2009-2012年河北鼠型斑疹傷寒流行概況及實(shí)驗(yàn)室調(diào)查分析

孫印旗 ，董 妥，姜 霞，王 勇，錢振宇，劉曉麗 ，張麗娟

2009-2012年河北鼠型斑疹傷寒流行概況及實(shí)驗(yàn)室調(diào)查分析

孫印旗1，董 妥2,3，姜 霞1，王 勇2,4，錢振宇1，劉曉麗1，張麗娟2

目的 對(duì)2009-2012年河北省斑疹傷寒高發(fā)地區(qū)臨床報(bào)告病例進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室調(diào)查分析。方法 按我國(guó)衛(wèi)生部《流行性和地方性斑疹傷寒診斷標(biāo)準(zhǔn)》(WS 215-2008)在臨床可疑病例高發(fā)地區(qū)設(shè)立哨點(diǎn)監(jiān)測(cè)醫(yī)院并收集病例。臨床病例進(jìn)行個(gè)案登記并進(jìn)行發(fā)病急性期及恢復(fù)期血液標(biāo)本的收集。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)按WHO推薦的立克次體血清學(xué)診斷方法-間接免疫熒光法檢測(cè)病人血清IgM和IgG特異抗體。以急性期血液DNA為模板，采用巢氏PCR擴(kuò)增斑疹傷寒群立克次體熱休克蛋白基因groEL基因并測(cè)序。通過NCBI Blast平臺(tái)同源比較序列并使用DNASTAR軟件進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果 本次調(diào)查在辛集市、定州市和遷安市共收集877例臨床報(bào)告病例，2009年報(bào)告病例數(shù)最多(441例)，遷安市病例數(shù)最多(510例)。急性期血清莫氏立克次體IgM抗體陽性率為 72.8%(73/101)，IgG陽性率為 78.2%(79/101)。12人通過血清IgG抗體4倍升高或降低明確診斷。PCR擴(kuò)增陽性率為21.7%(22/101)，成功測(cè)序的17人groEL(209 bp)基因100%同源，與其他地區(qū)序列存在較大變異，與標(biāo)準(zhǔn)株R.typhiWilmington (AY191590)核苷酸97.0%，氨基酸只有93.9%同源,進(jìn)化分析與其他菌株遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)。結(jié)論 河北省辛集、定州和遷安地區(qū)存在鼠型斑疹傷寒流行。進(jìn)一步調(diào)查傳播媒介及宿主對(duì)該病的預(yù)防控制具有重要公共衛(wèi)生意義。加強(qiáng)該病臨床診斷及鑒別診斷十分必要。

鼠型斑疹傷寒；莫氏立克次體；groEL基因；分子流行病學(xué)特征

斑疹傷寒是古老立克次體病之一，歷史上曾給人類帶來深重災(zāi)難，尤其是戰(zhàn)爭(zhēng)、貧困、自然災(zāi)害及社會(huì)動(dòng)蕩等因素極易造成該病的流行[1-2]。半個(gè)世紀(jì)以來，我國(guó)曾發(fā)生超過萬人以上3次大流行[3]。新中國(guó)成立后，該病列為法定傳染病乙類管理。斑疹傷寒主要分為體虱傳播的流行性斑疹傷寒和鼠蚤傳播的鼠型斑疹傷寒(也稱地方性斑疹傷寒)。隨著經(jīng)濟(jì)水平的提高，前者在我國(guó)基本得到控制，而后者仍在廣大農(nóng)村地區(qū)流行。2010年云南瑞麗某監(jiān)獄戒毒人員蚤傳斑疹傷寒暴發(fā)流行，76人感染發(fā)病，這是我國(guó)近年最大規(guī)模的一次流行[4]。河北省是我國(guó)斑疹傷寒主要流行區(qū)[5]，歷史上幾次大流行都波及該省。2009-2012年，該省石家莊、保定和唐山市臨床單位報(bào)告可疑斑疹傷寒病例明顯增多，但缺乏實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。對(duì)此，河北省CDC與中國(guó)CDC傳染病預(yù)防控制所合作開展了實(shí)驗(yàn)室調(diào)查分析。

