福建東南沿海某戰(zhàn)區(qū)醫(yī)院MRSA感染特點(diǎn)及基因多態(tài)性分型研究

魏智藝，程君濤，李小毅，劉丁井

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·論著·

福建東南沿海某戰(zhàn)區(qū)醫(yī)院MRSA感染特點(diǎn)及基因多態(tài)性分型研究

魏智藝，程君濤，李小毅，劉丁井

目的 了解福建東南沿海某戰(zhàn)區(qū)醫(yī)院MRSA感染特點(diǎn)及基因多態(tài)性分型情況，為制定院內(nèi)MRSA感染的防治策略提供分子生物學(xué)依據(jù)。方法 采用頭孢西丁試紙片法初步鑒定MRSA菌株，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)檢測MecA基因，最終鑒定臨床送檢標(biāo)本所檢測出的MRSA菌株，并通過隨機(jī)引物DNA擴(kuò)增技術(shù)(RAPD)對所檢測的MRSA菌株進(jìn)行基因分型研究。結(jié)果 經(jīng)PCR對MecA基因檢測，從臨床標(biāo)本及醫(yī)護(hù)人員身上共分離出42株MRSA菌株。采用隨機(jī)引物DNA擴(kuò)增技術(shù)(RAPD)對細(xì)菌進(jìn)行基因分型，根據(jù)同源性分析，42株臨床菌株共可以分為12型。其中Ⅰ型共7株，Ⅱ型共2株，Ⅲ型共4株，Ⅳ型共4株，Ⅴ型共7株，Ⅵ、Ⅶ及Ⅷ各1株，Ⅸ型共8株，Ⅹ型共2株，Ⅺ型共3株，Ⅻ型共2株。結(jié)論 本院MRSA菌株存在相似度大小不同的遺傳距離，醫(yī)院內(nèi)存在交叉感染可能。

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌;院內(nèi)感染;PCR;RAPD;聚類分析

近年來，院內(nèi)感染中多重耐藥細(xì)菌感染有不斷增多趨勢，尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)感染，給嚴(yán)重?zé)齻?、?chuàng)傷及其他危重病患者的治療帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。雖然目前國內(nèi)外對MRSA感染已有較多研究，但由于MRSA細(xì)菌基因具有多態(tài)性，不同地區(qū)醫(yī)院的MRSA基因分型和傳播特點(diǎn)也不盡相同。目前對福建東南沿海戰(zhàn)區(qū)醫(yī)院內(nèi)MRSA細(xì)菌感染特點(diǎn)及基因多態(tài)性分型研究較少，給治療、預(yù)防帶來巨大困難，是當(dāng)前為控制院內(nèi)感染、提高本戰(zhàn)區(qū)創(chuàng)傷、燒傷的救治率，降低感染死亡率所迫切需要解決的一道難題?，F(xiàn)將某戰(zhàn)區(qū)醫(yī)院內(nèi)MRSA的研究報告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集 細(xì)菌標(biāo)本采集自2011—2013年本院臨床科室住院患者送檢的痰液、創(chuàng)面分泌物、血液、靜脈導(dǎo)管尖端，以及陪護(hù)人員、醫(yī)務(wù)工作者的雙手、鼻腔前庭等部位。

1.2 主要材料 頭孢西丁紙片及藥敏實(shí)驗(yàn)所用抗菌藥物：青霉素、苯唑西林、氨芐西林、莫西沙星、左氧氟沙星、頭孢唑林、哌拉西林/他唑巴坦、紅霉素、四環(huán)素、利福平、慶大霉素、復(fù)方新諾明、克林霉素(均為上海杰瑞絲生物公司產(chǎn)品)、利奈唑胺、替考拉寧、萬古霉素(大連醫(yī)諾生物有限公司產(chǎn)品)。Biospin細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(含蛋白酶K)(上海泛科實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品)，Premix溶液(包含Ex Taq、dNTP Mixture Ex等)、DNA Marker(大連TaKaRa公司產(chǎn)品)，溶菌酶(上海泛科實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品)，瓊脂糖(南京森貝伽生物公司產(chǎn)品)，TAE緩沖液(上海迪申生物公司產(chǎn)品)，核酸染料(溴乙啶)(上海振宇化工科技公司產(chǎn)品)，無水乙醇。

