太湖梅梁灣藻藍蛋白轉錄間隔區(qū)基因和偽空胞基因表達及其影響因子*

張金麗，虞 龍，GE Xiuchun，李玉燕，于 洋

(1：南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，南京211816)

(2：中國科學院南京地理與湖泊研究所湖泊與環(huán)境國家重點實驗室，南京210008)

(3：Virginia Commonwealth University， Richmond 23284)

太湖梅梁灣藻藍蛋白轉錄間隔區(qū)基因和偽空胞基因表達及其影響因子*

張金麗1，2，虞 龍1，GE Xiuchun3，李玉燕1，于 洋2**

(1：南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，南京211816)

(2：中國科學院南京地理與湖泊研究所湖泊與環(huán)境國家重點實驗室，南京210008)

(3：Virginia Commonwealth University， Richmond 23284)

以室內銅綠微囊藻7806(Microcystisaeruginosa7806)為對照，運用反轉錄定量PCR技術研究太湖梅梁灣水體藍藻藻藍蛋白轉錄間隔區(qū)基因(PC-IGS)和偽空胞基因(gvpC)在2013年1月至2014年1月的相對表達量，并分析它們與環(huán)境因子的關系. 結果表明， PC-IGS相對表達量在2013年1—5月逐漸上升，并在5月達到最大值；gvpC相對表達量從2013年1月開始持續(xù)上升并在3月達到最大值；gvpC的表達早于PC-IGS. 相關分析表明，PC-IGS的相對表達量與硝態(tài)氮、溶解氧濃度均呈極顯著正相關，與亞硝態(tài)氮、銨態(tài)氮以及正磷酸鹽濃度均呈顯著正相關，與pH值呈顯著負相關，與溫度、總氮和總磷濃度均無顯著相關性；gvpC的相對表達量與硝態(tài)氮、銨態(tài)氮以及正磷酸鹽濃度均呈極顯著正相關，與總氮和亞硝態(tài)氮濃度呈顯著正相關，與溫度和pH值均呈顯著負相關，與溶解氧和總磷濃度均無顯著相關性.

藻藍蛋白轉錄間隔區(qū)基因；偽空胞基因；反轉錄定量PCR；環(huán)境因子；相對表達量；太湖

湖泊富營養(yǎng)化和藍藻水華的發(fā)生是目前全世界共同面臨的重大環(huán)境問題之一[1]，而在太湖和許多富營養(yǎng)化湖泊的藻類類群中，微囊藻(Microcystisspp.)是一個分布廣泛的水華藍藻種類[2]. 有研究指出藍藻水華的形成存在3個基本要素：一是水體中藍藻能在種間競爭中形成優(yōu)勢；二是藍藻能夠形成較大的生物量；三是具備合適的水力及水文氣候條件，藍藻能通過浮力調節(jié)在水體表層聚集[3]. 大量藍藻群體通過調節(jié)自身浮力改變它們在水柱中所處的深度，以獲取適宜的光能，得到充足的營養(yǎng)鹽，這使得它們在與其它藻類競爭時具有明顯的優(yōu)勢. 因此，研究藍藻生物量以及浮力調控和垂直遷移特征對于探明水華形成機制有著十分重要的意義.

通常用藍藻體內參與光合作用的藻藍蛋白濃度表征藍藻生物量，對于藍藻上浮而言，藻細胞通過其細胞內結構——偽空胞的破裂與合成，調節(jié)自身在水體中的垂直分布. 然而富營養(yǎng)化湖泊水質背景復雜，傳統(tǒng)的藻藍蛋白分析方法(如分光光度法、高效液相色譜法等)及偽空胞分析方法(如壓力毛細管法)不能區(qū)分死活細胞，難以真正反映具有活性藻類的狀態(tài). 隨著分子生物學技術的發(fā)展，從環(huán)境樣品中提取和處理核酸的技術逐漸被應用到微生物形態(tài)學中. 在研究微生物群落關鍵基因的動態(tài)變化時，以DNA為模板擴增目的基因序列往往會受到死亡細胞或游離DNA殘體的影響，因而難以判斷其生態(tài)學影響[4]. 而分析RNA序列則能針對微生物群落中具有活性的生物，尤其是mRNA表達的研究分析可以提供更多的針對特定微生物的信息. 目前發(fā)展起來的實時熒光定量反轉錄PCR技術能夠很敏感地檢測到含量很低的RNA，并對目的基因進行擴增定量化研究[5]. 根據(jù)設計特異性引物，可以對水體藍藻藻藍蛋白和偽空胞的組成蛋白在轉錄水平上進行研究，檢測藍藻在不同外部環(huán)境下數(shù)量和浮力的動態(tài)變化，為預防和控制藍藻水華提供重要技術支持.

