弓形蟲核苷三磷酸水解酶-II真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

陳 鐳,李成朋,陳 弟,趙徐寒暉,蔣 凱,林佳鑫,劉陽(yáng)陽(yáng),胡 昕,譚 峰

弓形蟲核苷三磷酸水解酶-II真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

陳 鐳1,李成朋1,陳 弟1,趙徐寒暉1,蔣 凱1,林佳鑫2,劉陽(yáng)陽(yáng)2,胡 昕2,譚 峰3

目的 構(gòu)建弓形蟲核苷三磷酸水解酶-II(NTPase-II)基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-NTPase-II并在COS-7細(xì)胞中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。方法 以pBAD-HisB-NTPase-II質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增NTPase-II目的基因，將其克隆到pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體中，雙酶切及測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒。陽(yáng)離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞并經(jīng)SDS-PAGE和Western Blot檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。結(jié)果 經(jīng)鑒定，弓形蟲pcDNA3.1(+)-NTPase-II核酸疫苗質(zhì)粒構(gòu)建成功。以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞后，轉(zhuǎn)染細(xì)胞可成功地表達(dá)弓形蟲NTPase-II蛋白。結(jié)論 證實(shí)了弓形蟲NTPase-II蛋白能在真核細(xì)胞中表達(dá)，為該基因的核酸疫苗研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

剛地弓形蟲; 核苷三磷酸水解酶;真核表達(dá)

剛地弓形蟲是一種廣泛寄生于人和溫血?jiǎng)游锏臋C(jī)會(huì)致病性原蟲，由于其復(fù)雜的生活史、感染方式和致病機(jī)制，它對(duì)人類的危害也日益受到重視。然而，迄今為止尚未獲得理想的治療藥物[1]。近年來，弓形蟲疫苗和免疫保護(hù)性研究已逐漸引起了重視，并認(rèn)為疫苗接種將是預(yù)防弓形蟲病的最佳策略[2]。

剛地弓形蟲屬于嘌呤營(yíng)養(yǎng)缺陷型，因此必須從宿主細(xì)胞直接獲取嘌呤，這是弓形蟲細(xì)胞內(nèi)寄生的原因。體外研究發(fā)現(xiàn)[3], 弓形蟲產(chǎn)生的核苷三磷酸水解酶(nucleoside triphosphate hydrolase，NTPase)在二巰基化合物的激活作用下， 能連續(xù)水解所有的三磷酸核苷和三磷酸脫氧核苷至單磷酸形式。在宿主細(xì)胞內(nèi)，弓形蟲正是以此形式水解宿主細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷(ATP)，以合成自身生存所必需的嘌呤核苷酸[4]。因此，弓形蟲NTPase有望成為潛在的疫苗靶點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建pcDNA3.1(+)-NTPase-II重組質(zhì)粒，并采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，觀察弓形蟲NTPase-II蛋白表達(dá)情況，為下一步研究重組質(zhì)粒在動(dòng)物體內(nèi)的免疫效果奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒、細(xì)胞 本實(shí)驗(yàn)所用菌株、質(zhì)粒與細(xì)胞若無特別說明，均由溫州醫(yī)科大學(xué)寄生蟲學(xué)教研室保存，包括：大腸埃希菌(E.coli)DH5α，原核表達(dá)質(zhì)粒pBAD-HisB-NTPase-II，以及COS-7細(xì)胞。pcDNA3.1(+)載體購(gòu)自上海英濰捷基公司。

1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶XmaI、SpeI購(gòu)自大連寶生物有限公司；T4 DNA連接酶、2×PCR 聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒購(gòu)自上海晶美生物技術(shù)有限公司；小量質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自寧波中鼎生物技術(shù)有限公司, DNA 凝膠回收試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)有限公司；高糖型DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清等購(gòu)自Gibco公司；Lipofecter脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑、細(xì)胞裂解液NP-40購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；重組弓形蟲NTPase-II蛋白、鼠源抗弓形蟲NTPase-II單抗由溫州醫(yī)科大學(xué)寄生蟲學(xué)教研室制備保存；HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG購(gòu)自Sigma公司。