1 材料與方法

1.1 病例定義與標(biāo)本采集 在河北省斑疹傷寒高發(fā)的石家莊、保定和唐山市，分別在其下轄的高發(fā)縣辛集市、定州市和遷安市，選擇辛集市新集鎮(zhèn)衛(wèi)生院，定州市人民醫(yī)院，遷安市建昌營(yíng)醫(yī)院、和遷安市楊各莊醫(yī)院作為監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)醫(yī)院，根據(jù)中華人民共和國(guó)《流行性和地方性斑疹傷寒診斷標(biāo)準(zhǔn)》(WS 215-2008)，臨床表現(xiàn)符合斑疹傷寒，實(shí)驗(yàn)室外斐試驗(yàn)OX2或OX19≥ 1∶160。 收集病例包括門診病例和住院病例。個(gè)案調(diào)查及信息采集包括年齡、性別、職業(yè)、住所、野外作業(yè)及蟲媒叮咬史、主要臨床表現(xiàn)及治療等信息。同時(shí)采集急性期和恢復(fù)期(間隔至少2～3周)非抗凝血2 mL，分離血清及血塊并-20 ℃或-40 ℃保存，后送中國(guó)CDC傳染病預(yù)防控制所無形體室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

1.2 實(shí)驗(yàn)室分析

1.2.1 血清學(xué)檢測(cè) 發(fā)熱期及恢復(fù)期血清標(biāo)本同批次檢測(cè)莫氏立克次體IgM和IgG抗體。采用WHO立克次體協(xié)作中心推薦的間接免疫熒光方法(IFA)[6]。R.typhiWilmington菌株抗原為本室保存。為鑒別診斷，血清還同時(shí)檢測(cè)了虱傳流行性斑疹傷寒立克次體R.prowazekii、蚤傳斑點(diǎn)熱群立克次體R.felis、橫賽巴爾通體B.henselae、螨傳恙蟲病東方體O.tsutsugamushi、蜱傳黑龍江立克次體R.heilongjiangenesis及Q熱病原體-貝氏考克斯體C.burnetii。鑒別診斷菌株為WHO立克次體協(xié)作中心惠贈(zèng)(法國(guó)馬賽)。 試驗(yàn)簡(jiǎn)述為：血清用3%脫脂奶粉PBS按臨界值1∶40(IgM)和1∶80(IgG)稀釋，適當(dāng)加到抗原孔內(nèi)，37 ℃作用45 min，PBS土溫洗滌2次，每次10 min，水洗5 min。每孔加適量伊文斯藍(lán)稀釋抗人IgM或IgG(美國(guó)KPL公司)抗體,37 ℃作用45 min后，按前述方法洗滌烘干，加緩沖甘油，蓋玻片密封后熒光鏡檢。正常人混合血清及斑疹傷寒病人血清分別為陰性及陽性對(duì)照。病人陽性標(biāo)本進(jìn)一步稀釋半定量試驗(yàn)。

1.2.2 熱休克蛋白groEL基因擴(kuò)增與序列分析 使用德國(guó)QIAGEN公司DNA提取試劑盒(Cat. No. 69506) 對(duì)病人急性期血塊DNA提取，按說明書操作。本室保存的莫氏立克次體L929細(xì)胞培養(yǎng)物及無菌水同步操作分別作為陽性對(duì)照及陰性對(duì)照。巢式PCR[8]外引物對(duì) Gro-1：5′- AAG AAG GA/CGT GAT AAC-3′； Gro-2：5′-ACT TCA/CGT AGC ACC-3′；內(nèi)引物對(duì)SF-1：5′-GATAGAAGAAAAGCAATGATG-3′； SR-2：5′-CAGCTATTTGAGATTTAATTTG -3′。1輪反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，39循環(huán):94 ℃變性40 s：45 ℃退火40s ，72 ℃延伸40 s。反應(yīng)72 ℃總延伸4 min。2輪反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，39循環(huán):94 ℃變性35 s：56 ℃退火35 s ，72 ℃延伸35 s，最后72 ℃總延伸4 min。預(yù)期片段為217 bp。PCR產(chǎn)物送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司雙向測(cè)序。Blast同源比較后，對(duì)差異堿基人工核實(shí)，必要時(shí)送第二家公司測(cè)序核實(shí)。選擇不同地區(qū)，不同宿主來源序列做進(jìn)化分析。進(jìn)化分析采用DNAstar MegAlign5.0(DNASTAR Inc.USA)軟件。

2 結(jié) 果

2.1 病例收集及流行病學(xué)資料 按《流行性和地方性斑疹傷寒診斷標(biāo)準(zhǔn)》,2009—2012年共收集877例臨床診斷病例(圖1)。男481例，女396例， 平均年齡20.33歲(年齡中位數(shù)12.03歲)，其中15歲以下人群發(fā)病占53.9%(473例)；職業(yè)以農(nóng)民為主，共309例(占35.2%)，其次為散居兒童266例(占30.3)、學(xué)生164例(占18.7%)和托幼兒童91例(占10.4%)。辛集市、定州市和遷安市分別報(bào)告155例、212例和510例和。2009年報(bào)告病例最多，為441例。調(diào)查地區(qū)以遷安市病例數(shù)最多，共報(bào)告510例。病例均為不明原因高熱排除其他可能急性傳染病病例。對(duì)87例病例個(gè)案調(diào)查結(jié)果顯示，病人臨床癥狀較輕，除1例外，其他都無并發(fā)癥，經(jīng)抗立克次體治療后全部痊愈，未出現(xiàn)死亡。97.9%(85/87)病例發(fā)病前20 d內(nèi)無外出史，也沒有相關(guān)病例接觸史。

