黑小麥麩皮色素結(jié)構(gòu)分離及鑒定

楊兆艷，孫元琳，田艷花

(1.山西藥科職業(yè)學(xué)院食品工程系,山西太原 030031;2.運城學(xué)院生命科學(xué)系,山西運城 044000)

黑小麥麩皮色素結(jié)構(gòu)分離及鑒定

楊兆艷1，孫元琳2，田艷花1

(1.山西藥科職業(yè)學(xué)院食品工程系,山西太原 030031;2.運城學(xué)院生命科學(xué)系,山西運城 044000)

本文以黑小麥麩皮為原料,通過大孔吸附樹脂純化浸提液,采用光譜分析對該色素進(jìn)行初步鑒定,層析分離色素,HPLC鑒定。結(jié)果表明:黑小麥麩皮色素為水溶性花色苷類色素,至少含有三種花色苷。本研究結(jié)果可以為黑小麥麩皮色素的結(jié)構(gòu)分離及深入分析奠定基礎(chǔ)。

黑小麥麩皮,色素 ,結(jié)構(gòu),分離,鑒定

作為食品添加劑,天然色素與合成色素相比較,除可以著色外,還具有安全、營養(yǎng)、保健等優(yōu)勢,因此其取代合成色素已成必然。目前以天然色素為主導(dǎo)的市場,國外發(fā)展迅速。目前,我國也開發(fā)出幾十種天然色素,有百余家生產(chǎn)企業(yè),年產(chǎn)量超過萬噸。但由于天然色素性質(zhì)不穩(wěn)定,生產(chǎn)技術(shù)不夠先進(jìn),使用受到限制。因此生產(chǎn)高度純化的天然色素,同時對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定,可以為天然色素產(chǎn)品精制、生物活性的研究及其應(yīng)用奠定基礎(chǔ)[1]。

研究中采用黑小麥為河?xùn)|烏麥(526),該原料是山西運城小麥研究開發(fā)中心近年來選育成功的黑小麥新品種[2]。目前,國內(nèi)育種成功的黑小麥有十幾個品種,不同品種黑小麥中色素的種類不同。當(dāng)前,國內(nèi)外對于黑小麥的營養(yǎng)成分、穩(wěn)定性及抗氧化活性研究較多[3-8],對某些黑小麥品種色素的結(jié)構(gòu)分離鑒定也有研究報道[9-12],但對于河?xùn)|烏麥(526)色素結(jié)構(gòu)的分離及分析鑒定幾乎為空白。本研究課題以黑小麥麩皮為原料,將純化后的黑小麥麩皮色素通過紙層析和薄層層析法分離,并對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步鑒定,可以為黑小麥麩皮及其色素的深入研究及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑小麥麩皮 河?xùn)|烏麥526麩皮,山西省運城市黑麥黑色食品有限公司。

無水乙醚、丙酮、乙酸、丁酸、石油醚、正丁醇、95%乙醇、甲醇、鹽酸、異丁醇、乙酰丙酮等均為分析純試劑;磷酸、乙腈等為色譜純;HZ801大孔吸附樹脂、新華3號濾紙、聚酰胺薄膜(規(guī)格是10cm×10cm),上海摩速科學(xué)器材有限公司。

1100型高效液相色譜儀 Agilent;SZ-93自動純水蒸餾水器 上海亞榮生化儀器廠;移液槍Tripette(5～50μL) 德國普蘭德;722N可見分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司;DHZ-A恒流泵與BSZ-100部分自動收集器 分析儀器廠;Z系列(?1.0x20)層析柱 上海瀘西分析儀器廠;HHS型電熱恒溫水浴鍋 天津市華北實驗有限公司;SHZ-D(Ⅲ型)環(huán)水式多用真空泵 鞏義市予華儀器有限公司。

1.2 實驗方法

表1 紙層析展開劑Table 1 Paper chromatography developing solvent

表2 聚酰胺薄膜薄層層析展開劑Table 2 Polyamide film TLC developing solvent

1.2.1 黑小麥麩皮色素的提取 黑小麥麩皮→粉碎→過篩(40～60目)→超聲波提取(提取劑70%乙醇,料液比1∶16,超聲時間12min,超聲功率500W)[13]→提取液→抽濾→真空濃縮(溫度≤45℃)→色素溶液(樣液1)

1.2.2 黑小麥麩皮色素的純化 樣液1→配制溶液(pH3.0,吸光度0.800,)→大孔吸附樹脂純化色素(吸附條件:吸光度0.800,pH3.0,不含鹽類離子,溫度50℃,吸附流速1BV/h;解吸條件:70%乙醇,pH1.0,溫度30℃,解吸流速3BV/h)[13]→收集純化液(樣液2)→減壓濃縮→色素溶液(樣液3)

1.2.3 黑小麥麩皮色素的光譜特性 用0.01%鹽酸-甲醇溶液將樣液3稀釋10倍,在240～550nm的波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描,分析其光譜特征。

