淡水浮游植物計(jì)數(shù)與定量方法*

錢奎梅，劉 霞，陳宇煒

(中國科學(xué)院南京地理與湖泊研究所湖泊與環(huán)境國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210008)

淡水浮游植物計(jì)數(shù)與定量方法*

錢奎梅，劉 霞，陳宇煒**

(中國科學(xué)院南京地理與湖泊研究所湖泊與環(huán)境國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210008)

顯微鏡計(jì)數(shù)法是淡水浮游植物計(jì)數(shù)最常用的經(jīng)典方法，是浮游植物生物量測(cè)定的基本方法，也是衡量其他測(cè)定方法準(zhǔn)確性的依據(jù).隨著科技的發(fā)展，可見分光光度法、熒光分光光度法、流式細(xì)胞顯微鏡計(jì)數(shù)法、庫爾特計(jì)數(shù)法等新型細(xì)胞計(jì)數(shù)法相繼問世.對(duì)各種方法的特點(diǎn)進(jìn)行比較，結(jié)果表明：光密度法、流式攝像機(jī)計(jì)數(shù)法、流式細(xì)胞儀法、葉綠素a法等僅能夠分析測(cè)定浮游植物生物量，而顯微鏡法是測(cè)量浮游植物粒徑的經(jīng)典方法，不僅可以測(cè)定浮游植物生物量，還可以進(jìn)行浮游植物的種類及群落結(jié)構(gòu)分析.以上這些方法都可以用于浮游植物的計(jì)數(shù)與定量，可以根據(jù)不同的需求來選擇最佳的浮游植物計(jì)數(shù)方法，如分析方便性、樣本處理速率、樣本大小等.但顯微鏡計(jì)數(shù)法在淡水生態(tài)學(xué)中具有不可替代的作用.

浮游植物；細(xì)胞計(jì)數(shù)；生物量；顯微鏡；定量

浮游植物是一個(gè)生態(tài)學(xué)概念，是指在水體中營浮游生活的微小植物，通常浮游植物就是指浮游藻類，包括藍(lán)藻門、綠藻門、硅藻門、金藻門、黃藻門、甲藻門、隱藻門和裸藻門8個(gè)門類的浮游種類，已知全世界藻類植物約有40000種，其中淡水藻類有25000種左右，而中國已發(fā)現(xiàn)的淡水藻類約9000種[1].浮游植物是水域生態(tài)系統(tǒng)的重要初級(jí)生產(chǎn)者，其種類組成和數(shù)量分布的生態(tài)學(xué)特征是水生生態(tài)系統(tǒng)的重要研究內(nèi)容[2].由于浮游植物對(duì)其所處生境的水質(zhì)狀況反應(yīng)靈敏，能夠?qū)λw營養(yǎng)狀態(tài)的變化迅速做出響應(yīng)[3]，其群落結(jié)構(gòu)能夠真實(shí)地反映水質(zhì)狀況，是評(píng)價(jià)水體健康狀況的重要指示生物[4].

浮游植物現(xiàn)存量是指某一瞬間單位水體中所存在的浮游植物的總量[5].這個(gè)量用數(shù)量表示稱為豐度，用重量表示稱為生物量.由于不同水體、不同種類的藻類在個(gè)體上差異較大(這種差異有時(shí)可達(dá)數(shù)百、數(shù)千倍)，有些在豐度上較高的種類由于個(gè)體微小，生物量可能低于豐度小而個(gè)體大的種類，所以用細(xì)胞豐度來表示生物量會(huì)過高估計(jì)細(xì)胞體積小的物種的貢獻(xiàn)，過低估計(jì)細(xì)胞體積大的物種的貢獻(xiàn)，因此，僅用豐度就很難全面評(píng)價(jià)不同水體浮游植物的真實(shí)情況，而且細(xì)胞豐度對(duì)于分析浮游植物現(xiàn)存量在食物鏈和營養(yǎng)對(duì)策等方面所起的作用也是有限的，應(yīng)該以測(cè)算生物量為目標(biāo).

