結(jié)核性腦膜炎臨床分離株表型耐藥特點(diǎn)及其治療效果研究

王婷 趙雁林 逄宇 馮國(guó)棟 宋媛媛 歐喜超 彭晉湘 趙鋼 戰(zhàn)麗萍

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·論著·

結(jié)核性腦膜炎臨床分離株表型耐藥特點(diǎn)及其治療效果研究

王婷 趙雁林 逄宇 馮國(guó)棟 宋媛媛 歐喜超 彭晉湘 趙鋼 戰(zhàn)麗萍

目的 研究分析結(jié)核性腦膜炎(tuberculous meningitis, TBM)的致病菌對(duì)抗結(jié)核藥的耐藥特點(diǎn)及抗結(jié)核藥對(duì)致病菌的治療效果。方法 500例疑似TBM患者腦脊液標(biāo)本經(jīng)MGIT(mycobacteria growth indicator tube)960液體培養(yǎng)出25株臨床分離株，再用16S rRNA基因測(cè)序法進(jìn)行菌種鑒定。繼而對(duì)這25株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株分別進(jìn)行14種抗結(jié)核藥物的MGIT 960液體藥敏試驗(yàn)和12種抗結(jié)核藥物的傳統(tǒng)比例法固體藥敏試驗(yàn)、16種抗結(jié)核藥物的最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定。通過(guò)計(jì)算血藥濃度峰值(Cmax)/MIC值的大小來(lái)判斷藥物對(duì)菌株殺菌率的高低，并由此推斷藥物對(duì)該致病菌的治療效果。結(jié)果 液體藥敏試驗(yàn)結(jié)果和固體藥敏試驗(yàn)結(jié)果均顯示了任意耐藥的TBM臨床分離株有13株(13/25), 耐多藥的TBM臨床分離株有3株(3/25)；利福平、莫西沙星、左氧氟沙星、氯法齊明、對(duì)氨基水楊酸的Cmax/MIC值分別為19.880、63.333、19.149、75.000、50.855。結(jié)論 莫西沙星、氯法齊明、對(duì)氨基水楊酸、左氧氟沙星、利福平的Cmax/MIC值較高，提示臨床上使用高劑量利福平和氟喹諾酮類(lèi)藥物聯(lián)合治療TBM可以提高療效；對(duì)氨基水楊酸和氯法齊明對(duì)耐多藥TBM臨床分離株可能有較好效果。

結(jié)核, 腦膜/藥物療法; 表型; 微生物敏感性試驗(yàn); 治療結(jié)果

截至2011年，全球耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)已出現(xiàn)310 000例，耐多藥結(jié)核性腦膜炎(MDR-TBM)也相繼出現(xiàn)報(bào)道[1]，全世界約有200萬(wàn)例潛伏感染患者并可能復(fù)發(fā)，成為結(jié)核病防治的重大難題之一[2]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)Mtb感染占肺外結(jié)核的5%，其中結(jié)核性腦膜炎(tuberculous meningitis, TBM)危害最嚴(yán)重。耐藥結(jié)核病的出現(xiàn)降低了現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)治療方案的效果，亟需精確的藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱(chēng)“藥敏試驗(yàn)”)數(shù)據(jù)來(lái)實(shí)施個(gè)體化的治療。抗結(jié)核藥物最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC) 能精細(xì)地反映Mtb的耐藥程度，對(duì)治療MDR-TB具有重要價(jià)值。MIC值的測(cè)定也是篩選新抗結(jié)核藥物的重要環(huán)節(jié)[3]。以前Mtb藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)臨界濃度的設(shè)置有所不同。1963年，Canetti 等[4]注意到Mtb菌群具有不均一性，每個(gè)培養(yǎng)的野生型Mtb菌落可能含有很小比例(<1%)的耐藥菌株。研究人員根據(jù)這1%比例的耐藥突變，制定了標(biāo)準(zhǔn)的臨界藥物濃度以區(qū)分敏感和耐藥菌株，此后確定了一線(xiàn)抗結(jié)核藥物的體外藥敏試驗(yàn)臨界值并沿用至今[5]，后來(lái)又陸續(xù)制定出二線(xiàn)抗結(jié)核藥物藥敏試驗(yàn)的臨界濃度。目前，大部分抗結(jié)核藥物的臨界濃度和臨床治療結(jié)果之間并沒(méi)有清晰的對(duì)應(yīng)關(guān)系[6]。MIC快速檢測(cè)方法藥敏試驗(yàn)臨界值的設(shè)置是通過(guò)與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相對(duì)比，繪制受試者工作特征曲線(xiàn)(receiver operating characteristic curves，ROC) 來(lái)得到一個(gè)與傳統(tǒng)方法符合率最高的臨界值[7]。這種臨界值的確定既缺乏足夠的樣本量，又常忽略Mtb菌群差異對(duì)臨界值的影響。因此，建立規(guī)范、有效的Mtb藥敏試驗(yàn)MIC的檢測(cè)方法及設(shè)置有效的臨界值，對(duì)于結(jié)核病個(gè)體化治療、快速耐藥檢測(cè)方法的研究和新型抗結(jié)核藥物篩選等領(lǐng)域具有重要意義，也是控制MDR-TB產(chǎn)生和傳播的關(guān)鍵。而大部分抗結(jié)核藥物均屬于濃度依賴(lài)型抗生素，其殺滅致病菌的效果主要取決于血藥濃度峰值(Cmax)與MIC的比值[8]。因此，筆者就TBM致病菌對(duì)抗結(jié)核藥物的表型耐藥、MIC及其臨界值的特點(diǎn)做了初步研究。并通過(guò)計(jì)算Cmax/MIC值的大小來(lái)研究抗結(jié)核藥物對(duì)菌株的殺菌率，并由此推斷藥物對(duì)該致病菌的治療效果，以了解TBM的致病菌對(duì)抗結(jié)核藥物的耐藥特點(diǎn)及抗結(jié)核藥物對(duì)致病菌的治療效果。