1.3 PCR擴(kuò)增TgNTPase-II編碼基因 根據(jù)TgNTPase-II基因序列(GenBank: L39079.1)設(shè)計(jì)引物。上游引物：5′-TCC CCC CGG GAC AGA CTC ATC GTC ACT CCG G-3′；下游引物：5′-GGA CTA GTT CAC AGA TTG TGA GAA TAT CCC G-3′。劃線處分別為XmaI與SpeI酶切位點(diǎn)。引物由上海英濰捷基公司合成。以原核表達(dá)質(zhì)粒pBAD-HisB-NTPase-II為模板，PCR擴(kuò)增NTPase-II編碼基因。PCR條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃45 s，55 ℃45 s，72 ℃90 s，循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.4 真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建 將上述PCR產(chǎn)物與載體pcDNA3.1(+)以XmaI、SpeI分別進(jìn)行雙酶切、T4連接酶連接，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-NTPase-II。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后挑取克隆進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，隨后將鑒定的陽(yáng)性克隆送上海英濰捷基公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。對(duì)于測(cè)序正確的克隆提取質(zhì)粒保存于-20 ℃中備用。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 以5% CO2、37 ℃常規(guī)培養(yǎng)COS-7細(xì)胞于DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、100 μg/mL青鏈霉素及谷氨酸)中，待細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)，按5×105個(gè)細(xì)胞/孔接種6孔板。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄去原培養(yǎng)基，PBS清洗一次后按2 mL/孔換入不含抗生素與谷氨酸的DMEM培養(yǎng)基。將保存的pcDNA3.1(+)-NTPase-II質(zhì)粒調(diào)整濃度后按3 μg/孔加入，根據(jù)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒操作步驟轉(zhuǎn)染細(xì)胞。以pcDNA3.1空載體作為陰性對(duì)照。各組于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5～6 h，棄去含有Lipofecter脂質(zhì)體的培養(yǎng)液。加入正常細(xì)胞培養(yǎng)基2 mL/孔繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.6 Western Blot分析表達(dá)產(chǎn)物 培養(yǎng)48 h后，收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞提取總蛋白。將pcDNA3.1-NTPase質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、pcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)染組以及陽(yáng)性對(duì)照組(重組NTPase-II蛋白)進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳后，以抗弓形蟲NTPase-II單抗作為一抗，HRP標(biāo)記的抗小鼠IgG為二抗進(jìn)行Western blot分析。

2 結(jié) 果

2.1 PCR產(chǎn)物擴(kuò)增目的片段 對(duì)PCR擴(kuò)增出的產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，證實(shí)所擴(kuò)增片段約為1 800 bp，其大小與目的片段相符(圖1)。

Lane M: DNA marker; Lane 1: PCR products of NTPase-II.

2.2 pcDNA3.1(+)-NTPase-II重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 以XmaI與SpeI分別雙酶切PCR產(chǎn)物和載體后進(jìn)行T4連接酶連接，篩選出陽(yáng)性克隆質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后獲得約5.6 kb和 1.8 kb兩條電泳條帶，其大小與載體片段和目的片段長(zhǎng)度相符(圖2)。同時(shí)，測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

Lane M: DNA marker; Lane 1: NTPase-II digested byXmaI andSpeI.

圖2 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定

Fig.2 Identification of recombinant plasmids digested byXmaI andSpeI

2.3 Western blot分析重組質(zhì)粒體外表達(dá) pcDNA3.1(+)-NTPase-II重組質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，48 h后收集裂解細(xì)胞，以本實(shí)驗(yàn)室前期制備的特異性單克隆抗體進(jìn)行Western blot檢測(cè)。結(jié)果表明，與陽(yáng)性對(duì)照相同，實(shí)驗(yàn)組在約70 kDa處有一條特異條帶，而陰性對(duì)照組未顯示有目的條帶(圖3)，從而證實(shí)本實(shí)驗(yàn)中所構(gòu)建的pcDNA3.1(+)-NTPase-II重組質(zhì)粒可在真核表達(dá)體系中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。

Lane 1: Positive control; Lane 2: Transfected with pcDNA3.1-NTPase-II; Lane 3: Negative control (pcDNA3.1 empty plasmid).