浮游植物生物量還可以通過測(cè)定葉綠素、ATP、碳含量、氮含量等方法(如化學(xué)分類方法、基于光譜的檢測(cè)方法以及分子生物學(xué)鑒定與檢測(cè)技術(shù)等)獲得[6-7]，也可通過間接從細(xì)胞體積轉(zhuǎn)化為生物量而獲得.除細(xì)胞體積轉(zhuǎn)化外，其它方法可從不同角度獲得較精確的浮游植物現(xiàn)存量，但它們無法反映浮游植物的群落結(jié)構(gòu)和不同種及同種不同大小的浮游植物生物量的貢獻(xiàn)，從而無法解釋現(xiàn)存量時(shí)空變化的內(nèi)在原因.只有通過測(cè)量浮游植物細(xì)胞個(gè)體大小獲得細(xì)胞體積轉(zhuǎn)化后的生物量，才能既較準(zhǔn)確地反映浮游植物現(xiàn)存量，又能清楚地了解浮游植物的群落結(jié)構(gòu)、種類組成、優(yōu)勢(shì)種、種類交替及不同大小細(xì)胞對(duì)浮游植物生物量的貢獻(xiàn).

隨著科技的發(fā)展，浮游植物細(xì)胞定量計(jì)數(shù)方法除傳統(tǒng)的顯微鏡計(jì)數(shù)[5]外，可見分光光度法、熒光分光光度法、流式細(xì)胞顯微鏡計(jì)數(shù)法[8-10]、庫爾特計(jì)數(shù)法[11]等相繼問世，這些方法很多都源于海洋浮游植物分析，可在淡水中推廣應(yīng)用，因此，本文對(duì)這些方法進(jìn)行綜述.

1 浮游植物分析方法

1.1 基于形態(tài)學(xué)特征的分析方法

運(yùn)用光學(xué)顯微鏡對(duì)浮游植物進(jìn)行定性、定量分析是當(dāng)前鑒別和計(jì)量浮游植物最直接和可信的方法，是浮游植物分類鑒定的基礎(chǔ)[5,12]，也是檢驗(yàn)其他測(cè)定方法有效性的依據(jù).1931年Uterm?hl在結(jié)合Volk的靜置沉淀法與Kolkwitz的計(jì)數(shù)框基礎(chǔ)上發(fā)明了Uterm?hl計(jì)數(shù)法[13].1958年，Uterm?hl又規(guī)范了計(jì)數(shù)框的觀測(cè)面積[14].自1978年聯(lián)合國教科文組織(UNESCO)將Uterm?hl計(jì)數(shù)法編入《浮游植物手冊(cè)》[15]以來，它在世界范圍內(nèi)被接受并普遍使用，是目前國際上浮游植物調(diào)查研究最通用的方法之一.為減少濃縮時(shí)間，Paxinos等[16]曾改進(jìn)Uterm?hl的靜置沉降濃縮為壓濾濃縮，其計(jì)數(shù)結(jié)果與傳統(tǒng)的Uterm?hl沉降濃縮結(jié)果具有很好的相關(guān)性(R2=0.98)；水樣中不必加入魯哥試劑進(jìn)行固定，有利于被檢測(cè)的活性生物保持活性；濃縮過程只需2h左右.為縮短濃縮時(shí)間，王瓚等[17]采用濾膜過濾方法濃縮收集水體中的藻細(xì)胞，經(jīng)超聲振蕩后在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)，與傳統(tǒng)方法的對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法水樣用量少、操作方便、準(zhǔn)確快捷.膜過濾的缺點(diǎn)是細(xì)胞不能用明場(chǎng)照明，因?yàn)槟み^濾法會(huì)扭曲圖像，并且很難識(shí)別不同物種和門類.因此，該方法的樣本處理速率取決于過濾的體積、樣品過濾的比例以及樣品中細(xì)胞濃度和雜質(zhì)的量等[18].