材料和方法

一、一般資料

1. 菌株獲?。罕緦?shí)驗(yàn)從2010年7月至2011年6月收集了500例疑似TBM患者的腦脊液標(biāo)本，這些患者來(lái)自全國(guó)22家大中型醫(yī)院。所選TBM患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)均參照2009年5月南非國(guó)際結(jié)核性腦膜炎大會(huì)制定的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行[9]。所有納入患者HIV檢測(cè)為陰性，并做了MGIT 960液體培養(yǎng)。有25例患者培養(yǎng)陽(yáng)性，包括男8例，女17例，年齡范圍3～82歲，平均年齡(35.68±23.36)歲，以H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC25177，來(lái)自國(guó)家參比實(shí)驗(yàn)室)作為藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照菌株。25株臨床分離株均經(jīng)PCR基因測(cè)序法鑒定為Mtb[10]。菌株均保存在-70 ℃，然后在37 ℃固體培養(yǎng)基上復(fù)蘇2～3個(gè)星期。該研究所納入的患者均已簽署知情同意書(shū)，并得到西京醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

2. 診斷標(biāo)準(zhǔn)：500例疑似TBM患者至少同時(shí)符合以下3個(gè)診斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)發(fā)熱、頭痛、嘔吐、頸項(xiàng)強(qiáng)直；(2)腦脊液細(xì)胞增多，以白細(xì)胞和單核細(xì)胞為主，糖含量降低，蛋白含量增高，且沒(méi)有其他致病菌感染；(3)影像學(xué)顯示腦栓塞或腦積液，或有粟粒型肺結(jié)核。

3. 試劑和儀器：L-J固體培養(yǎng)基依據(jù)《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[11]由國(guó)家參比實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)一制備。全自動(dòng)Bactec MGITTM960TB系統(tǒng)(美國(guó)BD公司生產(chǎn))，Middlebrook 7H9干粉和油酸、白蛋白、右旋糖和過(guò)氧化氫酶(OADC)培養(yǎng)液(美國(guó)BD公司生產(chǎn))；Alamar blue購(gòu)自英國(guó)AbD Serotec公司；滅菌96孔板購(gòu)自美國(guó)Corning公司；藥品均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。異煙肼(H)、乙胺丁醇(E)、鏈霉素(S)、卡那霉素(Km)、阿米卡星(Am)、卷曲霉素(Cm)、莫西沙星(Mfx)、對(duì)氨基水楊酸(PAS)、環(huán)絲氨酸(Cs)、克拉維酸(TLC)溶于雙蒸水?？死顾?Clr)、苯乙烯基甲基甲酮縮氨硫脲(Thz)、利福平(R)、乙硫異煙胺(Eto)、美羅培南(MEC)、丙硫異煙胺(Pto)、氯法齊明(Cfz)溶于二甲基亞砜(DMSO)有機(jī)溶劑中；左氧氟沙星(Lfx)、氧氟沙星(Ofx)溶于NaOH(0.1N)中。所有藥物置于-20～4 ℃存放。