圖1 2009-2012年河北省斑疹傷寒調(diào)查地區(qū)臨床病例分布

Fig.1 Incidences of clinical diagnostic murine typhus from Hebei Province, 2009-2012

2.2 血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果 877病例中，101人采集到急性期血液，17人(遷安12人，定州市5人)采集到恢復(fù)期血液。當(dāng)?shù)蒯t(yī)院對(duì)急性期血清進(jìn)行外斐試驗(yàn)33例OX2≥ 1∶160；68例OX19≥ 1∶160。本調(diào)查IFA急性期血清莫氏立克次體IgM抗體陽性率為 72.8%(73/101)，平均幾何滴度GMT為104。最高滴度為1∶320， IgG陽性率為 78.2%(79/101)，平均幾何滴度GMT為180,最高滴度為1∶640，在17份恢復(fù)期血清中，7人IgG抗體4倍升高，最高1∶1 280。5人IgG抗體4倍降低，最低1∶20。故12人血清學(xué)明確診斷，而另5人IgG抗體陽性沒有發(fā)生4倍改變。此外，血清標(biāo)本還進(jìn)行了流行性斑疹傷寒群立克次體R.prowazekii、蚤傳斑點(diǎn)熱立克次體R.felis、蚤傳橫賽巴爾通體B.henselae、螨傳恙蟲病東方體O.tsutsugamushi、蜱傳黑龍江立克次體R.chaffeensis和Q熱病原體-貝氏考克斯體C.burnetii抗體檢測(cè)，結(jié)果顯示上述抗體在臨界值滴度沒有發(fā)現(xiàn)與莫氏立克次體有交叉反應(yīng)。

2.3 PCR擴(kuò)增及序列分析 101例病人急性期血液DNA， 22人巢氏PCR擴(kuò)增陽性,這22人急性期血清IgM抗體均陽性， 7例血清診斷病例。22例PCR陽性產(chǎn)物，17人(辛集10人、遷安2人，定州市5人)測(cè)序成功。序列比較發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)檢測(cè)到的莫氏立克次體熱休克蛋白基因(209 bp)100%同源。然而，該基因與GenBank其他地區(qū)序列有較大變異，與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株R.typhiWilmington (AY191590)核苷酸97.0%同源，氨基酸只有93.9%同源。與R.typhiWilmington比較，有11處核苷酸發(fā)生改變,包括331-333位置的AAA被TCT置換、334/442/497位置的G/G/T被A/T/C取代。339位缺失A，而391/419/441/442插入T/C/C/G。進(jìn)化分析顯示，該地區(qū)莫氏立克groEL基因與其他分離株關(guān)系較遠(yuǎn)(圖2)。

圖2 河北地區(qū)R.typhii groEL基因進(jìn)化分析

Fig.2 Phylogenetic analysis ofR.typhiigroELgenes identified in Hebei Province

3 討 論

盡管斑疹傷寒是一古老立克次體病，但在世界貧困地區(qū)及某些發(fā)展中國(guó)家仍有暴發(fā)流行[8]，如1995年的喀麥隆曾發(fā)生流行性斑疹傷寒。我國(guó)近年最大規(guī)模的暴發(fā)流行就是云南瑞麗某監(jiān)獄發(fā)生的地方性斑疹傷寒[4]。該病不僅是東南亞地區(qū)重要立克次體病之一[9-11],也是旅游人群獲得性感染的重要急性發(fā)熱性疾病[12]。

按美國(guó)CDC立克次體診斷標(biāo)準(zhǔn)，本調(diào)查明確了27例河北3地臨床報(bào)告斑疹傷寒實(shí)驗(yàn)室診斷(15例分子生物學(xué)確診及12例血清學(xué)診斷)，占臨床報(bào)告病例的26.7%(27/101)。盡管急性期IgM抗體陽性率高達(dá) 72.8%(73/101)，然而，目前國(guó)際同行對(duì)該抗體在診斷中的作用還沒有統(tǒng)一認(rèn)識(shí)，如果按我國(guó)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)室確診病人將提高一倍。通過本調(diào)查，我們認(rèn)為外斐試驗(yàn)仍具有一定的初篩診斷價(jià)值。分子流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)該地莫氏立克次體groEL基因與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株R.typhiWilmington無論核苷酸還是氨基酸均有較大變異。作為高溫環(huán)境應(yīng)急蛋白，groEL基因與立克次體致病性相互關(guān)系還不清楚。