由于藻類無法直接稱重，而藻類細(xì)胞形態(tài)較為規(guī)則，且細(xì)胞比重接近于1，故可用形態(tài)相似的幾何體積直接換算為生物量(濕重)[19-21]，即生物量為浮游植物的豐度乘以各自的平均體積，單位為mg/L.單細(xì)胞的生物量主要根據(jù)浮游植物個(gè)體形狀測(cè)量分析.因浮游植物體積在不同地區(qū)、不同季節(jié)都有較大變化，最好對(duì)其進(jìn)行直接測(cè)量，對(duì)于數(shù)量多或體積大的種類，特別是優(yōu)勢(shì)種，更應(yīng)實(shí)際測(cè)量.測(cè)量時(shí)應(yīng)根據(jù)藻類體型，按最近似的幾何圖形測(cè)量其長度、寬度、直徑等，分別求得平均值，然后按求積公式計(jì)算出體積.有的種類形狀較特殊，可分解為幾部分，分別按相似幾何圖形求算相加.顯微鏡法耗時(shí)較長，對(duì)專業(yè)知識(shí)要求較高，載玻片和蓋玻片的間距使細(xì)胞呈現(xiàn)出多種形態(tài)，水樣中的非藻顆粒物也可對(duì)樣品分析造成干擾[22]，同時(shí)，顯微鏡放大倍數(shù)的局限可造成微型及超微型浮游植物的漏檢.但由于顯微鏡計(jì)數(shù)法觀測(cè)面積大、準(zhǔn)確度高、變異系數(shù)小，能較為全面地反映樣品的種類分布情況，目前仍然為國際上浮游植物計(jì)數(shù)最通用的方法.該方法適用于濃度低、種類多的樣品[23].

血球計(jì)數(shù)法[24]雖然方便、快捷，但是如果計(jì)數(shù)室內(nèi)有雜物或未洗凈的微生物時(shí)，會(huì)影響觀察和計(jì)數(shù)結(jié)果.因此，使用血球計(jì)數(shù)器之后必須將其清洗干凈.該方法適合于實(shí)驗(yàn)室純種培養(yǎng)的高濃度樣品.庫爾特計(jì)數(shù)[11]是通過測(cè)量細(xì)胞體積和個(gè)數(shù)，得出各顆粒的大小，統(tǒng)計(jì)出粒度的分布，其重現(xiàn)分析功能可分析到單個(gè)脈沖信號(hào)，靈敏度較高，該方法適合于實(shí)驗(yàn)室純種培養(yǎng)的樣品.

基于形態(tài)學(xué)特征對(duì)藻種進(jìn)行鑒定的另一個(gè)重要研究方向就是利用計(jì)算機(jī)輔助完成的圖像分析和識(shí)別技術(shù).目前廣泛使用的流式攝像機(jī)(flow cytometer and microscope，F(xiàn)lowCAM)綜合了顯微鏡法、葉綠素?zé)晒夥ê土魇郊?xì)胞儀法的功能，能夠給出每一種浮游植物的尺寸和圖像；可以對(duì)浮游植物自動(dòng)計(jì)數(shù)，并對(duì)其圖像進(jìn)行處理，經(jīng)圖庫比對(duì)后對(duì)浮游植物進(jìn)行分類測(cè)量和識(shí)別；可以根據(jù)浮游植物形態(tài)及光學(xué)特性，自動(dòng)識(shí)別部分特征性浮游植物，能用于大量樣品的監(jiān)測(cè)分析；可以連續(xù)24h自動(dòng)在線監(jiān)測(cè)或巡航監(jiān)測(cè)；非常適合檢測(cè)基于天然葉綠素?zé)晒獾母∮沃参飿悠?，具有快速識(shí)別和計(jì)數(shù)的特點(diǎn)[25-29].FlowCAM為藻類分類鑒定提供了良好的圖像及數(shù)據(jù)，可進(jìn)行種類鑒定的藻類直徑應(yīng)不小于5μm，F(xiàn)lowCAM要求樣品濃度不能太低，否則儀器進(jìn)樣時(shí)可能會(huì)因藻類混合不勻而導(dǎo)致較大的誤差[30-31].由于浮游植物種類繁多，不同種類的藻細(xì)胞可能在形態(tài)結(jié)構(gòu)上具有很大的相似性，同一種類在不同生長時(shí)期或以不同視角所捕獲的照片在形態(tài)學(xué)上也可能有較大的差異，使鑒別的準(zhǔn)確度大大降低.此外，技術(shù)上的限制可能使獲取的照片分辨率較低，增大了準(zhǔn)確識(shí)別的難度.目前真正實(shí)現(xiàn)自動(dòng)識(shí)別的系統(tǒng)并不多，可識(shí)別的物種也比較少[8-10，32].