1.2.4 黑小麥麩皮色素紙層析分離實驗 采用新華3號濾紙,分別采用樣液1、樣液2、樣液3,經(jīng)過篩選,按照表1中展開劑展開。

1.2.5 黑小麥麩皮色素薄層層析分離實驗 采用聚酰胺薄膜,分別采用樣液1、樣液2、樣液3,經(jīng)過篩選,選擇表2中展開劑進(jìn)行實驗。

1.2.6 層析實驗 (具體見表3)。

表3 層析實驗條件Table 3 Experiment conditions of TLC

注:展開均在室溫條件下進(jìn)行(25～30℃)。

1.2.7 高效液相色譜檢測

1.2.7.1 色譜條件的選擇 選擇Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6mm×50mm,5μm),采用乙腈-4%磷酸作為流動相,流速為1.0mL/min,檢測波長為520nm;柱溫為25℃。

1.2.7.2 樣液的制備 樣液用層析法分離之后,分別用1%鹽酸-甲醇溶液洗脫各個色斑,洗脫液過0.45μm濾膜后吸取10μL進(jìn)樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑小麥麩皮色素的光譜特性

由圖1知,黑小麥麩皮色素在可見光區(qū)510nm處有最大吸收峰,在紫外光區(qū)310nm處也有最大吸收峰?；ㄉ赵诳梢姽鈪^(qū)的最大吸收峰位于500～540nm附近,在紫外光區(qū)位于270～320nm附近[1,14],所以可判斷該色素為花色苷類色素。

圖1 黑小麥麩皮色素光譜特性曲線圖Fig.1 Black wheat bran pigment spectral characteristic curve

2.2 層析實驗

結(jié)合表3和圖2可以分析出,條件16(純化濃縮液,固定相聚酰胺薄膜,展開劑體積比為4∶1∶5的乙醇∶正丁醇∶水、展開時間1.5h)展開效果最好,可以得到清晰的兩個斑點,分別為斑點1(Rf1=0.800,紫紅色)和斑點2(Rf2=0.678,棕色)。且經(jīng)過重復(fù)實驗驗證,該條件下分離結(jié)果比較穩(wěn)定,重現(xiàn)性較好,見表4。

表4 實驗結(jié)果Table 4 Test results

表5 黑小麥麩皮色素的Rf值Table 5 Rf values of the black wheat bran pigment

2.3 高效液相色譜檢測

圖4顯示色斑1主要含有兩種花色苷,在520nm處的峰面積分別為41.352%和58.648%,用聚酰胺薄膜不能將這兩種花色苷有效分離,說明這兩種花色苷比較接近,分別命名為ANT1和ANT2;圖5顯示,色斑2為單一色素,命名為ANT3;且ANT1、ANT2、ANT3色素峰的保留時間分別為1.731、2.190、10.070min。由于缺少標(biāo)品,未能進(jìn)一步定性及定量分析,后續(xù)研究過程中將結(jié)合標(biāo)品和多種分析手段對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定分析。

圖2 條件16層析圖像Fig.2 Tomographic image of condition 16注:樣液3,固定相為聚酰胺薄膜,展開劑為EBW,展開時間1.5h。

圖3 樣液3液相色譜圖Fig.3 Liquid chromatogram of sample solution 3

圖4 色斑1(Rf1=0.800)液相色譜圖Fig.4 Liquid chromatogram of spots 1(Rf1=0.800)

圖5 色斑2(Rf2=0.678)液相色譜圖Fig.5 Liquid chromatogram of spots 2(Rf2=0.678)

3 結(jié)論

本研究確定的層析條件為:聚酰胺為吸附劑體積比乙醇∶正丁醇∶水(4∶1∶5)為展開劑,展開時間為1.5h。該條件下得到兩個清晰斑點,比移值分別為Rf1=0.800、Rf2=0.678,經(jīng)HPLC色譜分析,斑點1(Rf1=0.800)含有兩種性質(zhì)比較接近的花色苷,命名為ANT1和ANT2,斑點2(Rf2=0.678)為單一花色苷命名為ANT3,故可推斷黑小麥麩皮色素至少含有三種花色苷。

同時,本研究還分別討論了可能影響層析分離效果的因素,影響層析分離因素主要有:吸附劑,展開劑,展開時間,點樣量和樣液純度。

本文結(jié)果將對薄層層析分離色素的方法及黑小麥麩皮色素的深入研究提供參考。 后續(xù)研究中將結(jié)合花色苷標(biāo)品及其它多種分析手段對分離得到的ANT1、ANT2及ANT3進(jìn)行更為深入的結(jié)構(gòu)分析鑒定,得到其具體詳細(xì)的結(jié)構(gòu)。

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Separation and identification of pigment extractionfrom black wheat bran

YANG Zhao-yan1,SUN Yuan-lin2,TIAN Yan-hua1

(1.Department of Food Engineering,Shanxi Pharmaceutical College,Taiyuan 030031,China;2.Department of Life Sciences,Yuncheng College,Yuncheng 044000,China)

With Hedong black wheat bran as raw material,the pigment was extracted and then purified by macroporous resin. Spectrum,TLC and HPLC were used to separate and identify the pigment. The results showed that the pigment was water-soluble anthocyanin pigment,and at least involved three anthocyanin. The results could provide some reference for the structure separation and further research of Hedong black bran pigment.

black wheat bran;pigment;structure;separation;identification

2014-09-03

楊兆艷(1981-)，女，碩士，講師，研究方向：食品科學(xué)。

山西省自然科學(xué)基金(2012011031)。

TS251.1

A

1002-0306(2015)13-0150-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.13.022