HPLC法同時(shí)測(cè)定楚雄臭菜中槲皮素和山奈酚的含量

郭向群，曹建民，張志琴

0 引言

楚雄臭菜是云南省楚雄地區(qū)彝族群眾廣泛食用的一種木本植物的幼嫩枝葉或芽尖，能清降火氣或熱毒，具有藥食兩用的價(jià)值。2009年5月，中國(guó)科學(xué)院昆明植物所的李恒研究員鑒定為馬鞭草科大青屬“西垂茉莉 Clerodendrum griffithianum C.B.Clarke”［1］。筆者在對(duì)楚雄臭菜中的有效成分進(jìn)行分離鑒定后，發(fā)現(xiàn)楚雄臭菜中含有槲皮素和山奈酚等黃酮類(lèi)化合物。槲皮素具有祛痰、止咳、降壓、降血脂等作用［2］，可抑制多種惡性腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)［3-4］;山奈酚具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗癌等多種功效［5］;槲皮素和山奈酚具有明顯的降血壓、降血脂、抗氧化劑等作用［6］。目前，楚雄臭菜中槲皮素和山奈酚的含量測(cè)定未見(jiàn)報(bào)道。本研究建立了HPLC法同時(shí)測(cè)定楚雄臭菜中槲皮素和山奈酚的含量，該方法分離度高，重復(fù)性好，簡(jiǎn)便易行，可作為楚雄臭菜藥材的含量測(cè)定方法，為楚雄臭菜進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀LC-20A(日本島津)，二級(jí)管陣列檢測(cè)器SPD-M20A(日本島津)，自動(dòng)進(jìn)樣器SIL-20AC(日本島津);SartoriusAGBS110S電子天平(北京賽多利斯天平有限公司);As10200型超聲波清洗機(jī)(北京華博科技制造有限公司)。

1.2 試藥 槲皮素對(duì)照品(批號(hào):100081-200907，中國(guó)食品藥品檢定研究院)，山奈酚對(duì)照品(批號(hào):110861-200808，中國(guó)食品藥品檢定研究院);乙腈為色譜純;水為超純水;其他試劑均為分析純。楚雄臭菜藥材采自云南省楚雄州各縣(市)，經(jīng)鑒定為楚雄臭菜。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件［7］色譜柱:InertSustain C18(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈(A)－0.3%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0 ～5.00 min，A∶B=20∶80;5.01 ～12.00 min，A∶B=40∶60;12.01 ～25.00 min，A∶B=15∶85)。檢測(cè)波長(zhǎng):360 nm;流速:0.8 mL/min;柱溫:30℃;進(jìn)樣量10 μL。對(duì)照品溶液、供試品溶液的色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 HPLC色譜圖注:A.對(duì)照品溶液，B.樣品溶液;1.槲皮素，2.山奈酚

2.2 對(duì)照品制備 分別取槲皮素和山奈酚對(duì)照品，精密稱(chēng)定，用甲醇超聲(功率:250 W，頻率:40 kHz)溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL分別含槲皮素0.170 mg和山奈酚0.190 mg的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取儲(chǔ)備液1 mL，稀釋為10 mL，搖勻，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液即得。

2.3 供試品溶液制備 取楚雄臭菜粗粉(過(guò)24目篩)2 g，精密稱(chēng)定，精密加入甲醇－25%鹽酸(4∶1)混合溶液50 mL，精密稱(chēng)定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，續(xù)濾液再經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察 按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，精密吸取混合對(duì)照品溶液 2、4、8、10、12、16 μL，分別注入液相色譜儀，測(cè)定槲皮素與山奈酚峰面積，以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，相關(guān)組分的回歸方程、回歸系數(shù)、線性范圍見(jiàn)表1。結(jié)果表明，在該色譜條件下，槲皮素和山奈酚的進(jìn)樣量在線性范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

表1 槲皮素和山奈酚的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍

2.5 精密度試驗(yàn) 吸取含槲皮素0.017 mg/mL和山奈酚0.019 mg/mL的同一份混合對(duì)照品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)測(cè)定 6 次，測(cè)得槲皮素峰面積的RSD為1.88%，山奈酚的RSD為1.67%，結(jié)果表明，所用儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取同一批楚雄臭菜粗粉(過(guò)24目篩)6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件吸取供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀進(jìn)行分析，測(cè)得槲皮素和山奈酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為1.23%和0.56%，結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，分別于配制后 0、2、4、6、8、12、24 h 進(jìn)樣 10 μL，測(cè)得槲皮素和山奈酚的峰面積RSD分別為0.85%和1.32%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱(chēng)取已知槲皮素和山奈酚含量的楚雄臭菜粗粉(過(guò)24目篩)6份，每份約2 g，分別加入槲皮素與山奈酚對(duì)照品適量，按“2.3”方法制備供試品溶液。測(cè)得槲皮素的平均回收率為99.33%(n=6)，RSD=1.33%;山奈酚的平均回收率為 99.48%(n=6)，RSD=1.85%。見(jiàn)表2。