4. MGIT 960藥敏試驗(yàn)：根據(jù)2008年WHO最新指南[12]推薦藥物和濃度，選擇了14種抗結(jié)核藥物[H(0.1 μg/ml)、R(1 μg/ml)、E(5 μg/ml)、Z(100 μg/ml)、S(1 μg/ml)、Km(2.5 μg/ml)、Am(1 μg/ml)、Cm(2.5 μg/ml)、Mfx(0.5或2.0 μg/ml)、Ofx(2.0 μg/ml)、Lfx(1.5 μg/ml)、PAS(4 μg/ml)、Eto(5 μg/ml)、Pto(2.5 μg/ml)]行液體藥敏試驗(yàn)。孵育至儀器報(bào)陽(yáng)，最多培養(yǎng)4周，如未能生長(zhǎng)，儀器將報(bào)告為陰性[13]。

5. 傳統(tǒng)比例法固體藥敏試驗(yàn)：根據(jù)2008年WHO最新指南[11]推薦藥物和濃度，選擇12種抗結(jié)核藥物[H(0.2 μg/ml)、R(40 μg/ml)、E(2 μg/ml)、S(4 μg/ml)、Km(30 μg/ml)、Am(30 μg/ml)、Cm(40 μg/ml)、Ofx(4 μg/ml)、Lfx(4 μg/ml)、 PAS(1 μg/ml)、Pto(40 μg/ml)、Cs(30 μg/ml)]進(jìn)行比例法藥敏試驗(yàn)；耐藥結(jié)果判定：耐藥百分比=(含藥培養(yǎng)基的菌落數(shù)/對(duì)照培養(yǎng)基的菌落數(shù))×100%。耐藥百分比<1%為敏感，≥1%為耐藥[14]。

6. MIC的測(cè)定：參照2008年的美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(Clinical and Laboratory Stan-dards Institute,CLSI)推薦的藥物濃度和Alamar blue顯色法[15]，選擇了16種抗結(jié)核藥物[H、R、E、Km、Am、Cm、Mfx、Lfx、PAS、Pto、Cs、Clr、阿莫西林-克拉維酸(Amx-Clv)、Thz、Cfz、MEC]進(jìn)行MIC試驗(yàn)。

7. 數(shù)據(jù)的整理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：統(tǒng)計(jì)菌株對(duì)各藥物的MIC范圍。其中MIC實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度可利用ROC曲線(xiàn)評(píng)價(jià)，曲線(xiàn)下面積(AUC)越大，則認(rèn)為該方法正確區(qū)分Mtb耐藥和敏感的能力越大。ROC曲線(xiàn)可給出區(qū)分耐藥和敏感的最佳耐藥閾值(藥敏界值)，當(dāng)AUC為1時(shí)，該閾值可正確將耐藥和敏感菌株完全分開(kāi)，當(dāng)AUC≤0.5時(shí)，該閾值不能將耐藥和敏感菌株完全分開(kāi)。用SPSS 16.0軟件進(jìn)行ROC曲線(xiàn)分析，結(jié)合傳統(tǒng)比例法固體和液體藥敏試驗(yàn)的結(jié)果，并以此作為金標(biāo)準(zhǔn)，確定各抗結(jié)核藥物的折點(diǎn)濃度，并計(jì)算菌株對(duì)該藥物的AUC。

8. 計(jì)算藥物對(duì)菌株殺菌率的高低：筆者通過(guò)計(jì)算Cmax/MIC值的大小來(lái)研究藥物對(duì)菌株殺菌率的高低，并由此推斷藥物對(duì)該致病菌的治療效果。因所選15種抗結(jié)核藥均為濃度依賴(lài)性殺菌劑，故采用文獻(xiàn)報(bào)道的濃度依賴(lài)性殺菌劑所用標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)氨基糖苷類(lèi)，若Cmax/MIC≥8～10，臨床有效率可達(dá)90%；對(duì)氟喹諾酮類(lèi)，若Cmax/MIC≥10～12，可達(dá)最高的殺菌率[20]。

9. 質(zhì)量控制(簡(jiǎn)稱(chēng)“質(zhì)控”)：質(zhì)控選取標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv作為藥敏試驗(yàn)參考標(biāo)準(zhǔn)菌株，以及空白培養(yǎng)基和無(wú)菌蒸餾水做空白對(duì)照。每部分實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次或3次以上。若一致，說(shuō)明質(zhì)控合格；若不一致，說(shuō)明質(zhì)控不合格，還需重新檢測(cè)。

二、相關(guān)概念

MDR-TBM：是指同時(shí)耐H和R的TBM；廣泛耐藥結(jié)核性腦膜炎(XDR-TBM)：是指同時(shí)耐H和R，也耐氟喹諾酮類(lèi)藥或二線(xiàn)抗結(jié)核注射藥類(lèi)中的任意一種[15]。

