shí)驗(yàn)(n=9)

3 討論

3.1 TLC鑒別 在紅花和當(dāng)歸TLC鑒別時(shí)，分別從溫度(15℃、25℃和30℃)，濕度(15%、25%和35%)以及不同薄層板(青島裕民源和手鋪板)3個(gè)方面考察了方法耐用性，結(jié)果斑點(diǎn)清晰，分離度良好，分離無明顯差異，表明方法耐用性良好。

3.2 HPLC含量測(cè)定 補(bǔ)骨脂具有促進(jìn)骨骼再生與重建、抗癌活性和提高免疫系統(tǒng)功能等作用［15］。補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素均是補(bǔ)骨脂的有效成分。補(bǔ)骨脂素可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖與分化成熟，并抑制破骨細(xì)胞活性，發(fā)揮促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收的雙重作用［11］。異補(bǔ)骨脂素能促進(jìn)骨髓充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化［16］?！吨袊?guó)藥典》2010年版一部收載了補(bǔ)骨脂原藥材中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量測(cè)定方法，本研究對(duì)該方法進(jìn)行了優(yōu)化，建立了一種靈敏、專屬可靠的高效液相色譜法測(cè)定制劑中的補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量。

3.3 含量限度 《中國(guó)藥典》2010年版一部收載的補(bǔ)骨脂原藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定“本品按干燥品計(jì)算，含補(bǔ)骨脂素(C11H6O3)和異補(bǔ)骨脂素(C11H6O3)的總量不得少于0.70%?！毖a(bǔ)骨脂在乳沒接骨丸處方中占10%，忽略工藝因素，可計(jì)算在該制劑中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的總量應(yīng)為0.070%?？紤]制備工藝中的損失量，按原藥材的80%計(jì)算，補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素在該制劑中的總含量不得低于0.056%。

因此，乳沒接骨丸中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量限度暫定為“本品每丸含補(bǔ)骨脂以補(bǔ)骨脂素(C11H6O3)和異補(bǔ)骨脂素(C11H6O3)的總量計(jì)，不得少于0.056%?！?/p>

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Research on theQuality Standard of RuMo JieGu Pills

MAO Heping1,LU Ningwei2,3,XIE Liusheng1,LIU Guangbin1,DONG Yuming2△
1 Pharmacy School of Jiugang Hospital,Jiayuguan 735100,China;
2 Pharmacy School of Lanzhou University;
3 Jiangsu Provincial Key Laboratory for InterventionalMedical Devices in Huaiyin Institute of Technology

Objective:To formulate the quality standard for RuMo JieGu pills.Methods:The qualities of Moyao(Commiphora myrrha Eng1.),Xuduan(Radix Dipsaci),Honghua(Carthamus tinctorius L.),and Tubiechong (Eupolyphaga seu Steleophaga)in the pillswere identified bymicroscopic examination;the naturesof Honghua and Danggui were detected by thin layer chromatography(TLC);the contentsof psoralen and isopsoralenweremeasured by high performance liquid chromatography(HPLC).The operating conditionsby HPLCwere InertsilC18 column (150mm×4.6mm,5μm),v(methanol)/v(water)=52/48 asmobile phase,0.80m L/m in as flow speed and wavelength 246 nm.Results:The resultsobserved bymicroscopy were obvious;the TLC spots developed were clearw ith efficientseparating ability,whichwere negative noninterferencew ith the characteristicsofhigh specificity and satisfactory reproducibility;the linear relation between psoralen among 5.20 and 83.6μg/m L(r=0.999 1)and the isopsoralen from 4.95 to 79.2μg/m L (r=0.999 5)was excellent;the average recoveries of psoralen and isopsoralen were 99.1%(RSD=1.55%，n=9)and 99.5%(RSD=2.08%，n=9),respectively.Conclusion:M icroscopy,TLC and HPLC arehandy,safeand accurate for RuMo JieGu pills to determine the quality.

RuMo JieGu pills;quality standard;psoralen;isopsoralen;microscopic identification;TLC;HPLC

R284.1

A

1004-6852(2015)01-0018-05

2014-01-06

江蘇省介入醫(yī)療器械研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金資助項(xiàng)目(編號(hào)j r l209)。

毛和平(1965—)，男，副主任中藥師。研究方向：中藥制劑。

△通訊作者：董鈺明(1971—)，男，博士學(xué)位，碩士研究生導(dǎo)師，副教授。研究方向：藥物分析。