本研究通過對太湖梅梁灣野外水體藍藻RNA進行提取，利用反轉錄和實時熒光定量PCR技術，分別以微囊藻藻藍蛋白轉錄間隔區(qū)基因(PC-IGS)和偽空胞合成基因(gvpC)為研究對象，對其轉錄進行監(jiān)測，探討代謝因子之間的相互關系，并確定環(huán)境因子對PC-IGS和gvpC表達的影響.

1 材料與方法

1.1 采樣點與樣品采集

梅梁灣(31°25′53″N，120°12′42″E)位于太湖最北部，北接無錫市，是近年來太湖富營養(yǎng)化最為嚴重的湖區(qū). 2013年1月至2014年1月(缺少2013年8月數(shù)據(jù))每月采樣. 用2.5 m長的PVC管采集整水柱，均勻混合. 同時用多功能水質參數(shù)儀(YSI6600-V2，Yellow Spring Instruments，USA)原位測定水體理化參數(shù)，包括溶解氧(DO)、電導率、濁度、水溫、pH值等. 現(xiàn)場立即用GF/C濾膜過濾100ml水樣用于RNA提取，然后將GF/C濾膜放入2ml凍存管中，立即向凍存管中加入一定體積的RNA later保護液，迅速將裝有樣品的2ml凍存管放入液氮中保存. 帶回實驗室放在-70℃中保存直到RNA提取.

1.2 營養(yǎng)鹽的測定

1.3 藻藍蛋白的測定

取水樣100ml，用GF/C濾膜過濾，所得濾膜置于研缽中仔細研磨2～5 min，加入pH值為7.0 的Tris緩沖液6ml，然后轉移到離心管中，4℃下避光保存10 h，然后在4000轉/min下離心5 min，將上清液轉移，定容. 藻藍蛋白的測定用島津分光光度計RF-5301，測定條件采用激發(fā)波長620 nm，發(fā)射波長647 nm，掃描波長設為60 nm/min，激發(fā)和發(fā)射光柵寬度均設為5 nm，響應時間2 s，增益置于normal，以0.05 mol/L pH值為7.0 的Tris緩沖液作為熒光參比液進行校零[7]. 每個樣品重復3次.

1.4 水樣中藍藻RNA的提取

將2013年1月-2014年1月(缺少2013年8月數(shù)據(jù))共12份保存在-70℃下的GF/C濾膜，分別轉移到相對應編號的裂解管B(Lysing Matrix B，玻璃珠直徑0.1 mm)中，然后每個裂解管B中加入500 μl Buffer RLT，將裂解管B放置于Fast Prep-24樣品處理儀器中. 設置Fast Prep-24樣品處理儀器參數(shù)為6 m/s，35 s. 擊打破碎之后，立即取出裂解管B并放于冰上. 然后將裂解管B在4℃、12000 轉/min條件下離心10 s，緊接著將上清液轉移至無RNase的2ml離心管中. 由于裂解管B在離心之后很多未打碎的藻細胞下沉到管底部，再一次向裂解管B中加入500 μl Buffer RLT，再次打碎，離心. 將上清夜與第1次離心得到的上清液混合. 然后根據(jù)RNeasy Plant Mini Kit RNA提取試劑盒的操作說明書，并對試劑盒的操作步驟進行微小調整，在加入70%無水乙醇清洗之后，加入DNaseI去除基因組DNA. 將提取的無DNA污染的RNA在-70℃下貯存?zhèn)溆? 利用NanoDrop 2000/2000c微量紫外分光光度計測量RNA濃度和純度(OD260/280).

1.5 反轉錄定量PCR

利用室內培養(yǎng)的銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa7806)作為對照，培養(yǎng)基為BG-11，培養(yǎng)溫度為25℃，光照強度為40 μE/(m2·s)，光照周期為12 h ∶12 h，離心收集處于對數(shù)生長期的藻細胞. 按照1.4節(jié)提取野外水體藍藻RNA的方法提取室內微囊藻RNA.