1.3 主要儀器 細(xì)菌接種環(huán)、無菌接種臺、酒精燈、CO2細(xì)菌孵育箱(德國Heraeus)、VIKET-2細(xì)菌鑒定儀(梅里埃)，顯微鏡(OLYMPUS BX53)、移液管、電子比濁儀(HNTD5-TDR-1002)、漩渦混勻器(XK80-A型)、低溫冰箱(panasonic)。PCR擴(kuò)增儀(德國Eppendorf公司)、電泳儀、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)、高速離心機(jī)、分光光度計、各種量程的微量移液槍。

1.4 引物設(shè)計 根據(jù)文獻(xiàn)[1]設(shè)計MecA引物，P1:5′-AAAATCGATGGTAAAGGTTGGC-3′，P2:5′-AGTTCTGCAGTACCGGATTTGC-3′。根據(jù)文獻(xiàn)[2]設(shè)計RAPD引物，EricⅡ：5′-AAGTAAGTGACTGGGGGTGAGCG-3′。以上引物均由福州貝克曼生物有限公司合成。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法及操作流程 收集臨床送檢標(biāo)本，并進(jìn)行細(xì)菌分離、培養(yǎng)。同時收集醫(yī)護(hù)人員的定植細(xì)菌。使用VIKET-2細(xì)菌鑒定儀鑒定被測細(xì)菌，并進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，了解細(xì)菌對16種抗生素的耐藥情況。藥敏實(shí)驗(yàn)采用微量肉湯稀釋法。

1.5.1 細(xì)菌DNA的提取：嚴(yán)格按照Biospin細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的說明書進(jìn)行。

1.5.2 頭孢西丁試紙片法鑒定MRSA菌株：根據(jù)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)制定的標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果[3]，凡頭孢西丁抑菌環(huán)直徑≤19 mm的即表示金黃色葡萄球菌對頭孢西丁耐藥，可初步判定為MRSA菌株。細(xì)菌鑒定和藥敏實(shí)驗(yàn)使用VIKET-2細(xì)菌鑒定儀。

1.5.3 MecA基因PCR擴(kuò)增體系及條件：反應(yīng)體系為20 μl，其中DNA模板2 μl，PCR master 10 μl，引物各1.0 μl，最后用滅菌雙蒸水補(bǔ)足20 μl。反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸5 min，反應(yīng)結(jié)束。取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μl在電壓120 V，1.5%瓊脂糖凝膠電泳40 min，以DNA標(biāo)志物(DNA Marker)作為參照，凝膠成像系統(tǒng)照相,使用凝膠成像儀觀察結(jié)果并保存。

1.5.4 RAPD-PCR基因擴(kuò)增：對MecA基因PCR擴(kuò)增均陽性的MRSA菌株基因進(jìn)行擴(kuò)增并進(jìn)行分型。RAPD反應(yīng)體系為20 μl反應(yīng)體系，其中待測DNA模板2 μl，PCR master 10 μl，Mg2+濃度2.0 mmol/L，引物各1.5 μl，最后用滅菌雙蒸水補(bǔ)足20 μl。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性60 s，25℃退火60 s，72℃延伸120 s，共40個循環(huán)；最后72℃延伸5 min，反應(yīng)結(jié)束。取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μl在電壓120 V，1.5%瓊脂糖凝膠電泳40 min，以DNA標(biāo)志物(DNA Marker)作為參照，凝膠成像系統(tǒng)照相,使用凝膠成像儀觀察結(jié)果并保存。