結(jié) 果

一、藥敏試驗(yàn)結(jié)果

比例法和MGIT 960藥敏試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果基本一致(表1)，綜合固體和液體藥敏試驗(yàn)結(jié)果后發(fā)現(xiàn)，任意耐藥(包括一線(xiàn)和二線(xiàn)抗結(jié)核藥物)的TBM臨床分離株有13株(13/25)，對(duì)一線(xiàn)4種抗結(jié)核藥物(H、R、E、Z)全敏感者有15株；耐藥菌株10株，其中表型耐H或R所占的比例較大，MDR-TBM有3株(3/25)。二線(xiàn)注射藥(S、Km、Am、Cm)敏感株有19株(19/25)；口服二線(xiàn)抑菌藥(PAS、Pto、Eto、Cs)敏感株有20株(20/25)；表型耐氟喹諾酮類(lèi)藥(Mfx、Ofx、Lfx)有2株(2/25)，敏感株有23株(23/25)。

二、25株TBM臨床分離株對(duì)16種抗結(jié)核藥物的MIC及其與菌株耐藥表型的關(guān)系

H、R、E、Km、Am、Cm、Mfx、Lfx、PAS、Pto、Cs、MEC、Clr、Thz、Cfz、Amx的敏感株MIC值中位數(shù)分別為25.60、0.50、5.00、4.00、2.00、5.00、0.08、0.16、0.31、5.00、20.00、64.00、12.50、20.00、0.32、480.00 μg/ml(表2)。

三、15種抗結(jié)核藥物的最佳藥敏界值分析

由于不同個(gè)體差異較大，Cmax(峰值血藥濃度) 影響因素廣泛，筆者參閱匯總了多篇國(guó)際上權(quán)威文獻(xiàn)報(bào)道的Cmax值[16-23]。由于MEC、Amx、Cfz、Pto、Clr未做固體藥敏試驗(yàn)，因此沒(méi)有通過(guò)做ROC曲線(xiàn)來(lái)確定最佳藥敏界值，所取藥敏界值為大部分TBM臨床分離株的MIC值(表3)。其余藥物的ROC曲線(xiàn)下面積(AUC)數(shù)值大小均在0.500～1.000之間。其中R、Mfx、Lfx、Cfz、PAS的Cmax/MIC值較高，分別為19.880、63.333、19.149、75.000、50.855，均>12.000。E、MEC、Amx的Cmax/MIC值較低，分別為0.115、0.010、0.004。氨基糖苷類(lèi)Km、Am、Cm的Cmax/MIC值分別為1.830、1.800、5.300，均<8.000。

討 論

根據(jù)國(guó)際防癆和肺部疾病聯(lián)合會(huì)和世界衛(wèi)生組織對(duì)于結(jié)核病藥敏試驗(yàn)藥物濃度界限確定的原則[24]，將肺結(jié)核臨床分離株對(duì)H的MIC界值限定為4.00或8.00 μg/ml；R為0.25或1.00 μg/ml；E為1.00 μg/ml；Km為5.00 μg/ml；Am為4.00 μg/ml；Mfx為2.00 μg/ml；Lfx為2.00 μg/ml；PAS為2.00 μg/ml；Pto為5.00 μg/ml；Cs為32.00 μg/ml[25]。本實(shí)驗(yàn)中H、R、E、Km、Am、Cm、Mfx、Lfx、PAS、Pto、Cs分別為25.60、0.50、5.00、4.00、2.00、5.00、0.08、0.16、0.31、5.00、20.00 μg/ml，普遍較肺結(jié)核低。但TBM臨床分離株對(duì)H、E的MIC界值(25.60，5.00)普遍較肺結(jié)核(4.00，1.00)臨床分離株高。筆者查閱了原始數(shù)據(jù)資料并重復(fù)了4次試驗(yàn)，菌株重新接種后也更換了不同批次的藥物，發(fā)現(xiàn)仍然是相同結(jié)果。目前，大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的MIC值均是針對(duì)肺結(jié)核臨床分離株的，而對(duì)TBM臨床分離株的相關(guān)數(shù)據(jù)報(bào)道甚少，還沒(méi)有權(quán)威文獻(xiàn)可供參考。因此，筆者認(rèn)為造成H和E的MIC界值普遍較高的原因可能有：肺結(jié)核臨床分離株的MIC界值和TBM臨床分離株的MIC界值不相同；H、E的Cmax/MIC值分別為0.600和0.115(表3)，也可說(shuō)明H、E對(duì)TBM臨床分離株殺菌率較低，治療效果不好；菌株數(shù)太少，導(dǎo)致數(shù)據(jù)代表性不強(qiáng)；但由于分離TBM臨床菌株難度很大，造成本研究的菌株數(shù)十分有限。若在今后的工作中能繼續(xù)擴(kuò)大樣本量，相信還會(huì)有更多發(fā)現(xiàn)。