表1 引物序列

根據(jù)從不同樣品中提取的RNA濃度，將RNA統(tǒng)一定量至400 ng，用Transciptor First Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒合成單鏈cDNA模板. 本實驗選取微囊藻特異性16S rRNA基因為內參基因， PC-IGS和gvpC為定量檢測目的基因. 針對各個目的基因所設計的引物見表1. 將以16S rRNA為引物的cDNA模板稀釋10倍，其它的cDNA模板不稀釋. qRT-RCR反應體系為25 μl，其中含12.5 μl 2×QuantiFast SYBR Green PCR Master Mix，2 μmol/L引物，1 μl模板，無RNA酶的水10.5 μl. PCR反應在replex4(Eppendorf)熒光定量PCR儀上完成. 擴增程序如下：95℃預變性3 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，40個循環(huán). PCR完成后，導出相應的閾值循環(huán)數(shù)值(threshold cycle value，簡寫為Ct值，定義為熒光信號到達設定的閾值時所經歷的循環(huán)數(shù)，目的基因的拷貝數(shù)與Ct值呈負相關). 以16S rRNA為陽性內對照基因來校正PCR模板的細胞拷貝數(shù)(ΔCt目的基因=Ct目的基因-Ct同一樣本16S)，從而消除組間加樣量. 實驗重復3次. 每個樣品的ΔCt平均值減去室內ΔCt平均值得到每個目的基因相對循環(huán)數(shù)(ΔΔCt值)，即ΔΔCt目的基因=野外ΔCt目的基因-室內ΔCt目的基因). 相對量(表達變化倍數(shù))的計算采用2-ΔΔCt方法[8]. 最后進行熔解曲線分析，為了證明目的基因(PC-IGS和gvpC)和內參基因(16S RNA)的擴增效率(amplification efficiency)一致，將室內樣品的cDNA模板稀釋成一系列梯度，利用內參基因(16S rRNA)和目的基因(PC-IGS和gvpC)引物擴增，通過cDNA濃度梯度的lg值對ΔCt值(ΔCt=Ct目的基因-Ct內參基因)作圖，如果所得直線斜率絕對值接近于0，說明擴增效率相同[9].

1.6 數(shù)據(jù)處理和分析

采用Origin 8.5和SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理和分析.

2 結果

2.1 太湖梅梁灣水體理化參數(shù)和營養(yǎng)鹽的月變化

表2 2013年1月-2014年1月太湖梅梁灣水體的每月營養(yǎng)鹽濃度

2.2 太湖梅梁灣水體中藻藍蛋白濃度的月變化

圖1 2013年1月至2014年1月太湖梅梁灣水體藻藍蛋白濃度Fig.1 Phycocyanin concentration of water in Meiliang Bay， Lake Taihu from January 2013 to January 2014

在2013年1—4月期間，太湖梅梁灣水體藻藍蛋白濃度呈緩慢升高的趨勢，而在5—10月藻藍蛋白濃度大幅度升高，并在10月達到最大值(260.1 μg/L)，之后，藻藍蛋白濃度急劇下降并在11月達到全年最低值(2.9 μg/L)，春季和冬季藻藍蛋白濃度明顯低于夏季和秋季(圖1).

2.3 熒光定量反轉錄PCR測定

提取所有樣品的RNA，OD260/280值均在1.8～2.2之間，說明提取的樣品RNA純度均符合要求. 目的基因PC-IGS和gvpC經過一系列梯度稀釋的cDNA模板擴增后，通過cDNA濃度梯度的對數(shù)轉化，對ΔCt值作圖，得到的直線方程分別為y=-0.016x+10.023和y=-0.0931x+10.109. 兩條直線斜率的絕對值都接近0，2個目的基因(PC-IGS和gvpC)和內參基因的擴增效率一致.

2.4 太湖梅梁灣水體中藍藻PC-IGS相對表達量的月變化

根據(jù)實時熒光定量反轉錄PCR技術和2-ΔΔCt計算方法，得到2013年1月至2014年1月(缺少2013年8月數(shù)據(jù))期間太湖梅梁灣水體中PC-IGS相對于室內微囊藻PC-IGS的相對表達量. 結果表明，在不同時期內PC-IGS相對表達量有很大差異，從1—5月藻藍蛋白基因相對表達量逐漸上升，并在5月達到最高，5月的相對表達量是1月的7倍. 但到6月藻藍蛋白基因相對表達量急劇下降至只有5月的1/4，和2月的相對表達量幾乎相同. 9月是全年中藻藍蛋白基因相對表達量最低的月份，從10月份開始藻藍蛋白轉錄水平逐漸上升，總的來看冬季相對表達量始終低于春季(圖2).