1.2 基于色素的化學(xué)分析方法

基于色素的化學(xué)分析方法是利用浮游植物不同類群間色素組成和含量的不同來確定群落組成和豐度.其中，優(yōu)勢(shì)比較明顯的是高效液相色譜(HPLC)技術(shù)[33]，一次操作可以分離50多種色素[34].二極管陣列檢測(cè)器的使用使色素檢測(cè)更加準(zhǔn)確、便捷[35].基于HPLC的光合色素分析技術(shù)能夠有效地進(jìn)行大量的現(xiàn)場(chǎng)樣品分析，即使在樣品處理中存在過濾產(chǎn)生損失或處理過程導(dǎo)致樣品破壞的情況，但從HPLC的光合色素產(chǎn)生信號(hào)峰的差異仍然能辨析出其類群組成.在野外樣品檢測(cè)方面，原來因?yàn)轱@微計(jì)數(shù)中樣品過濾或預(yù)處理所造成的種類缺失，現(xiàn)在通過HPLC色素峰也能清楚地辨別出來[36].此外，HPLC方法還使每個(gè)航次分析幾百個(gè)樣品成為可能[37].目前，該方法僅局限在綱一級(jí)水平，如果要進(jìn)行種屬水平的鑒定，還需要尋找新的特征色素或色素組合[38-39].某些形態(tài)上相似的種類，可能在光合色素等生物標(biāo)志物上存在差異，從而可以有效地鑒定[40].應(yīng)用光合色素作為分類技術(shù)手段的缺點(diǎn)是尚不能完全實(shí)現(xiàn)屬和種之間的準(zhǔn)確分類.此外，環(huán)境變化以及不同的細(xì)胞生長周期也會(huì)導(dǎo)致浮游植物的光合色素含量發(fā)生一些變化，從而導(dǎo)致分類的結(jié)果受到影響[41].所以，應(yīng)用該方法對(duì)浮游植物進(jìn)行定性和定量分析還很難實(shí)現(xiàn).

