浸染法改良細(xì)菌芽胞染色實驗的探索

鄭冬超, 樊 佳, 王雨昊, 張 杰, 趙 健, 楊 鑫, 汪 紅

(四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 四川 成都 610065)

浸染法改良細(xì)菌芽胞染色實驗的探索

鄭冬超, 樊 佳, 王雨昊, 張 杰, 趙 健, 楊 鑫, 汪 紅

(四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 四川 成都 610065)

傳統(tǒng)芽胞染色法常用孔雀綠染液長時間加熱使芽胞著色,該方法用在教學(xué)上學(xué)生不易操作,成功率低,且孔雀綠染液有毒,加熱時容易四濺,對環(huán)境造成污染。因此,研究采用一種新的染色法——浸染法,對比孔雀綠濃度及浸染時間對染色效果的影響。結(jié)果表明,以10%的孔雀綠為初染劑,浸染10 min時染色效果最佳。采用浸染法操作簡單易行,染色效果對比鮮明,學(xué)生更易于區(qū)分菌體與芽胞的結(jié)構(gòu),且安全環(huán)保。

細(xì)菌芽胞染色； 浸染法； 孔雀綠

芽胞是芽胞桿菌屬和梭菌屬細(xì)菌生長到一定階段在菌體內(nèi)形成的一種抗逆性很強的休眠體結(jié)構(gòu),也被稱為內(nèi)生孢子(endospore),通常呈圓形或橢圓形。能否形成芽胞,以及芽胞的形狀、大小、位置、是否膨脹等形態(tài)特征,是鑒別細(xì)菌種類的重要依據(jù)。芽胞具有厚而致密的壁,通透性小,不易被普通染料著色。所有芽胞染色法都選用著色力強的染料,并加熱以促進標(biāo)本著色,然后使菌體脫色,保留上的染料,最后經(jīng)過復(fù)染,使菌體和芽胞呈不同的顏色[1-4]。芽胞染色是細(xì)菌分類的重要指標(biāo),是本科院校開設(shè)微生物課的專業(yè)學(xué)生必須熟練掌握的微生物染色技術(shù),現(xiàn)有的微生物實驗教材上介紹的染色方法是Schaeffer-Fulton 氏染色法。該方法采用孔雀綠作為初染劑,需置于酒精燈上持續(xù)加熱10 min左右,學(xué)生不易操作,加熱時易造成染液四濺,另外,孔雀綠染液易造成污染,且染色后普遍存在芽胞、菌體著色度及對比度不明顯并易褪色等缺點[5-6]。本研究采用浸染法對芽胞染色進行改良探索,并設(shè)立一系列孔雀綠濃度及浸染時間梯度,找出最佳染色效果組合條件。將浸染法推廣應(yīng)用到芽胞染色實驗教學(xué)中,使學(xué)生操作更為簡便、安全,染色成功率高,對比效果更好,更易區(qū)分菌體和芽胞的結(jié)構(gòu),從而提高實驗教學(xué)質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 材料

(1) 菌種:枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上37 ℃孵育36～48 h的斜面培養(yǎng)物。

(2) 染色劑:5%、10%、20%孔雀綠水溶液(加熱50 ℃左右)、0.5%番紅水溶液。

(3) 儀器設(shè)備:酒精燈,載玻片,染色皿,接種環(huán),載玻片夾子,Olympus顯微影像分析系統(tǒng)(1130萬像素數(shù)碼CCD、最高分辨率1280 × 1024)。

1.2 方法

(1) 取適量培養(yǎng)36～48 h左右的枯草芽胞桿菌斜面菌種,常規(guī)涂片、干燥、固定；

(2) 將固定好的涂片用鑷子放入5%、10%、20%的孔雀綠染液中,分別浸染5 min、10 min、15 min、20 min,而作為對照的常規(guī)Schaeffer-Fulton 氏染色法是滴加5%孔雀綠覆蓋涂菌部位,加熱至冒蒸氣并維持10 min,加熱過程中還要注意及時補充染液,切勿讓涂片干涸；

(3) 用鑷子取出涂片后(盡量滴干染液),用緩流自來水沖洗至流出水呈現(xiàn)無色狀態(tài)(沖洗不易太久,小心染液沾到身上)；

(4) 用0.5%番紅溶液染色1 min；

(5) 用緩流自來水沖洗番紅染液至流出水呈現(xiàn)無色；

(6) 待載玻片晾干后,用油鏡鏡檢并進行顯微攝像；

(7) 對比芽胞和菌體顏色深淺、對比度、背景清晰度等,客觀評價染色效果,將染色結(jié)果分為優(yōu)、良、中、差4 個等級,以芽胞菌體對比度強、背景清晰為優(yōu)。每種孔雀綠濃度及初染時間的組合實驗均至少重復(fù)3次。