2.5 太湖梅梁灣水體中藍藻gvpC相對表達量的月變化

2013年1—3月太湖梅梁灣水體中藍藻gvpC相對表達量呈升高趨勢，并在3月達到全年表達量的最高值. 1月和2月gvpC的相對表達量很接近，2—3月其相對表達量卻急劇上升，3月相對表達量幾乎是1、2月份的3倍，到4月時gvpC相對表達量直線下降到只有3月份的1/2. 5—10月這段時間內gvpC相對表達量呈下降趨勢，并在9月和10月達到最低值，10月份的相對表達量幾乎檢測不到. 從結果還可以看出，gvpC相對表達量從10月就開始上升(圖2).

圖2 2013年1月至2014年1月太湖梅梁灣水體中藍藻PC-IGS和gvpC相對表達量的月變化Fig.2 Relative expressions of PC-IGS and gvpC in cyanobacteria in Meiliang Bay， Lake Taihu from January 2013 to January 2014

2.6 相關性分析

表3 環(huán)境因子與PC-IGS以及gvpC基因相對表達量的相關性分析

*表示P<0.05，**表示P<0.01.

3 討論

熒光定量PCR技術在藍藻水華研究中的應用已相當廣泛. 目前，基于目標DNA片段的定量PCR技術已經成熟而且被廣泛應用于估算野外環(huán)境藍藻豐度和產毒微囊藻豐度[13-14]，這項技術能夠快速確定藍藻水華毒性，并對藍藻水華的生態(tài)風險做出評價. 而本研究運用反轉錄定量PCR技術檢測了太湖梅梁灣水體藍藻PC-IGS和gvpC在2013年1月至2014年1月不同時間內的相對表達量，在轉錄水平上檢測藍藻在不同外部環(huán)境下數(shù)量和浮力的動態(tài)變化. 在實時熒光定量PCR結果分析中采用2-ΔΔCt方法分析基因表達的相對變化，它的優(yōu)點是無須知道起始模板的拷貝數(shù)，只須保證PCR擴增目標基因和內參基因的擴增效率相同，分析基因相對表達量即可. 在本實驗中將室內樣品的cDNA模板稀釋成一系列梯度，利用內參基因(16S rRNA)和目的基因(PC-IGS和gvpC)引物擴增，通過cDNA濃度梯度的對數(shù)值對ΔCt值構造曲線，所得到的2條直線斜率的絕對值(0.016和0.0931)都接近于0，說明2個目的基因(PC-IGS和gvpC)和內參基因的擴增效率一致，從而保證了實驗結果的準確性.

結合2013年1月到2014年1月藻藍蛋白濃度的月變化以及藍藻生活史來看，11月到次年2月是藍藻整個生活史中一個非常特殊的時期——越冬期，藻體經歷了大量消亡后逐漸下沉，所以導致水體中藍藻數(shù)量逐漸減少，并一直處于低位. 隨著春季(3—5月)溫度上升、光照加強，在冬季下沉到湖泊底泥以及上覆水中的水華藍藻細胞及群體開始進入水柱，逐漸復蘇生長，所以看到2013年3—5月梅梁灣水體藍藻數(shù)量逐漸增加. 與閻榮等[15]和吳曉東等[16]對太湖、巢湖和玄武湖等湖泊的周年野外觀測研究和室內模擬實驗發(fā)現(xiàn)的結果略有不同：他們指出在秋季，隨著溫度的降低，不同湖泊及不同湖區(qū)的水體中表征藍藻生物量的藻藍蛋白濃度逐漸下降. 而本研究結果發(fā)現(xiàn)梅梁灣水體藻藍蛋白濃度從5月份逐漸升高并持續(xù)到10月，這可能是由于2013年夏、秋季的溫度高于往年同期，導致藍藻水華完全消失的時間推遲.