1.3 基于光學(xué)特性的分析方法

借助光學(xué)特性對(duì)浮游植物進(jìn)行檢測(cè)的方法主要有活體熒光分析技術(shù)[42]以及基于現(xiàn)場(chǎng)表觀光譜和固有光譜的浮游植物檢測(cè)技術(shù)[43-45].熒光測(cè)定技術(shù)不需破碎細(xì)胞，不傷害生物體，因此通過研究葉綠素?zé)晒鈦黹g接研究光合作用的變化是一種簡便、快捷、可靠的方法[46-49].現(xiàn)場(chǎng)熒光分析法主要集中于海水樣品和藍(lán)藻監(jiān)測(cè)中對(duì)光合色素的檢測(cè)[47-50].可以區(qū)分浮游植物種類的便攜式激光誘導(dǎo)熒光系統(tǒng)已經(jīng)研制成功[51].此外，由于不同種類浮游植物光合色素含量和組成有一定差別，因此還可以根據(jù)吸收光譜圖的差異區(qū)分不同植物類群[52].現(xiàn)場(chǎng)熒光檢測(cè)法的優(yōu)勢(shì)在于它可以對(duì)水下燈現(xiàn)場(chǎng)環(huán)境進(jìn)行快速、連續(xù)、大面積測(cè)定，但不能實(shí)現(xiàn)對(duì)浮游植物的分類.借助現(xiàn)場(chǎng)表觀光譜和固有(反射、散射、吸收)光譜的浮游植物檢測(cè)方法[53-54]簡單且容易實(shí)現(xiàn)，但是探測(cè)精度受環(huán)境條件限制，對(duì)浮游植物的識(shí)別也比較粗糙.研究認(rèn)為與藻細(xì)胞粒徑、色素結(jié)構(gòu)有關(guān)的色素綜合效應(yīng)是造成浮游植物比吸收系數(shù)變化的重要原因，同時(shí)也影響著浮游植物吸收系數(shù)的光譜形狀[55].因此，基于水色遙感的浮游植物總生物量反演[56-62]能實(shí)現(xiàn)對(duì)水域的大面積監(jiān)測(cè)，提供浮游植物總量信息，但不能對(duì)種類組成進(jìn)行鑒定.葉綠素a濃度測(cè)定法能夠確定細(xì)胞生物量，準(zhǔn)確度高，但操作較復(fù)雜、耗時(shí)長.不同種類浮游植物的葉綠素a相對(duì)濃度隨浮游植物群落的變化而變化，同時(shí)在不同環(huán)境條件下的葉綠素a相對(duì)濃度也有所不同[63].在純種藻培養(yǎng)中，葉綠素a與細(xì)胞濃度的比率隨細(xì)胞生理學(xué)和藻類生長階段而變化[64].因此，葉綠素a濃度只是浮游植物濃度的近似值.

1.4 基于免疫分析的檢測(cè)技術(shù)

基于免疫學(xué)分析的檢測(cè)方法已有幾十年的歷史.早期人們只是將其作為一種常規(guī)分類學(xué)手段的補(bǔ)充方法，能準(zhǔn)確識(shí)別的種類也不多.近20年來，隨著科學(xué)技術(shù)的突飛猛進(jìn)，基于免疫分析的檢測(cè)技術(shù)也有了長足發(fā)展.應(yīng)用抗體探針的免疫測(cè)定主要有免疫熒光分析[65]、酶聯(lián)免疫吸附分析(enzyme-linked immune-sorbent assay, ELISA)[66]及流式細(xì)胞免疫分析[67]等.免疫分析方法無需對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，設(shè)備普及度高，易實(shí)現(xiàn)商品化.但它需要制備高度專一的特異性抗體，尤其在對(duì)同一種屬進(jìn)行區(qū)分的時(shí)候需要制備單克隆抗體，但是傳統(tǒng)的制備單克隆抗體的方法——雜交瘤細(xì)胞技術(shù)的費(fèi)用較高且操作繁瑣，對(duì)特異性抗體的研發(fā)造成了一定的限制.目前，制備特異性強(qiáng)的多克隆抗體已成為可行的替代方法.目前已有關(guān)于藻類多抗制備和特異性鑒定的報(bào)道，并已成功制備出多種高特異性的多克隆抗體.將多克隆抗體技術(shù)與適當(dāng)?shù)拿庖邔W(xué)檢測(cè)方法相結(jié)合可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)藻的定性和定量分析[68-69].

1.5 基于核酸分析的檢測(cè)技術(shù)

