重組人骨保護素對牙周炎大鼠牙槽骨RANKL、OPG蛋白表達的影響

鐘雯怡，武岐山，高 麗，劉 琪△，陳 芳，柴松宏

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院兒童牙科，貴州遵義 563003；2.貴州省安順市人民醫(yī)院口腔科 561000)

重組人骨保護素對牙周炎大鼠牙槽骨RANKL、OPG蛋白表達的影響

鐘雯怡1，武岐山1，高 麗1，劉 琪1△，陳 芳1，柴松宏2

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院兒童牙科，貴州遵義 563003；2.貴州省安順市人民醫(yī)院口腔科 561000)

目的 探討重組人骨保護素(rhOPG)對牙周炎大鼠牙槽骨RANKL、OPG蛋白表達的影響，為rhOPG應(yīng)用于牙周炎的治療提供實驗依據(jù)。方法 選擇22只Wistar大鼠，采用隨機數(shù)字表法選擇2只健康大鼠作為健康組；其余20只作為實驗組，建立牙周炎大鼠模型，再將其分為實驗對照組(n=10)和rhOPG組(n=10)，rhOPG組大鼠于上頜第2磨牙牙周袋間隙局部注入10 mg/kg rhOPG治療。實驗對照組大鼠于相同部位注射等體積滅菌注射用水。采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP)檢測牙槽骨RANKL、OPG蛋白的表達。結(jié)果 與健康組比較，實驗組大鼠牙槽骨OPG表達水平較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而RANKL表達水平兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與實驗對照組比較，rhOPG組大鼠牙槽骨組織OPG蛋白的表達水平明顯上調(diào)，而RANKL蛋白的表達明顯下調(diào)(P<0.05)。治療后rhOPG組大鼠牙槽骨中OPG表達水平明顯高于治療前，而RANKL表達水平明顯低于治療前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 rhOPG能調(diào)節(jié)牙周炎大鼠牙槽骨RANKL、OPG的表達。

骨保護素；牙周炎；核因子κB受體活化因子；大鼠,Wistar

牙周病是成人牙齒喪失的主要原因，而牙槽骨的吸收破壞是牙周病發(fā)生、發(fā)展的病理基礎(chǔ)，亦是影響該疾病預(yù)后的主要因素。因此，再生吸收的牙槽骨已成為牙周組織工程研究的前沿領(lǐng)域和熱點課題。骨保護素(OPG)/核因子κB受體活化因子及其配體(OPG/RANKL/RANK)軸對破骨細胞的分化和活化起著重要調(diào)節(jié)作用。抑制OPG/RANKL/RANK通路可有效抑制破骨細胞的分化和激活，從而抑制牙槽骨吸收[1-3]。目前，通過阻斷OPG/RANKL/RANK通路來治療牙周炎的報道尚不多見。本課題基于OPG/RANKL/RANK軸的生物學(xué)基礎(chǔ)，以大鼠牙周炎模型作為研究載體，通過局部注射重組人OPG(rhOPG)，檢測牙槽骨組織中OPG、RANKL的表達情況，為牙槽骨的修復(fù)重建尋求新的治療途徑。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 主要試劑包括rhOPG-Fc、免疫組織化學(xué)鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP)試劑盒、兔抗鼠RANKL多克隆抗體、兔抗鼠OPG多克隆抗體，均購自武漢博士德生物工程有限公司。主要儀器：BS-110S電子分析天平(美國Napco公司)、KDC-20447低速冷凍離心機(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)、Nikon YS100生物顯微鏡[尼康儀器(上海)有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與建模 22只6周齡一級(普通級)健康雄性Wistar大鼠，平均體質(zhì)量197.4 g，由第三軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心提供[動物合格證號SCXK(渝)2007-0005]。采用10 g/L戊巴比妥(3 mg/kg)腹腔注射麻醉并固定。采用隨機數(shù)字表法選擇2只健康大鼠作為健康組；其余20只作為實驗組，采用0.2 mm結(jié)扎絲于上頜第2磨牙的頸部結(jié)扎1圈，術(shù)后大鼠高糖飲食喂養(yǎng)8周，以建立牙周炎大鼠模型。該研究獲遵義醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會批準。

1.2.2 rhOPG局部注射 實驗組大鼠均建模成功，于腹腔注射10 g/L戊巴比妥麻醉，取出結(jié)扎絲，行齦下刮治術(shù)。采用隨機數(shù)字表法將其分為實驗對照組(n=10)和rhOPG組(n=10)，予普食喂養(yǎng)1周。rhOPG組大鼠于上頜患側(cè)第2磨牙牙周袋間隙局部注入10 mg/kg rhOPG，4 d后，再行rhOPG注射，劑量同前[4]；實驗對照組大鼠于相同部位注射等體積滅菌注射用水。3 d后麻醉處死取材。

1.2.3 組織標本的制作 取大鼠上頜骨組織于4%甲醛固定，10%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣，常規(guī)梯度乙醇脫水，石蠟包埋，制備頰舌向切片，切片厚4～5 μm。