2 結(jié)果

2.1 本院院內(nèi)感染情況 本院檢驗(yàn)科及感染控制科協(xié)助調(diào)查并統(tǒng)計院內(nèi)感染情況，結(jié)果顯示，2011—2013年期間院內(nèi)感染率為6.4%，其中呼吸道感染占50.3%(以下呼吸道感染為多見)，創(chuàng)面感染占13.1%，其他感染部位還包括手術(shù)切口、胃腸道、泌尿生殖道等。院內(nèi)感染仍以革蘭氏陰性桿菌為主，占64.5%，而革蘭陽性球菌占33.7%，存在小部分真菌感染，其中革蘭氏陽性球菌較前有上升的趨勢。在革蘭氏陽性球菌感染中，最主要的是金黃色葡萄球菌感染，且絕大部分金黃色葡萄球菌對抗菌藥呈不同程度的耐藥。本實(shí)驗(yàn)所檢測出的MRSA占所有金黃色葡萄球菌的38.9%。

2.2 MecA基因檢測結(jié)果 通過PCR對使用頭孢西丁試紙片初步篩查所得的MRSA菌株進(jìn)行MecA基因檢測。其中42株具有MecA電泳條帶(533 bp)，被確定為MRSA，其余菌株由于無MecA電泳條帶而被排除，見圖1、2。

2.3 本院各臨床科室MRSA菌株檢出分布情況 本院各臨床科室共檢出MRSA菌株42株，其中神經(jīng)外科檢出MRSA菌株12株(28.57%)；燒傷整形科檢出10株(23.81%)，呼吸內(nèi)科檢出6株(14.29%)，重癥醫(yī)學(xué)病房檢出5株(11.91%)，胸外科、骨科分別檢出2株(4.76%)，心內(nèi)科、腫瘤內(nèi)科分別檢出1株(2.38%)，陪護(hù)及醫(yī)務(wù)人員檢出3株(7.14%)。42株MRSA菌株標(biāo)本來自痰液18株(42.86%)，創(chuàng)面分泌物10株(23.81%)，血液6株(14.29%)，導(dǎo)管尖端5株(11.90%)，陪護(hù)人員鼻腔2株(4.76%)，醫(yī)務(wù)人員手部1株(2.38%)。

2.4 MRSA菌株的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果 所有檢測到的42株MRSA菌株對利奈唑胺、替考拉寧以及萬古霉素均敏感；對青霉素、苯唑西林、氨芐西林、頭孢唑林、哌拉西林/他唑巴坦均耐藥；而對復(fù)方新諾明、紅霉素、四環(huán)素、慶大霉素、克林霉素、左氧氟沙星、莫西沙星、利福平的耐藥率分別為：92.9%、92.9%、88.1%、88.1%、85.7%、76.2%、64.3%、61.9%，見表1。

2.5 RAPD基因多態(tài)性分型 經(jīng)PCR檢測MecA基因鑒定后得到的42株MRSA菌株，經(jīng)RAPD隨機(jī)擴(kuò)增DNA片段，每株菌株均擴(kuò)增出3～7條不等的電泳條帶，見圖3。使用Cross Checker V2.91和NTSYSpc V2.10e圖像分析、遺傳圖譜聚類分析軟件，對RAPD隨機(jī)擴(kuò)增出的細(xì)菌DNA條帶進(jìn)行聚類分析。根據(jù)條帶數(shù)目的不同，42株菌株可分為Ⅰ～Ⅻ共12型，其中Ⅰ型共7株，Ⅱ型共2株，Ⅲ型共4株，Ⅳ型共4株，Ⅴ型共7株，Ⅵ、Ⅶ及Ⅷ各1株，Ⅸ型共8株，Ⅹ型共2株，Ⅺ型共3株，Ⅻ型共2株，見圖4。

表1 42株MRSA菌株對16種常用抗菌藥的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1 部分標(biāo)本DNA抽提后行聚合酶鏈反應(yīng) MecA基因檢測結(jié)果