目前基于核酸的浮游植物定性定量分析方法主要有功能基因研究、分子指紋分析技術(shù)、分子探針技術(shù)等.功能基因的研究主要包括核糖體基因(ribosomal RNA gene, rDNA)、細(xì)胞色素b基因(Cytoclme b，cytb)、增殖細(xì)胞核抗原基因(PCNA)、Hsp90(熱休克蛋白)基因、質(zhì)體rbcL(二磷酸核酮糖羧化酶大亞基基因)等的研究.其中，rDNA憑借其為細(xì)胞所共有、功能同源且最為古老的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，成為目前應(yīng)用最廣泛的分子指標(biāo)[70-72].雖然rDNA序列分析是對(duì)浮游植物定性、定量檢測(cè)的一種較為可靠的方法，但其耗時(shí)費(fèi)力，不太適合常規(guī)測(cè)定，而且，用于序列比對(duì)的美國國立生物技術(shù)研究中心數(shù)據(jù)庫(national center for biotechnology information，NCBI)里收錄的序列在研究者上傳后并未經(jīng)過嚴(yán)格的審核和驗(yàn)證，其準(zhǔn)確性無法得到保證.同時(shí)，對(duì)某一種類來說序列信息往往呈片段化，缺乏完整的rDNA基因序列信息，這就給序列比對(duì)的準(zhǔn)確度造成了一定的影響[70-72].

基于DNA多態(tài)性的分子指紋分析技術(shù)方法簡單，重現(xiàn)性好，無需測(cè)序，在藻類的系統(tǒng)比較和分類鑒定中起著重要作用.但是，藻類基因組數(shù)據(jù)庫的不完整性限制了這些方法的應(yīng)用[73].

由于分子探針技術(shù)具有專一性強(qiáng)、準(zhǔn)確、快速等特點(diǎn)，在分子生物學(xué)研究中得到了廣泛應(yīng)用[74-75].近年來，熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH)技術(shù)憑借其分析速度快和靈敏性高等優(yōu)點(diǎn)在藻類檢測(cè)和生態(tài)學(xué)研究等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[76].FISH的優(yōu)勢(shì)在于能準(zhǔn)確識(shí)別出樣品中的目標(biāo)生物，還能對(duì)群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究.同時(shí)，樣品的全細(xì)胞形態(tài)為驗(yàn)證探針檢測(cè)結(jié)果提供了一個(gè)重要補(bǔ)充.不過，該方法也存在一定缺陷，如對(duì)鏈狀形式聚生的細(xì)胞(擬菱形藻Pseudonitzschia、骨條藻Skeletonema、赤潮異彎藻Heterosigmaakashiwo等)以及在保存時(shí)容易聚集的細(xì)胞鑒定、計(jì)數(shù)較難，對(duì)裸甲藻等一些甲板不明顯微藻全細(xì)胞形態(tài)的固定和保存也有一定難度，還有其它一些因素也可能影響著熒光原位雜交的效果，如固定方法、脫色條件、低溫保存以及RNA降解等[77-78].

實(shí)時(shí)熒光PCR不僅具有普通PCR的高靈敏度，而且應(yīng)用了熒光探針，既增加了檢測(cè)特異性，又可以通過光電傳導(dǎo)系統(tǒng)直接探測(cè)PCR過程中熒光信號(hào)的變化，因此還具有DNA雜交的高特異性和光譜技術(shù)的高精確性.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)核酸模板的定量，而且具有靈敏度和特異性高、能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)、自動(dòng)化程度高、無污染、實(shí)時(shí)和準(zhǔn)確等特點(diǎn).因此，實(shí)時(shí)熒光PCR也被運(yùn)用到藻類學(xué)研究中[79-80].但在浮游藻類定性定量檢測(cè)方面，該技術(shù)尚處于起步階段，其最大的限制在于很難獲得高純度的DNA樣品.

夾心雜交技術(shù)無需進(jìn)行樣品純化、恒溫雜交、操作簡單.不過，該技術(shù)存在的致命缺陷是，它直接檢測(cè)極易降解的RNA，而夾心雜交中包含抗原抗體反應(yīng)和許多洗滌操作，增加了RNA降解的機(jī)會(huì)，使分析結(jié)果的準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性不理想.此外，反應(yīng)中缺少溫度控制也給特異性探針的設(shè)計(jì)帶來很大難度.為了克服夾心雜交技術(shù)的缺點(diǎn)，有研究者[81-82]將酶保護(hù)分析方法與夾心雜交方法相結(jié)合，采用雙特異分子探針技術(shù)并將其應(yīng)用于浮游植物的檢測(cè)，但也只能對(duì)樣品中十余種藻類進(jìn)行定性、定量分析.