1.2.4 SP檢測 嚴格按SP試劑盒說明檢測牙槽骨RANKL、OPG蛋白的表達，用PBS代替第一抗體作陰性對照。利用IPWIN60型全自動彩色圖像分析系統(tǒng)對染色標本進行圖像分析。每個標本采用隨機數(shù)字表法隨機選取2張切片，每張切片在第2磨牙近、遠、中牙槽骨區(qū)域隨機取4個視野(×400)分析，在每個視野內(nèi)截取牙槽骨區(qū)域檢測陽性信號的強度，并計算平均光密度值，計算公式如下：平均光密度=積分光密度/測量面積。

2 結(jié) 果

2.1 健康組與實驗組大鼠的牙周炎表現(xiàn) 健康組大鼠牙槽骨無吸收表現(xiàn)。實驗組大鼠術(shù)后8周均于術(shù)區(qū)牙齦出現(xiàn)不同程度的炎性反應(yīng)，牙齦紅腫，探診出血，可探及較深牙周袋，上頜第2磨牙可探及根分叉，牙槽骨吸收超過根1/2，牙齒松動大于Ⅱ度，呈中、重度牙周炎的臨床表現(xiàn)，見圖1。

A：健康組;B:實驗組。

圖1 兩組大鼠上頜第2磨牙的比較

2.2 健康組與實驗組大鼠牙槽骨中OPG、RANKL蛋白的表達 健康組大鼠OPG陽性表達集中在大鼠牙槽骨骨細胞中，胞膜、胞質(zhì)及核膜都被染色，呈棕黃色顆粒狀。RANKL的陽性表達集中在大鼠牙槽骨骨髓基質(zhì)細胞中，胞膜、胞質(zhì)及核膜都被染色，呈棕黃色顆粒狀。與健康組比較，實驗組大鼠牙槽骨OPG表達水平較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；RANKL表達水平較高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2、3。

2.3 實驗對照組與rhOPG組大鼠牙槽骨中OPG、RANKL蛋白的表達 與實驗對照組比較，rhOPG組大鼠牙槽骨組織OPG蛋白的表達水平明顯上調(diào)，而RANKL蛋白的表達明顯下調(diào)，見圖4、5，表1。

A：健康組;B:實驗組。

圖2 大鼠牙槽骨中OPG蛋白的表達(SP×400)

A：健康組;B:實驗組。

圖3 大鼠牙槽骨中RANKL蛋白的表達(SP×400)

A：實驗對照組;B:rhOPG組。

圖4 大鼠牙槽骨中OPG的表達(SP×400)

A：實驗對照組;B:rhOPG組。

圖5 大鼠牙槽骨中RANKL的表達(SP×400)

a：P<0.05，與實驗對照組比較。

2.4 rhOPG組大鼠治療前、后牙槽骨中OPG、RANKL的表達 與治療前比較，治療后大鼠牙槽骨中OPG表達水平明顯升高，RANKL表達水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 rhOPG組大鼠治療前、后牙槽骨中OPG、RANKL平均光密度的比較(±s)

a：P<0.05，與治療前比較。

3 討 論

最近的研究揭示牙周疾病不僅是積聚細菌的作用結(jié)果，還更強調(diào)了炎癥的作用。宿主的免疫應(yīng)答是一把雙刃劍，可以消除炎癥侵襲，但過表達也會導(dǎo)致組織喪失和骨丟失[5]。上世紀中葉發(fā)現(xiàn)炎性宿主反應(yīng)導(dǎo)致的牙槽骨的喪失可以通過OPG/RANKL/RANK通路刺激破骨細胞生成及炎癥干擾導(dǎo)致的骨形成解耦聯(lián)和骨吸收。所以除了傳統(tǒng)的消除細菌的治療方式外，另一個治療途徑就是干擾OPG/RANKL/RANK軸以防止骨丟失[6-9]。

OPG/RANKL/RANK軸是重要的骨代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)，阻斷RANKL/RANK通路可以有效抑制骨的吸收。因此抑制RANKL/RANK通路為骨吸收治療研究提供新思路[10-11]。OPG是腫瘤壞死因子受體超家族成員，由成骨細胞系的基質(zhì)細胞產(chǎn)生，RANKL 屬于 TNF配體超家族成員，它可以由成骨細胞系和活化的T細胞產(chǎn)生，OPG作為一個誘騙受體與RANKL結(jié)合，競爭性地抑制RANK與RANKL作用，從而抑制了破骨細胞活性和骨的吸收[12]。骨再建是一個極其復(fù)雜的過程，包含了很多細胞、細胞因子及信號通路的相互調(diào)節(jié)、相互影響，尤其是OPG/RANK/RANKL信號通路對維護成骨細胞與破骨細胞的活性平衡起了至關(guān)重要的作用。