本調(diào)查無論從臨床還是實(shí)驗(yàn)室分析均確證了河北斑疹傷寒的存在。加強(qiáng)該病的認(rèn)識(shí)及必要的實(shí)驗(yàn)室診斷及鑒別診斷，對(duì)病人及時(shí)治療,避免多器官受累,病死率增加具有一定的臨床意義。疾病監(jiān)測(cè)組織有必要進(jìn)一步開展宿主及媒介監(jiān)測(cè)，為有效防控提供必要的科學(xué)依據(jù)。加強(qiáng)宣傳，提高民眾對(duì)該類疾病的預(yù)防知識(shí)，如家居環(huán)境滅鼠、防止鼠蚤叮咬等均可降低該病患病風(fēng)險(xiǎn)。

(致謝：本文對(duì)辛集市新集鎮(zhèn)衛(wèi)生院，遷安市建昌營(yíng)醫(yī)院、遷安市楊各莊醫(yī)院，定州市人民醫(yī)院等監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)醫(yī)院的工作人員對(duì)病例收集及標(biāo)本采集等表示感謝，對(duì)遷安市、定州市及辛集市疾病預(yù)防控制中心所有參與現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查人員及直屬鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院防疫人員對(duì)該項(xiàng)工作給與的支持與幫助一并表示感謝。)

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Epidemiological characterizes and laboratory investigation of endemic typhus in Hebei Province, 2009-2012

SUN Yin-qi1,DONG Tuo2,3,JIANG Xia1,WANG Yong2,4,QIAN Zhen-yu1,LIU Xiao-li1,ZHANG Li-juan2

(1.CenterforDiseaseControlandPreventionofHebeiProvince,Shijiazhuang050021,China; 2.NationalInstituteforCommunicableDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China; 3.SchoolofPublicHealth,HarbinMedicalUniversity,Harbin150081,China; 4.CollegeofAnimalScience&Technology,ShiheziUniversity,Shihezi832003,China)

In case of increasing the number of murine typhus cases from hospitals in Hebei Province, a joint investigation was conducted by the National Institute for Communicable Disease Control and Prevention, China CDC and Centers for Disease Control and Prevention of Hebei Province during 2009-2012. Based on the criteria of "Diagnostic criteria for epidemic typhus and endemic typhus (WS215-2008)" issued by Ministry of Health of The People's Republic of China on Feb 28, 2008, 877 clinical diagnostic cases were recruited from Xinji City, Dingzhou City and Qianan City and 101 blood samples from acute stage of illness and 17 blood samples from convalescence of illness were collected respectively, IgM and IgG antibodies againstRickettsiatyphiin sera were tested by immunofluorescence assays (IFA). Nested PCR targetedR.typhigroELgene was performed using acute stage blood clots DNA as temples and phylogenetic analysis was conducted based on thegroELgene. Epidemiological data indicated the highest annual incidence was 2009 with 441 cases and the highest areas were Qianan City with 510 cases. Of the acute phase sera, 72.8% (73/101) were IgM positive and 78.2% (79/101) were IgG positive. A 4-fold seroconversion in the IgG antibody titer was observed in 12 patients (4-fold increase in 7 patients and 4-fold decrease in 5 patients). The 21.7% (22/101) of acute stage blood clot DNA were nested PCR positive. Sequence analysis showed the partial sequence ofgroELgenes from 17 patients were 100% identity for each other. Compared with the reference stainR.typhiWilmington (AY191590), only 97.0% of nucleotide homology and 93.9% amino acid homology were noticed and phylogenetic analysis indicated thegroELgenes tested in the study were far from other sequences identified in other areas of the world. Here, we concluded that the reemerging murine typhus was confirmed in most areas of Hebei Province, China, and diagnosis and differential diagnosis of theR.typhiinfection should be emphasized in hospitals.

murine typhus;Rickettsiatyphi;groELgene; molecular characterizes

國(guó)家973計(jì)劃基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(No.2010CB530206) 及“十二五”傳染病重大專項(xiàng)課題(No.2008ZX10004-008、No.2012ZX10004215)聯(lián)合資助。(孫印旗，董妥有同等貢獻(xiàn))

張麗娟， Email:zhanglijuan@icdc.cn

1.河北省疾病預(yù)防控制中心,石家莊 050021; 2.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所,北京 102206; 3.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，哈爾濱 150081; 4.新疆石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,石河子 832003

Supported by the National Basic Research Program of China (973 Program No. 2010CB530206) and the National Key Science and Technology Projects of China (Nos. 2008ZX10004-008 and 2012ZX10004215)

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.06.012

R376

A

1002-2694(2015)06-0552-04

2015-02-28；

2015-03-30