2 淡水浮游植物計(jì)數(shù)及定量方法比較

能夠分析計(jì)算浮游植物總生物量的方法有顯微鏡法、光密度法、FlowCAM計(jì)數(shù)法、流式細(xì)胞儀法、葉綠素a法等(表1).目前很多研究者[83-88]探討了不同計(jì)數(shù)方法衡量某一種類微藻生物量的可行性，結(jié)果表明，分光光度法和熒光法是相對(duì)簡便、快捷、準(zhǔn)確的分析方法.然而，由于不同種類微藻細(xì)胞個(gè)體大小不同，運(yùn)動(dòng)能力不同，而且細(xì)胞生長過程中可能存在著某些物質(zhì)濃度(如葉綠素、熒光物質(zhì)等)的變化，而上述研究只針對(duì)特定種類取某一生長期培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋測(cè)定，因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果適用范圍存在一定的局限性.

浮游植物計(jì)數(shù)的方法中分光光度法和庫爾特計(jì)數(shù)法操作簡單、耗時(shí)短，測(cè)定結(jié)果重現(xiàn)性好、誤差小，測(cè)定時(shí)可以不破壞樣品，特別適于連續(xù)測(cè)定，是比較簡便、快捷、有效的測(cè)定方法.但分光光度法計(jì)數(shù)細(xì)胞若采用葉綠素的最大吸收波長，其測(cè)定容易受細(xì)胞生長和生理狀態(tài)的影響，而采用濁度比色又受細(xì)胞生長后期細(xì)胞碎片和有機(jī)顆粒等非細(xì)胞因素的影響[89].FlowCAM計(jì)數(shù)法雖然準(zhǔn)確，號(hào)稱“小流式細(xì)胞計(jì)數(shù)”，但操作比較繁瑣、耗時(shí)長，而且數(shù)據(jù)后期處理需經(jīng)過2次校正.儀器計(jì)數(shù)要求細(xì)胞條件較高，最好是處在指數(shù)生長階段中的細(xì)胞，而人為計(jì)數(shù)(如顯微鏡和FlowCAM)能分辨細(xì)胞生長后期的細(xì)胞碎片甚至死細(xì)胞.庫爾特計(jì)數(shù)采用小孔電阻原理，測(cè)量顆粒的大小和數(shù)量，統(tǒng)計(jì)出粒度的分布，其重現(xiàn)分析功能可分析到單個(gè)脈沖信號(hào)，同時(shí)分析不同類型細(xì)胞相當(dāng)方便；其靈敏度較高，但線性范圍較小[90].因此，當(dāng)藻密度較小時(shí)或?qū)嶒?yàn)室純種培養(yǎng)、濃度高、種類單一時(shí)，采用庫爾特法效果較好；當(dāng)藻密度較大時(shí)，可采用可見分光光度法[89].庫爾特計(jì)數(shù)結(jié)果一般會(huì)高于顯微鏡計(jì)數(shù)結(jié)果，因其會(huì)計(jì)數(shù)一些非細(xì)胞形態(tài)的顆粒，但校正后準(zhǔn)確度仍然較高.在顯微鏡計(jì)數(shù)以外的計(jì)數(shù)方法中，庫爾特計(jì)數(shù)法較好，其次為分光光度計(jì)數(shù)法和FlowCAM計(jì)數(shù)法[88].庫爾特法是一種相對(duì)簡便、快捷和可靠的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法.流式細(xì)胞儀法使單樣品操作時(shí)間較短，能靈敏檢測(cè)細(xì)胞死/活狀態(tài)，測(cè)定梯度配比的熱處理致死細(xì)胞的結(jié)果與配比值吻合良好，該方法用于紫外消毒處理水樣中的藻細(xì)胞計(jì)數(shù)及死/活狀態(tài)分析靈敏有效.顯微鏡計(jì)數(shù)法不僅能較為全面地反映樣品的種類分布情況，而且準(zhǔn)確度高、變異系數(shù)小，目前仍然為國際上浮游植物調(diào)查研究最通用的方法.