無電泳條帶標(biāo)本為MecA陰性，M為DNA Marker

圖2 42株臨床MRSA菌株MecA陽性基因電泳圖譜

M為DNA-Marker

圖3 42株MRSA DNA抽提后行RAPD 基因擴(kuò)增聚合酶鏈反應(yīng)電泳圖譜

M為DNA Marker，1-42為菌株編號

圖4 42株MRSA RAPD基因分型情況

各科室送檢MRSA菌株基因型的分布情況，其中神經(jīng)外科主要以Ⅰ型及Ⅸ型為主，7株Ⅰ型，3株Ⅸ型；而燒傷整形科則以V型多見，共6株，同時檢測出3株Ⅲ型細(xì)菌；ICU病區(qū)分離出的MRSA菌株的型別則分離出4株Ⅳ型菌株；呼吸內(nèi)科送檢5株MRSA菌株，包括4株Ⅸ型以及1株Ⅵ型。從神經(jīng)外科患者家屬的鼻腔分離到的2株MRSA菌株，通過RAPD隨機(jī)擴(kuò)增其DNA的多態(tài)性，經(jīng)聚類分析，最后鑒定這2株菌株均為Ⅰ型；而ICU護(hù)士的手分離到的MRSA則為Ⅳ型，見圖5。

圖5 42株MRSA的基因圖譜遺傳距離樹狀圖

Coffcient為相關(guān)系數(shù)，S1-S42為菌株編號，Ⅰ～Ⅻ為基因分型

3 討論

大量研究資料表明MRSA在世界范圍內(nèi)感染率呈逐年上升趨勢，是目前公認(rèn)的院內(nèi)感染的高危病原菌之一[4]。文獻(xiàn)報道，我國每年院內(nèi)感染中MRSA感染占5%～10%。本次實(shí)驗(yàn)共收集MRSA菌株42株，占我院院內(nèi)感染的7.4%。從送檢標(biāo)本上看，大部分以痰液及創(chuàng)面分泌物為主，與國內(nèi)各地區(qū)及醫(yī)院的報道相一致[5]。MRSA菌株主要通過空氣傳播，MRSA菌株容易在呼吸道定植，特別是下呼吸道。此外，我們也發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)面分泌物中MRSA的檢出率也較高，這些標(biāo)本大部分來源于燒傷科，特別是大面積深度燒傷的危重患者，住院時間較長，長期、大量應(yīng)用抗菌藥物進(jìn)行抗感染治療。皮膚作為人體天然的保護(hù)屏障，皮膚燒傷、受損后極容易引起細(xì)菌的定植與感染[6]。對于燒傷患者應(yīng)加強(qiáng)創(chuàng)面處理及保護(hù)，預(yù)防創(chuàng)面膿毒癥的出現(xiàn)。同時應(yīng)提高對創(chuàng)面分泌物細(xì)菌培養(yǎng)的送檢率，對定植細(xì)菌進(jìn)行動態(tài)觀察，做到早期預(yù)防、早期干預(yù)，可有效預(yù)防創(chuàng)面MRSA感染。