表1 不同藥物采用比例法固體和MGIT 960液體技術(shù)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)的結(jié)果

注 H：異煙肼； R：利福平； Z：吡嗪酰胺； E：乙胺丁醇； S：鏈霉素； Km：卡那霉素； Am：阿米卡星； Cm：卷曲霉素； Mfx：莫西沙星； Ofx：氧氟沙星； Lfx：左氧氟沙星； PAS：對(duì)氨基水楊酸； Eto：乙硫異煙胺； Pto：丙硫異煙胺； Cs：環(huán)絲氨酸；“-”表示W(wǎng)HO暫未推薦做固體藥敏試驗(yàn)或液體藥敏試驗(yàn)

表2 25株TBM臨床分離株對(duì)16種抗結(jié)核藥物的MIC特征

注 括號(hào)內(nèi)數(shù)值為中位數(shù)

表3 15種藥物最佳藥敏界值分析

注 Cmax：血藥峰值濃度，即用藥后所能達(dá)到的最高血漿藥物濃度，所選數(shù)值來(lái)自于參考文獻(xiàn)；AUC：曲線(xiàn)下面積；-：未做比例法固體藥敏試驗(yàn)；表中MIC值為大部分TBM臨床分離株的MIC值

目前，臨床對(duì)于TBM患者的治療仍在延用肺結(jié)核的治療方法[23]，對(duì)于MDR-TB，通常采用二線(xiàn)抗結(jié)核藥物和氟喹諾酮類(lèi)藥物進(jìn)行治療。其中氟喹諾酮類(lèi)藥物投入臨床時(shí)間較長(zhǎng)、應(yīng)用的抗菌范圍較廣、不良反應(yīng)小、價(jià)格低廉，已被WHO納入MDR-TB的臨床治療方案，成為聯(lián)合治療的核心藥物之一。MDR-TB治療的成敗與Mtb對(duì)氟喹諾酮類(lèi)藥物是否耐藥密切相關(guān)[26]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，氟喹諾酮類(lèi)藥物中Mfx治療結(jié)核病效果最好[27]。但隨著Mfx的廣泛應(yīng)用，未使用Mfx的患者感染耐藥菌株的概率增大，可能導(dǎo)致MIC界限不清，難以確定耐藥界限。對(duì)Mfx敏感的肺結(jié)核臨床分離株MIC值多集中于0.200 μg/ml，耐Mfx的肺結(jié)核臨床分離株MIC值多集中于6.000 μg/ml。本實(shí)驗(yàn)中對(duì)Mfx敏感的TBM菌株的MIC值多集中于0.080 μg/ml, 對(duì)Mfx耐藥的TBM菌株的MIC值多集中于0.120 μg/ml(表2)，明顯低于肺結(jié)核臨床分離株，且Cmax/MIC值高達(dá)63.333。由此提示，Mfx對(duì)TBM臨床分離株的殺菌力較對(duì)肺結(jié)核的臨床分離株高，可能會(huì)有不錯(cuò)的治療效果。也有文獻(xiàn)報(bào)道高劑量R和氟喹諾酮類(lèi)藥物聯(lián)合治療TBM可以提高療效[24]。本研究也發(fā)現(xiàn)Mfx、Lfx、R的Cmax/MIC分別為63.333、19.149、19.880，均>12，其中R最低。提示聯(lián)合高劑量R和氟喹諾酮類(lèi)藥物治療TBM會(huì)有不錯(cuò)的療效。