表1 各種浮游植物計(jì)數(shù)和定量分析方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較

浮游植物種類及群落結(jié)構(gòu)分析對(duì)于深入研究淡水浮游植物生理特性、群落結(jié)構(gòu)與功能、在淡水生態(tài)系統(tǒng)中的作用等都具有重要的科學(xué)意義.目前顯微鏡計(jì)數(shù)法[91-92]、庫爾特計(jì)數(shù)法[11]、流式細(xì)胞儀法[93-94]等均可測(cè)量水體浮游植物粒徑.庫爾特計(jì)數(shù)法雖然簡單快速，可以方便地測(cè)量其粒徑分布，但不能進(jìn)行種類鑒定.顯微鏡計(jì)數(shù)法是測(cè)量浮游植物粒徑的經(jīng)典方法，具有直觀、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，并可進(jìn)行種類鑒定[95].能夠鑒定浮游植物種類的藻類計(jì)數(shù)法有顯微鏡法、PCR法，而PCR法在浮游藻定性、定量檢測(cè)方面尚處于起步階段，其最大的限制在于很難獲得高純度的DNA樣品[96].

選擇適當(dāng)?shù)母∮沃参镉?jì)數(shù)方法對(duì)浮游植物的相關(guān)研究十分重要.以上這些方法都可以用于浮游植物的計(jì)數(shù)與定量，可以根據(jù)不同的需求來選擇最佳計(jì)數(shù)方法，如樣本大小、便于分析、樣本處理率等.顯微鏡細(xì)胞定量計(jì)數(shù)法作為浮游植物定量和計(jì)數(shù)最經(jīng)典的方法，是衡量浮游植物定量、計(jì)數(shù)及其它方法是否準(zhǔn)確的標(biāo)準(zhǔn)，在淡水生態(tài)學(xué)中具有不可替代的作用.

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A review on methods of cell enumeration and quantification of freshwater phytoplankton

QIAN Kuimei, LIU Xia & CHEN Yuwei

(StateKeyLaboratoryofLakeScienceandEnvironment，NanjingInstituteofGeographyandLimnology,ChineseAcademyofSciences,Nanjing210008,P.R.China)

Phytoplankton cell enumeration made under a light microscope is a basic and classic method for freshwater phytoplankton cell counting and biomass calculation, and also a basis for testing the accuracy of other methods. With the development of technology, some methods on phytoplankton cell enumeration and biomass evaluation, such as visible spectrophotometry, fluorescence spectroscopy, flow microscope counting method, coulter cell counting method, have been developed. Comparing the characteristics of these methods, the results show that the optical density method, FlowCAM counting, flow cytometry, and chlorophyll-a determination method can only analyze phytoplankton biomass. As a classical method to measure the particle size of phytoplankton cell, phytoplankton analysis under a light microscope can analyze not only phytoplankton biomass, but also phytoplankton species and community structure. Since all the methods were generally appropriate for freshwater phytoplankton biomass analysis, ancillary considerations(e.g., easiness of analysis, sample processing rate, sample size, etc.) become critical factors for the determination of optimal phytoplankton counting method. The study indicates that cell enumeration and biomass calculation under a light microscope has an irreplaceable role in phytoplankton biomass evaluation in modern ecology.

Phytoplankton; cell enumeration; biomass, microscope； quantification

*江蘇省博士后科研資助計(jì)劃項(xiàng)目(1401158C)資助.2014-11-20收稿；2015-02-10收修改稿.錢奎梅(1982～)，女，博士；E-mail：qiankuimei@163.com.

J.LakeSci.(湖泊科學(xué))， 2015， 27(5)： 767-775

DOI 10.18307/2015.0502

?2015 byJournalofLakeSciences

**通信作者；E-mail：ywchen@niglas.ac.cn.