結(jié)核分枝桿菌Rv3134c蛋白抗原表位的預(yù)測(cè)

崔瑞娜，白雪娟，陽幼榮，梁 艷，張俊仙，趙衛(wèi)國，吳雪瓊

結(jié)核分枝桿菌Rv3134c蛋白抗原表位的預(yù)測(cè)

崔瑞娜1,2，白雪娟1，陽幼榮1，梁 艷1，張俊仙1，趙衛(wèi)國2，吳雪瓊1

目的 預(yù)測(cè)結(jié)核分枝桿菌Rv3134c的抗原表位，了解其免疫學(xué)特性。方法 利用DNAStar軟件包中Protean軟件對(duì)Rv3134c氨基酸序列進(jìn)行分析，采用包括二級(jí)結(jié)構(gòu)、親水性、抗原性、表面可能性、柔韌性等多參數(shù)預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)及T細(xì)胞和B細(xì)胞抗原表位，最后BLAST分析其與人類抗原表位的同源性。結(jié)果 Rv3134c蛋白具有豐富的二級(jí)結(jié)構(gòu)和多處抗原指數(shù)較高的區(qū)段，含有較多潛在的B細(xì)胞抗原表位，可能位于1-7、30-37、65-81、89-100、111-120、138-148、184-195、209-216、233-238位氨基酸殘基或其附近，這些區(qū)域基本上含有β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，親水性、表面可能性和柔韌性指數(shù)都較高。該蛋白潛在的T細(xì)胞抗原表位較少，可能位于62-76、89-97、185-195、203-213、219-231、248-255位氨基酸殘基或其附近。BLAST分析結(jié)果顯示，其與人類抗原表位的同源性很低。結(jié)論 結(jié)核分枝桿菌Rv3134c是一個(gè)即含有較多B細(xì)胞抗原表位又含有較多T細(xì)胞抗原表位的蛋白抗原，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為該蛋白抗原表位的進(jìn)一步研究與合成肽疫苗奠定了基礎(chǔ)。

結(jié)核分枝桿菌；Rv3134c蛋白；抗原表位；二級(jí)結(jié)構(gòu)；預(yù)測(cè)

目前，結(jié)核病仍是全球最主要的健康問題之一，而結(jié)核潛伏感染(Latent tuberculosis infection，LTBI)者約占全球人口的三分之一，而大多數(shù)結(jié)核病患者來源于內(nèi)源性復(fù)燃。研究結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)潛伏感染相關(guān)蛋白抗原的免疫學(xué)特性，闡明MTB的休眠機(jī)制，對(duì)于結(jié)核病疫情的控制具有重要意義。免疫細(xì)胞識(shí)別抗原分子引起機(jī)體免疫應(yīng)答，而抗原分子表面的抗原表位(Epitope)是免疫細(xì)胞受體識(shí)別的位點(diǎn)，因此，對(duì)MTB蛋白抗原表位的免疫學(xué)特性研究及優(yōu)勢(shì)表位的篩選和鑒定具有重要意義，并能進(jìn)一步揭示免疫反應(yīng)和結(jié)核病致病機(jī)理，為研發(fā)新疫苗和抗結(jié)核潛伏感染藥物提供理論依據(jù)。

MTB Rv3134c編碼基因全長807 bp，編碼268個(gè)氨基酸，蛋白理論分子量為28.008 kDa，等電點(diǎn)為7.965。在低氧、一氧化氮和一氧化碳等刺激下，其表達(dá)上調(diào)[1]，編碼一種富含丙氨酸-纈氨酸的脅迫蛋白( universal stress protein)[2-3]，對(duì)MTB抵抗脅迫環(huán)境、適應(yīng)能量缺乏等起重要作用。Rv3134c基因與雙組份系統(tǒng)DevR-DevS共轉(zhuǎn)錄，共同參與MTB 應(yīng)對(duì)外界環(huán)境刺激所發(fā)生的代謝改變。Rv3134c基因啟動(dòng)子區(qū)域包含兩個(gè)DevR綁定位點(diǎn)，與hspX、narK2和 Rv1738等多個(gè)DevR基因調(diào)節(jié)子共同調(diào)節(jié)MTB向非復(fù)制的休眠表型轉(zhuǎn)變，在MTB向潛伏感染轉(zhuǎn)變過程中起重要的調(diào)控作用[4-5]。由此可見，該蛋白可能成為清除潛伏感染的結(jié)核分枝桿菌、抑制其復(fù)燃的潛在的藥物靶點(diǎn)。因此，本研究運(yùn)用DNAStar生物信息學(xué)軟件對(duì)MTB Rv3134c蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、T細(xì)胞和B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行初步的預(yù)測(cè)，為進(jìn)一步地篩選、鑒定Rv3134c蛋白抗原的優(yōu)勢(shì)表位，并進(jìn)行功能分析及免疫學(xué)特性研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 MTB Rv3134c蛋白氨基酸序列 從NCBI網(wǎng)站獲取其氨基酸全長序列(268個(gè)氨基酸)如下：