從基因表達水平上看，PC-IGS和gvpC的表達在時間上存在差異，gvpC的表達早于PC-IGS，可能是由于隨著gvpC表達量的升高，藍藻迅速合成偽空胞，從而帶動藍藻從水體上浮到水體表面，進而使得藍藻獲得適宜的生長條件和營養(yǎng)鹽，這時藻藍蛋白基因才開始迅速表達. 在藍藻水華形成的各個階段，偽空胞是否一直為藍藻提供浮力并起到決定性作用并不清楚，本研究發(fā)現(xiàn)藍藻在越冬復蘇階段，gvpC轉錄水平逐漸升高并在3月份達到最大值，但是在藍藻生物量增加以及上浮階段，gvpC表達水平逐漸降低. 這表明gvpC的表達及偽空胞的形成極有可能是微囊藻擺脫休眠狀態(tài)、重新獲得浮力的一個標志性轉變，當藻細胞重新恢復成正常細胞后即不需要gvpC的持續(xù)表達. 這一結果與張永生等[17]的室內研究結果一致：在微囊藻上浮過程中，偽空胞的氣體相對含量先增加后減少，gvpC基因轉錄水平也隨著微囊藻上浮逐漸降低，他的研究還表明偽空胞是微囊藻上浮的主要浮力提供者，該浮力僅能使微囊藻懸浮在水中，不能使其漂浮到水面形成藍藻水華. 與gvpC表達不同，PC-IGS相對表達量從1—5月逐漸升高，并在5月迅速達到最大值，貫穿整個越冬復蘇期. 當形成水華后，PC-IGS的表達才逐漸下降. 這可能是由于當微囊藻進入水華期后，可以上浮至湖面獲得最大光照，無法繼續(xù)合成藻藍蛋白. 而水體藻藍蛋白濃度卻從3月逐漸增加并持續(xù)到10月，主要是因為微囊藻的復蘇可能是一個漸進的過程，加之底泥表面的微囊藻種源不斷進入水體，上浮至水體表面，直至盛夏藻濃度才到達最高值.

致謝：葛秀春、余麗、杜明勇等對本實驗提供指導與幫助，特此致謝！

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Environment factors and expression of PC-IGS andgvpCgenes in Meiliang Bay of Lake Taihu

ZHANG Jinli1，2， YU Long1， GE Xiuchun3， LI Yuyan1& YU Yang2

(1：CollegeofBiotechnologyandPharmaceuticalEngineering，NanjingUniversityofTechnology，Nanjing211816，P.R.China)

(2：StateKeyLaboratoryofLakeScienceandEnvironment，NanjingInstituteofGeographyandLimnology，ChineseAcademyofSciences，Nanjing210008，P.R.China)

(3：VirginiaCommonwealthUniversity，Richmond23284，USA)

The relative expression of intergenic spacer region-within the Phycocyanin(PC-IGS) and gas vesicle gene(gvpC) in cyanobacteria in Meiliang Bay， Lake Taihu from January of 2013 to January of 2014， was investigated using reverse transcription-quantitative PCR， compared to those in interiorMicrocystisaeruginosa. In addition， we analyzed the influence of environmental factors on the relative expressions of PC-IGS andgvpCgene. The results showed that the relative expression of PC-IGS increased from January to May of 2013， and reached the maximum in May of 2013. The relative expression ofgvpCgene rose from January of 2013， and reached the maximum in March of 2013. The expression ofgvpCgene increased earlier than that of PC-IGS. The data also showed that the relative expression of target gene PC-IGS was correlated significantly and positively with the concentrations of nitrate nitrogen， dissolved oxygen， ammonia， nitrite nitrogen and orthophosphate salt， negatively with pH value， and not significantly with temperature， total nitrogen and total phosphorus. The relative expression of target genegvpCwas correlated significantly and positively with the concentrations of ammonia， nitrate nitrogen and orthophosphate salt. They are positively correlated with the concentrations of total nitrogen and nitrite nitrogen， but negatively with pH value and temperature， and not significantly with the concentrations of dissolved oxygen and total phosphorus in water.

PC-IGS;gvpC; reverse transcription-quantitative PCR; environmental factors; relative expression; Lake Taihu

*國家水體污染控制與治理科技重大專項(2012ZX07506-001)和太湖流域(江蘇)水生態(tài)功能分區(qū)與標準管理工程建設課題(2011ZX07534-001)聯(lián)合資助. 2014-09-11收稿；2014-12-12收修改稿. 張金麗(1989～)，女，碩士研究生；E-mail：18761681572@163.com.

J.LakeSci.(湖泊科學)， 2015， 27(5)： 895-901

DOI 10.18307/2015.0516

?2015 byJournalofLakeSciences

**通信作者；E-mail:lzsswgc@163.com.