MRSA之所以對抗生素具有高度免疫性，是由于其耐藥機(jī)制的復(fù)雜多樣化決定的，其中通過MecA基因介導(dǎo)編碼產(chǎn)生PBP2a，是其最主要也是最重要的耐藥機(jī)制[7]。MecA基因編碼產(chǎn)生青霉素結(jié)合蛋白-PBP2a與β-內(nèi)酰胺類抗生素的親和力低，從而導(dǎo)致抗菌藥物對細(xì)菌抑制能力大大下降，出現(xiàn)耐藥。據(jù)文獻(xiàn)報道，使用頭孢西丁紙片檢測、鑒定MRSA存在一定的誤差。MecA基因作為MRSA特有的耐藥基因，通過PCR技術(shù)檢測金黃色葡萄球菌的MecA基因已作為鑒定MRSA的金標(biāo)準(zhǔn)[8]。本次實(shí)驗(yàn)首先使用頭孢西丁紙片進(jìn)行篩查，最終通過PCR檢測菌株的MecA基因來鑒定MRSA菌株。實(shí)驗(yàn)過程中我們發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用頭孢西丁紙片鑒定MRSA菌株，存在假陽性率。并且使用頭孢西丁紙片篩查MRSA菌株具有操作繁瑣、耗時長、消耗了大量的人力成本等問題。如進(jìn)行大樣本的檢測，建議首選使用PCR技術(shù)直接檢測其MecA基因，特別是醫(yī)院內(nèi)發(fā)生可疑的MRSA暴發(fā)流行時，可以為制定防治策略節(jié)省寶貴的時間。為了解細(xì)菌的耐藥機(jī)制，目前對院內(nèi)病原菌進(jìn)行分型更多的是通過細(xì)菌自身基因進(jìn)行分型，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，目前基因分型的方法較多。20世紀(jì)90年代初人們開始利用RAPD技術(shù)來檢測DNA的多態(tài)性，其原理就是使用隨機(jī)引物，通過PCR技術(shù)對所研究的DNA進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增，通過對所得到的不同電泳條帶進(jìn)行分析，進(jìn)而研究其是否存在同源性[9]。本實(shí)驗(yàn)利用RAPD技術(shù)對篩查出的MRSA菌株進(jìn)行檢測，分析其是否存在同源性。從電泳指紋圖譜的結(jié)果上看，大多數(shù)菌株的DNA可擴(kuò)增出4～7個條帶。應(yīng)用生物醫(yī)學(xué)軟件，對DNA擴(kuò)增所得的條帶進(jìn)行系統(tǒng)的同源聚類分析，42株臨床菌株共歸類為12個基因型，其中Ⅰ型、Ⅴ型及Ⅸ為我院主要的優(yōu)勢菌株。本次實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)我院某種細(xì)菌型在院內(nèi)廣泛傳播，這與有關(guān)院內(nèi)MRSA感染的流行菌株型較單一的報道存在一定的差異，這可能與本次實(shí)驗(yàn)樣本量較小有關(guān)。同時本次實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)各個科室的流行菌株較為集中。如神經(jīng)外科以Ⅰ型為主，燒傷整形科以V型多見，而ICU病區(qū)分離出的MRSA菌株大部分為Ⅳ型。呼吸內(nèi)科主要為Ⅸ型。某種程度上驗(yàn)證了相關(guān)機(jī)構(gòu)的研究結(jié)果。有研究顯示，患者感染的MRSA與其病房環(huán)境中分離出的MRSA菌株具有高度同源性[10]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)外科、燒傷整形科、呼吸內(nèi)科、ICU等科室MRSA的檢出率較高，同時分別從神經(jīng)外科患者家屬的鼻前庭以及ICU護(hù)士的手部分離出MRSA菌株，從基因型上看，其與該科室流行菌株具有高度的同源性。這進(jìn)一步說明了醫(yī)院內(nèi)病區(qū)之間、科室之間、患者之間以及醫(yī)護(hù)人員與患者之間可能存在相互傳播及交叉感染。

MRSA菌株在人體最常見的定植部位是皮膚和鼻前庭部，臨床上可使用鼻拭子定期采集檢測患者鼻腔定植菌的情況，特別是長時間住院患者。一旦發(fā)現(xiàn)攜帶MRSA菌株，應(yīng)增強(qiáng)標(biāo)本的送檢次數(shù)，密切觀察病情變化，盡可能做到單間隔離或者同種病原菌入住同一病房，以防交叉感染[11-13]。

[1] Weidner J, Cassens U, G?hde W. A new triplex real time PCR which distinguishes between MRSA,MSSA,and MecA coagulase negative strains by means of melting point analysis using SYTO9[J].Clin Lab, 2013,59(7-8):795-804.

[2] Kurlenda J, Grinholc M, Jasek K,etal. RAPD typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus: a 7-year experience in a Polish hospital[J].Med Sci Monit, 2007,13(6):13-18.

[3] Oksuz L, Gurler N. Susceptibility of clinical methicillin-resistant Staphylococci isolates to new antibiotics[J].J Infect Dev Ctries, 2013,7(11):825-831.