牙周基礎(chǔ)治療之后，大鼠的牙周情況較之前中重度牙周炎明顯改善，OPG 的表達上調(diào)，與牙周炎治療前比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，RANKL表達降低差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明炎癥減輕后，炎性細胞和淋巴細胞大大減少，在牙周病中，淋巴細胞是 RNAKL 一個特別重要的來源，但要使OPG 的表達明顯上調(diào)還得輔助rhOPG，隨基因工程的進步體外已可以合成rhOPG，它具有與生物體內(nèi)OPG相同的生物功能[13]。牙周基礎(chǔ)治療輔加局部注射rhOPG后，RANKL表達水平降低，OPG表達水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，說明OPG/ RANKL比值的變化對破骨細胞的分化與功能起了關(guān)鍵作用，OPG/RANKL的比值上升時，破骨細胞的數(shù)量和活性將下降，OPG/RANKL的比值下降時，破骨細胞的數(shù)量和活性將上升。Kadri等[14]在小鼠骨關(guān)節(jié)炎模型腹腔注射OPG,與對照組相比,骨的體積/組織比明顯增加，骨小梁的分離明顯減少，并認為OPG能夠防止軟骨的退化。但經(jīng)靜脈和皮下注射rhOPG會伴有OPG蛋白質(zhì)的部分降解,給藥不便,易產(chǎn)生耐藥性及免疫原性等不良反應(yīng)[15]。因此本實驗采用牙周局部注射給予rhOPG。很多組織產(chǎn)生OPG，包括成骨細胞、內(nèi)皮細胞、血管平滑肌等。經(jīng)基礎(chǔ)治療后雖然炎癥有所減輕，但相比牙周健康者，骨組織和結(jié)締組織均較少，因此能夠表達和分泌OPG的細胞也少，所以健康組大鼠牙槽骨中OPG表達水平仍然高于局部注射rhOPG組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

期望恢復(fù)健康牙周組織，牙槽骨的重建是關(guān)鍵，而骨重建和骨量的穩(wěn)定依賴于OPG和RANKL的平衡，OPG/RANKL/RANK軸對維護成骨細胞與破骨細胞的活性平衡是最重要的一條通路。本實驗采用了一周2次局部注射10 mg/kg rhOPG的方式證明了各組牙槽骨中OPG、RANKL免疫組織化學(xué)染色變化的對比差異，而對后期支持組織的形成情況尚未探究。rhOPG蛋白的使用量和注射次數(shù)，單獨使用還是和別的藥物聯(lián)合使用效果更佳等將是該領(lǐng)域仍需不斷探索的問題。

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Effect of recombinant human osteoprotegerin on RANKL,OPG protein expression in alveolar bone tissue of rat with periodontitis*

ZhongWenyi1,WuQishan1,GaoLi1,LiuQi1△,ChenFang1,CaiSonghong2

(1.DepartmentofPediatricDentistry,AffiliatedStomatologicHospital,ZunyiMedicalCollege,Zunyi,Guizhou563003,China;2.DepartmentofStomatology,AnshunMunicipalPeople′sHospital,Anshun,Guizhou561000,China)

Objective To investigate the effects of recombinant human osteoprotegerin(rhOPG) on RANKL,OPG protein expression in alveolar bone tissue of rats with periodontitis to provide the experimental evidence for the application of rhOPG in periodontitis treatment.Methods Totally 22 Wistar rats were enrolled.The random number table was adopted to select two healthy rats as the healthy group.The rest 20 rats were selected as the experimental group for establishing the rat models of periodontitis,and then subdivided into the experimental control group (n=10) and rhOPG group (n=10).Rats in the rhOPG group were locally injected by rhOPG 10 mg/kg at periodontal pocket gap of maxillary second molar,while those in the experimental control group were injected by sterile water for injection at the same site and some volume.The streptavidin-perosidase(SP) method was employed to detect the expression of RANKL,OPG protein in alveolar bone tissue.Results Compared with the healthy group,the expression levels of OPG in alveolar bone tissue of rats in the experimental group were lower with statistically significant difference(P<0.05),while the difference of RANKL expression levels between the two groups showed no statistical significance(P>0.05).Compared with the experimental control group,the expression level of OPG protein in alveolar bone tissue of rats in the rhOPG group was significantly up-regulated,while that of RANKL protein was significantly down-regulated(P<0.05).The OPG expression level after treatment in the rhOPG group was markedly enhanced,while the RANKL expression level was reduced compared with before treatment,the difference was statistically significant (P<0.05).Conclusion rhOPG may regulates the expression of RANKL and OPG in alveolar bone tissue of rats with periodontitis.

osteoprotegerin；periodontitis;receptor activator of nuclear factor-kappa B；rats,Wistar

貴州省科學(xué)技術(shù)基金黔科合J字[2008]2187號；貴州省衛(wèi)生廳科學(xué)技術(shù)基金項目(gzwkj2012-1-001)。 作者簡介：鐘雯怡(1978-)，碩士，副教授，主要從事牙周疾病的研究?！?/p>

，E-mail:liuqi1964@hotmail.com。

·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.14.003

R781.4

A

1671-8348(2015)14-1879-03

2015-01-10

2015-03-17)