此外，關(guān)于TBM的治療，不僅要考慮體外檢測(cè)到的MIC和Cmax，還應(yīng)考慮藥物對(duì)血腦屏障的穿透能力和在腦脊液中能達(dá)到的實(shí)際濃度。由于血腦屏障的存在，使治療時(shí)間更長(zhǎng)，且可選擇的藥物少，對(duì)多耐藥患者更是如此。血腦屏障能阻止約95%的藥物進(jìn)入腦組織[28]，使療效大大降低。H、Z、Pto能完全通過(guò)血腦屏障，R在腦組織中有較高的Cmax/MIC，據(jù)報(bào)道氟喹諾酮類(lèi)藥物與H、R有協(xié)同作用[29]。腦膜的病理性破壞可使血腦屏障的通透性增加，從而使能部分通過(guò)血腦屏障的藥物進(jìn)入腦組織的藥量增加。由于Mtb屬細(xì)胞內(nèi)病原菌，大多被肺泡巨噬細(xì)胞(AM)所吞噬, 余者處于肺上皮細(xì)胞的襯液(ELF)中，故R、Lfx、Mfx在肺泡細(xì)胞(AC)、AM及ELF中的濃度反映了其在感染部位的實(shí)際分布, 在炎癥條件下，可以部分通過(guò)血腦屏障[30]，在腦脊液中有良好的分布，可用于治療TBM[19]。氟喹諾酮類(lèi)藥物普遍具有良好的藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，口服生物利用度≥78%，其血漿蛋白結(jié)合率較低(≤40%)，易于透過(guò)細(xì)胞膜而達(dá)到治療感染所需的組織濃度。由表3可看出MIC/Cmax值較低的為E和Amx，由此推斷治療TBM效果可能不好，即使加大劑量效果也一般。這可能是由于單用E時(shí)細(xì)菌可迅速產(chǎn)生耐藥性，對(duì)胞內(nèi)Mtb無(wú)效，且其不能滲入正常腦膜(TBM患者腦脊液中可有微量)，因此殺菌效果不好。近幾年Amx的廣泛使用可能也是導(dǎo)致其耐藥率增加的原因，因此必須與其他抗結(jié)核藥聯(lián)合應(yīng)用。當(dāng)用于曾接受抗結(jié)核藥物治療的患者時(shí)，應(yīng)至少與一種二線(xiàn)藥物合用，有文獻(xiàn)報(bào)道Amx和Am聯(lián)用可增加治療效果[17]。MEC不易透過(guò)血腦屏障，若要治療TBM，還需加大劑量。氨基糖苷類(lèi)藥物(如Am和km)的Cmax/MIC值均<8 μg/ml，H的Cmax/MIC值<1,因此其在TBM治療中的應(yīng)用還有待評(píng)價(jià)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Pto、Clr用于治療TBM效果一般；Cm、PAS治療TBM可能會(huì)起到不錯(cuò)的效果。有文獻(xiàn)報(bào)道Cfz對(duì)Mtb及耐多藥Mtb均有較強(qiáng)的體外抗菌作用[31]，其作用機(jī)制主要是干擾核酸代謝及能量代謝，不易產(chǎn)生耐藥性，與現(xiàn)有抗結(jié)核藥物無(wú)交叉耐藥，與細(xì)胞色素P450酶沒(méi)有內(nèi)在的相互作用[19]。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)Cfz的Cmax/MIC值高達(dá)75.000(表3)，因此使用較少劑量即可達(dá)到較大殺菌率。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道貝達(dá)喹啉(bedaquiline)和地依麥迪(delamanid)較易滲透血腦屏障，在治療MDR-TBM中也會(huì)有很好前景[32]。

綜上所述，關(guān)于TBM臨床分離株耐藥性、最低抑菌濃度及各類(lèi)抗結(jié)核藥對(duì)致病菌的治療效果方面的研究，國(guó)內(nèi)還未見(jiàn)類(lèi)似報(bào)道。本課題很好地?cái)U(kuò)展了結(jié)核病的研究范圍，有助于解決臨床上的諸多問(wèn)題。比如，同樣是不耐藥的Mtb，為何對(duì)肺結(jié)核療效好的藥物對(duì)TBM的療效卻不好？如何才能更快、更有效地治療TBM？諸如此類(lèi)問(wèn)題將是結(jié)核病基礎(chǔ)和臨床研究的新方向，值得每位學(xué)者為之探索發(fā)現(xiàn)。

[1] Patel VB, Padayatchi N, Bhigjee AI, et al. Multidrug-resis-tant tuberculous meningitis in KwaZulu-Natal, South Africa. Clin Infect Dis, 2004, 38(6):851-856.

[2] Zumla A, Raviglione M, Hafner R, et al. Tuberculosis. N Engl J Med, 2013, 368(8):745-755.

[3] Khan A, Sarkar D. A simple whole cell based high throughput screening protocol usingMycobacteriumbovisBCG for inhibitors against dormant and active tubercle bacilli. J Microbiol Metho-ds, 2008, 73(1): 62-68.

[4] Canetti G, Froman S, Grosset J, et al. Mycobacteria: laboratory methods for testing drug sensitivity and resistance. Bull World Health Organ, 1963, 29(5): 565-578.