圖3 Western blot 鑒定

Fig.3 Western blot analysis of the recombinant protein

3 討 論

本研究針對(duì)弓形蟲NTPase-II成功構(gòu)建了真核重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-NTPase-II。該質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染COS-7宿主細(xì)胞后，經(jīng)Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)可在細(xì)胞中成功表達(dá)。弓形蟲的發(fā)育屬嘌呤營(yíng)養(yǎng)缺陷型——無法通過從頭途徑合成嘌呤。而通過補(bǔ)救合成途徑從宿主細(xì)胞直接獲取嘌呤這一途徑常常由于納蟲泡膜的分隔作用而無法實(shí)現(xiàn)。弓形蟲NTPase存在于速殖子期的膜表面[5]，占速殖子期整個(gè)蟲體蛋白的2%～8%[6]。當(dāng)侵入宿主細(xì)胞后，該酶會(huì)被分泌入納蟲泡的網(wǎng)狀管腔系統(tǒng)中，經(jīng)二巰基化合物(如DTT)的激活進(jìn)而連續(xù)水解所有的三磷酸核苷、三磷酸脫氧核苷至單磷酸，并同時(shí)合成維持自身生存所必需的嘌呤核苷酸。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，特異性抗弓形蟲NTPase-II蛋白單克隆抗體可顯著抑制酶活性、降低蟲株在宿主細(xì)胞內(nèi)的增殖速度[7]。由此可見，NTPase是細(xì)胞內(nèi)寄生的蟲體獲取嘌呤的一種重要酶類，在弓形蟲的寄生、繁殖方面具有重要意義，并是一種潛在的、可用于開發(fā)弓形蟲病防治藥物或疫苗的新靶點(diǎn)。

弓形蟲基因組編碼兩種NTPase蛋白：NTPase-I和NTPase-II[3,8-9]。研究表明，NTPase-I僅存在于弓形蟲強(qiáng)毒株，而NTPase-II則存在于幾乎所有的弓形蟲蟲株。同時(shí)，除在剛地弓形蟲和犬新孢子蟲體內(nèi)[5,10]發(fā)現(xiàn)這種依賴DTT激活的NTPase外，尚未在其他物種中發(fā)現(xiàn)該酶，并且Asai等[10]發(fā)現(xiàn)，犬新孢子蟲速殖子體內(nèi)只表達(dá)NTPase-I。因此，以NTPase-II蛋白作為防治弓形蟲病的藥物或疫苗靶點(diǎn)具有更廣泛地應(yīng)用前景。

通過體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)證實(shí)弓形蟲NTPase-II蛋白在免疫動(dòng)物后可為其提供一定的免疫保護(hù)作用[11]。然而，由于核酸疫苗相比蛋白質(zhì)疫苗具有生產(chǎn)簡(jiǎn)便安全、成本低廉、穩(wěn)定性好且具有良好的誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫的優(yōu)點(diǎn)，因此，研究核酸疫苗在一定意義上比基因工程亞單位疫苗更有發(fā)展前景?；诒緦?shí)驗(yàn)所獲得的pcDNA3.1(+)-NTPase-II真核重組表達(dá)質(zhì)粒，為NTPase-II核酸疫苗的進(jìn)一步應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Tan Feng, Email: tanfengsong@163.com

Construction and identification of eukaryotic expression plasmid ofToxoplasmagondiiNTPase-II gene

CHEN Lei1,LI Cheng-peng1,CHEN Di1,ZHAO Xuhanhui1, JIANG Kai1,LIN Jia-xin2,LIU Yang-yang2,HU Xin2,TAN Feng3

(1.TheFirstClinicalMedicalCollege,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325035,China; 2.SchoolofMedicalLaboratoryScienceandSchoolofLifeScience,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325035,China; 3.TheSchoolofBasicMedicalSciences,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325035,China)

We constructed the eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1(+)-NTPase-II ofToxoplasmagondiiand assess the expression of recombinant protein in COS-7 cells. The prokaryotic expression plasmid pBAD-HisB-NTPase-II constructed previously in our laboratory was used as templates to amplify the target gene by PCR. The resulting PCR products were cloned into the vector pcDNA3.1(+) for construction of eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1(+)-NTPase-II. Then, the plasmids were transfected into COS-7 cells after identification with double enzyme digestion and sequencing. Finally, Western blot was performed to detect the expression of NTPase-II in COS-7. The result revealed thatToxoplasmaNTPase-II could be expressed in COS-7 cells when compared with empty pcDNA3.1(+) control group. Taken together, the plasmid pcDNA3.1(+)-NTPase-II constructed successfully will play an important role in development of a potential gene vaccine.

Toxoplasmagondii; nucleoside triphosphate hydrolase (NTPase); eukaryotic expression

譚峰：Email： tanfengsong@163.com

1.溫州醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，溫州 325035； 2.溫州醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，溫州 325035； 3.溫州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，溫州 325035

Supported by the Fund of Science and Technology of Zhejiang Province (No. 2014C33161) and the Student Scientific Research Project of Wenzhou Medical College (No. wyx201301011)

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.06.005

R382.5

A

1002-2694(2015)06-0519-03

2014-10-11；

2014-11-26

浙江省科技廳公益性項(xiàng)目(No.2014C33161)和溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)生科研項(xiàng)目(No.wyx201301011)聯(lián)合資助