2.9 樣品的測(cè)定 取采自云南楚雄不同地區(qū)的6批樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，分別計(jì)算槲皮素和山奈酚的含量。見(jiàn)表3。

表2 槲皮素和山奈酚加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

表3 云南楚雄產(chǎn)幾種臭菜中槲皮素和山奈酚含量的測(cè)定結(jié)果(mg/g)

3 討論

3.1 提取溶劑的選擇 黃酮類(lèi)化合物多有酸性，而藥材中的槲皮素和山奈酚多以苷的形式存在［3］，為了使槲皮素游離，常在提取溶劑中加入一定量的酸進(jìn)行水解。筆者考察了甲醇、甲醇－4%硫酸(4∶1)、甲醇 －37%鹽酸(4∶1)、甲醇 －25%鹽酸(v/v)(4∶1)、甲醇 －鹽酸(25 mL→100 mL)等溶劑。結(jié)果顯示，甲醇－25%鹽酸(4∶1)為提取溶劑時(shí)提取效果最優(yōu)。

3.2 提取方法選擇 考察了浸漬、回流、連續(xù)回流、超聲等提取方法，結(jié)果顯示，加熱回流提取效果較好，因此采用回流法提取。

3.3 流動(dòng)相系統(tǒng)選擇 考察了甲醇－水、甲醇－0.1%磷酸、乙腈－0.1%磷酸、乙腈－0.3%磷酸等度和梯度洗脫，結(jié)果用乙腈－0.3%磷酸梯度洗脫進(jìn)行分離效果較好。

3.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 以二極管陣列檢測(cè)器對(duì)槲皮素、山奈酚對(duì)照品混合溶液在上述色譜條件下，于波長(zhǎng)200～400 nm繪出3D圖譜，結(jié)果槲皮素對(duì)照品溶液在372 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，山奈酚對(duì)照品溶液在368 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，其HPLC色譜響應(yīng)較大，同時(shí)各色譜峰分離度較好，為兼顧槲皮素和山奈酚進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，選擇365 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.5 建立的方法能快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確地測(cè)定楚雄臭菜幼嫩葉中槲皮素和山奈酚的含量，該方法的穩(wěn)定性、重復(fù)性和回收率均較好，對(duì)楚雄臭菜藥材的質(zhì)量控制有實(shí)際的應(yīng)用意義，為楚雄臭菜藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

3.6 根據(jù)色譜圖可知，楚雄臭菜除槲皮素和山奈酚外，尚有很多未知色譜峰，有待進(jìn)一步分析研究。

［1］ 徐寫(xiě)秋，劉本璽.“楚雄臭菜”的民族植物學(xué)特征和持續(xù)利用研究［J］.綠色科技，2012，(6):107-108.

［2］ 崔山風(fēng).槲皮素的研究進(jìn)展［J］.西北藥學(xué)雜志，2006，21(6):279-281.

［3］ 游璐茜，吳振，趙玉芬.木中槲皮素、山奈酚和楊梅素含量的高效液相色譜法測(cè)定［J］.化學(xué)通報(bào)，2009，(10):896-900.

［4］ 肖潔，牛國(guó)敏，尹松梅，等.槲皮素聯(lián)合硼替佐米或雷利度胺對(duì)抑制HL-60細(xì)胞增殖的影響［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2014，30(14):2196-2199.

［5］ 陳育華，周克元，袁漢堯，等.山奈酚藥效的研究進(jìn)展［J］.廣東藥學(xué)，2010，31(8):1064-1066.

［6］ 典靈輝，吳鐵，呂應(yīng)年，等.HPLC法測(cè)定黃芪中槲皮素和山奈酚的含量［J］.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2007，23(17):2550-2551.

［7］ 覃蘭芳，胡琦敏，賴(lài)茂祥，等.HPLC同時(shí)測(cè)定小蠟樹(shù)葉中槲皮素與山奈素的含量［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19(2):107-109.