[5] Gumbo T. New susceptibility breakpoints for first-line antituberculosis drugs based on antimicrobial pharmacokinetic/pharmacodynamic science and population pharmacokinetic variability. Antimicrob Agents Chemother, 2010, 54(4): 1484-1491.

[6] Steingart KR, Henry M, Laal S, et al. A systematic review of commercial serological antibody detection tests for the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis. Postgrad Med J, 2007, 83(985): 705-712.

[7] Luna-Herrera J, Martínez-Cabrera G, Parra-Maldonado R, et al. Use of receiver operating characteristic curves to assess the performance of a microdilution assay for determination of drug susceptibility of clinical isolates ofMycobacteriumtuberculosis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2003, 22(1): 21-27.

[8] Wise R. Maximizing efficacy and reducing the emergence of resistance. J Antimicrob Chemother, 2003, 51 Suppl 1: S37-42.

[9] Marais S, Thwaites G, Schoeman JF, et al. Tuberculous meningitis: a uniform case definition for use in clinical research. Lancet Infect Dis, 2010, 10(11): 803-812.

[10] 王婷，趙雁林，劉家云，等. 結(jié)核性腦膜炎臨床分離株基因型和耐藥表型的特征分析.中國(guó)防癆雜志，2013，35(9):660-667.

[11] 中國(guó)防癆協(xié)會(huì)基礎(chǔ)專(zhuān)業(yè)委員會(huì)．結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程．北京：中國(guó)教育文化出版社，2006:54,56-57.

[12] Falzon D, Jaramillo E, Schünemann HJ, et al. WHO guidelines for the programmatic management of drug-resistant tuberculosis: 2011 update. Eur Respir J, 2011, 38(3):516-528.

[13] Kontos F, Maniati M, Costopoulos C, et al. Evaluation of the fully automated Bactec MGIT 960 system for the susceptibility testing ofMycobacteriumtuberculosisto first-line drugs: a multicenter study. J Microbiol Methods, 2004, 56(2): 291-294.

[14] Pang Y, Zhou Y, Zhao B, et al. Spoligotyping and drug resistance analysis ofMycobacteriumtuberculosisstrains from national survey in China. PLoS One, 2012, 7(3): e32976.

[15] Angra PK, Taylor TH, Iademarco MF, et al. Performance of tuberculosis drug susceptibility testing in U.S. laboratories from 1994 to 2008. J Clin Microbiol, 2012, 50(4): 1233-1239.

[16] Hong L, Jiang W, Pan H, et al. Brain regional pharmacokinetics of p-aminosalicylic acid and its N-acetylated metabolite: effectiveness in chelating brain manganese. Drug Metab Dispos, 2011, 39(10): 1904-1909.

[17] Di Paolo A, Gori G, Tascini C, et al. Clinical pharmacokine-tics of antibacterials in cerebrospinal fluid. Clin Pharmacokinet, 2013, 52(7): 511-542.

[18] Nuermberger E, Grosset J. Pharmacokinetic and pharmacodynamic issues in the treatment of mycobacterial infections. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2004, 23(4): 243-255.

[19] Rubrichi S, Quaglini S. Summary of Product Characteristics content extraction for a safe drugs usage. J Biomed Inform, 2012, 45(2): 231-239.

[20] Garcia-Prats AJ, Rose PC, Hesseling AC, et al. Linezolid for the treatment of drug-resistant tuberculosis in children: a review and recommendations. Tuberculosis(Edinb), 2014, 94(2)：93-104.

[21] Cholo MC, Steel HC, Fourie PB, et al. Clofazimine: current status and future prospects. J Antimicrob Chemother, 2012, 67(2): 290-298.

[22] Han M, Jun SH, Lee JH, et al. Method for simultaneous analysis of nine second-line anti-tuberculosis drugs using UPLC-MS/MS. J Antimicrob Chemother, 2013, 68(9): 2066-2073.

[23] Fish DN, Abraham E. Pharmacokinetics of a clarithromycin suspension administered via nasogastric tube to seriously ill patients. Antimicrob Agents Chemother, 1999, 43(5): 1277-1280.

[24] Shandil RK, Jayaram R, Kaur P, et al. Moxifloxacin, ofloxacin, sparfloxacin, and ciprofloxacin againstMycobacteriumtuberculosis: evaluation of in vitro and pharmacodynamic indices that best predict in vivo efficacy. Antimicrob Agents Chemo-ther, 2007, 51(2): 576-582.

[25] Hall L, Jude KP, Clark SL, et al. Evaluation of the Sensititre MycoTB plate for susceptibility testing of theMycobacteriumtuberculosiscomplex against first-and second-line agents. J Clin Microbiol, 2012, 50(11): 3732-3734.