2 結(jié)果

從圖1中各組合的芽胞染色結(jié)果可以看出:相比對照中傳統(tǒng)的Schaeffer-Fulton 氏染色法,以5%孔雀綠溶液作為初染劑,在浸染5～15 min時,芽胞的孔雀綠著色均較淺淡,與菌體的橙紅色對比效果不太明顯,只有浸染時間在20 min時染色效果較好,菌體、芽胞染色對比明顯；以10%孔雀綠溶液作為初染劑,浸染5 min時,芽胞的孔雀綠著色淺淡,染色對比效果不佳,浸染10 min時達(dá)到最佳效果,芽胞的鮮綠色與菌體的橙紅色對比最為明顯,之后15～20 min時,菌體紅色受孔雀綠染色影響色澤偏暗,菌體和芽胞染色對比效果降低；當(dāng)孔雀綠溶液濃度為20%時,芽胞染上的綠色過于濃烈,菌體上殘留的綠色無法被徹底沖洗除去,與菌體的紅色疊加形成紅褐色或褐灰色,顏色對比不顯著,難以區(qū)分菌體與芽胞的結(jié)構(gòu),浸染5～10 min時的對比效果稍強于浸染15～20 min。

圖1 不同濃度孔雀綠及浸染時間組合下芽胞染色差異

以芽胞和菌體顏色深淺、對比度、背景清晰度等為標(biāo)準(zhǔn),對不同濃度孔雀綠濃度及浸染時間組合下芽胞染色效果進行了客觀評價,結(jié)果得出,以5%孔雀綠溶液作為初染劑,在浸染5～15 min時染色效果為中差等,浸染時間在20 min時染色效果良好；以10%孔雀綠溶液作為初染劑,浸染5 min時,染色對比效果中等,浸染10 min時達(dá)到最佳的優(yōu)等效果,芽胞菌體紅綠顏色對比度強、背景清晰,而后染色效果隨時間增加而降低；當(dāng)孔雀綠溶液濃度增加為20%時,染色效果降低為中差。具體芽胞染色效果評價見表1。

表1 不同濃度孔雀綠及浸染時間組合下芽胞染色效果評價

3 討論

經(jīng)過對不同孔雀綠濃度及浸染時間組合下芽胞染色效果進行對比得知,以10%孔雀綠溶液作為初染劑,浸染10 min時達(dá)到最佳的染色效果,芽胞菌體紅綠顏色對比鮮明、背景清晰；孔雀綠濃度低或浸染時間過短,會使芽胞著色淺淡,與菌體的橙紅色對比不鮮明；而孔雀綠濃度過高或浸染時間增加,會使芽胞的綠色過于濃重,也會使菌體上殘留的孔雀綠難以被徹底沖洗掉,從而與菌體復(fù)染上的紅色疊加為紅褐色或褐灰色,降低芽胞菌體紅綠對比度,染色效果不佳。

目前已有不少文獻對芽胞染色過程進行了改進,如將涂片在初染時進行沸水浴加熱[7]、烘箱加熱[8]、濾紙覆蓋加熱法[9-10]、微波爐加熱[11-13]、酸水解[6,14]、在初染液中添加適量Tergitol 7等表面活性劑[15],或?qū)ふ也煌旧珓┑淖罴褲舛扰浔燃叭旧珪r間配比[16-18]等,簡化并優(yōu)化實驗操作步驟,使染色效果更為突出。

本研究創(chuàng)新性地采用浸染的方法對芽胞染色實驗的初染過程進行了改良,并找出了浸染所需的最佳孔雀綠濃度及染色時間,使得實驗操作更加簡便,學(xué)生容易掌握,成功率高,并且操作安全,對環(huán)境無污染?？墒箤W(xué)生觀察到芽胞與菌體之間的顯著染色對比,利于其區(qū)分芽胞的位置及結(jié)構(gòu),達(dá)到了提高微生物實驗教學(xué)效果的目的。

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Exploration on a modified dip-staining method for bacterial spores staining

Zheng Dongchao, Fan Jia, Wang Yuhao, Zhang Jie, Zhao Jian,Yang Xin, Wang Hong

(School of Life Sciences,Sichuan University,Chengdu 610065,China)

Continued-heating malachite green dye is usually used in traditional spore staining method to color the spore.This method is difficult to operate and has a low successful rate.Besides,the malachite green dye is poisonous,when being heated it could splash then cause pollutions. This study uses the dip-staining method to improve the traditional spore staining method,and compares the staining effects between different malachite green concentrations and different staining time.The results show that the best staining results could be achieved with 10% malachite green dye,staining 10 minutes.This improved method is easy to operate,the staining effect is obvious, and the structure of mycelium and spore is easier to be distinguished and much more safe and green.

bacteria spore staining; dip-staining method; malachite green

2014- 05- 05

四川大學(xué)實驗技術(shù)項目(2015-103)

鄭冬超(1985—),女,河北石家莊,博士,實驗師,現(xiàn)主要從事普通生物學(xué)實驗教學(xué)

E-mail：dongchao_zheng@scu.edu.cn.

汪紅(1961—),女,四川成都,高級實驗師,現(xiàn)主要從事微生物學(xué)實驗教學(xué).

E-mail：wh002008@163.com

G642.423

B

1002-4956(2015)7- 0191- 02