[4] Wagener J, Seybold U. MRSA-hygiene management, diagnostics and treatment[J].Dtsch Med Wochenschr, 2014,139(13):643-651.

[5] 王斌,史友權(quán),司怡然,等.耐甲氧西林金黃色葡萄球菌流行病學(xué)特征的研究進(jìn)展[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2013,35(2)：183-187.

[6] Warner P, Neely A, Bailey J K,etal. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus furunculitis in the outpatient burn setting[J].J Burn Care Res, 2009,30(4):657-660.

[7] Titécat M, Lo?ez C, Senneville E,etal. Evaluation of rapid MecAgene detection versus standard culture in staphylococcal chronic prosthetic joint infections[J].Diagn Microbiol Infect Dis, 2012,73(4):318-321.

[8] Coban A Y. Rapid determination of methicillin resistance among Staphylococcusaureus clinical isolates by colorimetric methods[J].J Clin Microbiol, 2012,50(7):2191-2193.

[9] Vázquez S D, López C M, Saá I P,etal. Incidence and characterization of Staphylococcus aureus in fishery products marketed in Galicia (Northwest Spain)[J].Int J Food Microbiol, 2012,157(2):286-296.

[10]韓黎,常東,孟玉芬,等.燒傷病房內(nèi)MRSA傳播途徑的IRS-PCR分析[J].軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報,2006,27(5)：352-354.

[11]Moore G, Ali S, FitzGerald G,etal. Ward assessment of SmartIdeas Project: bringing source isolation to the patient[J].J Hosp Infect, 2010,76(2):103-107.

[12]曾釗宇,張宇,鐘劍文,等. MRSA和MSSA的藥敏結(jié)果比較和MRSA檢出率變化趨勢[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥,2012,19(12):66-67.

[13]韋秀平,邵麗麗.醫(yī)院獲得性MRSA下呼吸道感染42例分析[J].首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2000,21(2):120-121.

A Study on Characteristics and Genetic Polymorphisms of MRSA Infection in a PLA Hospital in Southeast Coastal Region of Fujian Province

WEI Zhi-yi, CHENG Jun-tao, LI Xiao-yi, LIU Ding-jing

(Department of Burns and Plastic Surgery, 180 Hospital of the PLA, Quanzhou, Fujian 362000, China)

Objective To study the characteristics and genetic polymorphisms of methicillin resistant staphylococcus aureus (MRSA) infection in a PLA hospital in southeast coastal region of Fujian Province, and to provide the molecular biological basis for prevention and control strategies of nosocomial MRSA infection. Methods MRSA strains were initially detected using Cefoxitin indicator paper, and MecA genes were detected using polymerase chain reaction (PCR) technology, MRSA strains detected from clinical samples were identified, and then genotyping of detected MRSA strains were studied using synthetic primer and random amplification of polymorphic DNA technique(RAPD). Results The MecA genes after PCR detection showed that 42 strains of MRSA strains were isolated from clinical specimens and the medical staff. The MRSA genotypes were differentiated with RAPD technology, and homologous analysis categorized 42 clinical MRSA strains into 12 genotypes, in which 7 strains of Type I, 2 of Type II, 4 of Type III, 4 of Type IV, 7 of Type V, 1 of Type VI, 1 of Type VII, 1 of Type VIII, 8 of Type IX, 2 of Type X, 3 of Type XI and 2 of Type XII. Conclusion MRSA strains have genetic distances of different sizes of similarity in our hospital, therefore nosocomial cross infection is possible.

Methicillin-resistant staphylococcus aureus; Nosocomial infection; Polymerase chain reaction; Random amplification of polymorphic DNA technique; Cluster analysis

南京軍區(qū)“十一五”醫(yī)藥衛(wèi)生基金支持項(xiàng)目(10MA080)

362000 福建 泉州,解放軍180醫(yī)院燒傷整形外科

程君濤,E-mail:c5481@sina.com

R632

A

2095-140X(2015)03-0079-06

10.3969/j.issn.2095-140X.2015.03.020

2014-09-14 修回時間：2014-11-30)