[26] Wang JY, Lee LN, Lai HC, et al. Fluoroquinolone resistance inMycobacteriumtuberculosisisolates: associated genetic mutations and relationship to antimicrobial exposure. J Antimicrob Chemother, 2007, 59(5): 860-865.

[27] Thwaites GE. Advances in the diagnosis and treatment of tuberculous meningitis. Curr Opin Neurol, 2013, 26(3): 295-300.

[28] Pardridge WM. Drug transport across the blood-brain barrier. J Cereb Blood Flow Metab, 2012, 32(11): 1959-1972.

[29] Be NA, Lamichhane G, Grosset J, et al. Murine model to study the invasion and survival ofMycobacteriumtuberculosisin the central nervous system. J Infect Dis, 2008, 198(10): 1520-1528.

[30] Thwaites GE, Tran TH. Tuberculous meningitis: many questions, too few answers. Lancet Neurol, 2005, 4(3): 160-170.

[31] 桂徐蔚，肖和平，胡忠義，等. 氯法齊明對(duì)不同耐藥類(lèi)型結(jié)核分枝桿菌的體外抑菌活性研究. 中華結(jié)核和呼吸雜志，2011,34(8)：579-581.

[32] Chaisson RE,Nuermberger EL.Confronting multidrug-resis-tant tuberculosis. N Engl J Med,2012,366(23):2223-2224.

(本文編輯：薛愛(ài)華)

Studies on the phenotypically resistant characteristics and therapeutic effect of antitubercular drugs onM.tuberculosisclinical isolates from the patients with tuberculous meningitis

WANGTing*,ZHAOYan-lin,PANGYu,FENGGuo-dong,SONGYuan-yuan,OUXi-chao,PENGJin-xiang,ZHAOGang,ZHANLi-ping.

*DepartmentofInternalMedicine,Yan’anHospitalAffiliatedtoKunmingMedicalUniversity,Kunming650200,China

ZHANLi-ping,Email: 2510765864@qq.com；ZHAOGang,Email:zhaogang@fmmu.edu.cn

Objective To study the phenotypically resistant characteristics and therapeutic effect of antitubercular drugs onM.tuberculosisclinical isolates from the patients with tuberculous meningitis (TBM). Methods Five hundred cerebrospinal fluid (CSF) from suspected patients with tuberculous miningitis were cultured with Bactec MGIT 960. Twenty-five strains were isotated, and then identified the species by 16S rRNA gene sequencing, detected 14 anti-tuberculous drug susceptibility by Bactec MGIT 960 and 12 anti-tuberculous drug susceptibility by the proportional method of conventional solid culture. The minimal inhibitory concentrations (MICs) of 16 anti-tuberculous drugs on these isolates were determined. The bacterial sterilization rate was determined by calculating the ratio of maximal plasma concentration (Cmax)/MIC to evaluated thetherapeutic effect of drugs onM.tuberculosis. Results Of 25M.tuberculosisisolates, 13 were resistant to any anti-tuberculous drugs, 3 were multidrug-resistant. The ratios of Cmax/MIC for rifampicin, moxifloxacin, levofloxacin, clofazimine, and p-aminosalicylic acid were 19.880, 63.333, 19.149, 75.000, and 50.855, respectively. Conclusion Most drug-resistant isolates from TBM patients were phenotypically resistant to isoniazid or rifampicin, the least isolates were phenotypically resistant to quinolone. The Cmax/MIC values of moxifloxacin, clofazimine, p-aminosalicylic acid, levofloxacin and rifampicin were higher, suggesting that the combination of high doses of rifampicin and fluoroquinolones might improve the therapeutic effect of TBM. P-aminosalicylic acid and clofazimine might play an better role in antituberculous treatment of TBM.

Tuberculosis, meningeal/drug therapy； Phenotype； Microbial sensitivity tests； Treatment outcome

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.04.006

“十二五”國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)(2012ZX10003004)

650051 昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(王婷、戰(zhàn)麗萍)；第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科[王婷(研究生)、馮國(guó)棟、趙鋼]；中國(guó)疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病預(yù)防控制中心 國(guó)家參比實(shí)驗(yàn)室(趙雁林、逄宇、宋媛媛、歐喜超)；解放軍第四七八醫(yī)院空勤科(彭晉湘)

注：王婷和趙雁林為并列第一作者

戰(zhàn)麗萍，Email： 2510765864@qq.com；趙鋼，Email： zhaogang@fmmu.edu.cn

2015-02-16)