1.2 方法

1.2.1 抗原表位分析軟件 DNAStar軟件包是DNASTAR有限公司開發(fā)的生物軟件，可在計(jì)算機(jī)上進(jìn)行DNA和蛋白質(zhì)分析。用DNAStar軟件包中Protean軟件對(duì)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和抗原表位進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)[6-7]。

1.2.2 BLAST分析 采用EXPASY在線軟件(NCBI BLAST2 service)對(duì)Rv3134c蛋白氨基酸序列與人類蛋白質(zhì)的同源性進(jìn)行分析，具體方法：利用Internet 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)入EXPASY主頁(http://web.expasy.org/blast/)，選擇蛋白數(shù)據(jù)庫[blastp - query against the UniProt Knowledgebase (Swiss-Prot +4 TrEMBL)]，選擇database (Homo sapiens)，選定Run BLAST，輸入Rv3134c蛋白的氨基酸序列后進(jìn)行比對(duì)。

1.2.3 Rv3134c蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè) 采用Gamier-Robson方法、Chou—Fasman方法和Coiled Coil方法預(yù)測(cè)Rv3431c蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.4 Rv3134c蛋白抗原表位的預(yù)測(cè) 用Kyte-Doolittle方法、Hopp-Woods方法和Eisenberg方法分析Rv3134c蛋白的疏水性和親水性；用Emini方法預(yù)測(cè)蛋白表面可及性；用Karplus-Schulz方法預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)骨架區(qū)的柔韌性；以Jameson-wolf方法預(yù)測(cè)蛋白潛在的抗原表位，以AMPHI方法預(yù)測(cè)蛋白免疫優(yōu)勢(shì)輔助性T淋巴細(xì)胞抗原位點(diǎn)，以Rothbard-Taylor方法預(yù)測(cè)含有特定基序(motif)的潛在T淋巴細(xì)胞抗原表位，以Sette MHC Motifs預(yù)測(cè)短肽上與老鼠 MHC II d 型蛋白質(zhì)相互作用的抗原位點(diǎn)，最后綜合評(píng)價(jià)Rv3134c蛋白抗原表位。

2 結(jié) 果

2.1 Rv3134c蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和抗原表位預(yù)測(cè)

2.1.1 Rv3134c蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè) 綜合應(yīng)用Gamier-Robson、Chou-Fasman和Coiled Coil 3種方法預(yù)測(cè)Rv3134c蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果見(圖1)：α螺旋較多，分布較均勻，位于17-35、49-52、58-75、79-86、88-103、120-124、126-129、143-212、214-221、226-234、242-252、265-268位氨基酸殘基；不存在跨膜區(qū)的α螺旋結(jié)構(gòu)；β折疊也較多，位于7-15、36-52、80-86、104-115、120-125、130-137、143-147、149-154、160-165、171-174、214-220、238-242、258-264位氨基酸殘基；Chou-Fasman法顯示存在較多長度相仿的轉(zhuǎn)角，且分布較均勻；在2-5、55-57、76-79、138-142、211-213位氨基酸殘基存在無規(guī)則卷曲。

圖1 結(jié)核分枝桿菌Rv3134c蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.1.2 Rv3134c蛋白的親水性分析 用Kyte-Doolittle方法分析Rv3134c蛋白的疏水性和親水性，結(jié)果(圖2)顯示該蛋白疏水性區(qū)域位于8-16、21-29、38-48、82-85、87-91、101-110、121-138、148-160、162-164、175-183、221-226、254-267位氨基酸殘基，以8-16、101-110、121-138、148-160、175-183、254-267位氨基酸殘基疏水性指數(shù)較高；親水性區(qū)域1-7、17-20、30-37、49-52、54-60、65-81、92-100、111-120、139-147、165-174、184-196、199-217、231-237、244-249、251-253，以1-7、65-81、92-100、112-120、184-196、199-217位氨基酸殘基等處的親水性指數(shù)較高。

圖2 結(jié)核分枝桿菌Rv3134c蛋白的親水性和疏水性分析

2.1.3 Rv3134c蛋白的表面可能性分析 Rv3134c蛋白呈現(xiàn)在表面可能性較大的區(qū)域主要是在1-7、67-72、94-99、114-117、139-145、184-193、209-216、233-236位氨基酸殘基，其他部位展示的可能性較小或表現(xiàn)為負(fù)值，見圖3。

2.1.4 Rv3134c蛋白的柔韌性分析 Rv3134c蛋白含有較多的柔韌性區(qū)域位于5-7、14-19、33-35、45-48、53-59、68-83、89-93、96-100、115-120、138-148、156-159、185-195、223-225、234-238位氨基酸殘基，見(圖4)。

圖3 結(jié)核分枝桿菌Rv3134c蛋白表面可能性區(qū)域

圖4 結(jié)核分枝桿菌Rv3134c蛋白柔韌性區(qū)域

2.1.5 Rv3134c蛋白B細(xì)胞抗原表位的預(yù)測(cè)分析 Rv3134c蛋白含有許多抗原指數(shù)較高的區(qū)域，見(圖5)。提示這些區(qū)段含有潛在優(yōu)勢(shì)抗原表位，如1-9、15-22、30-39、45-49、51-62、64-102、112-122、137-146、154-159、165-176、185-196、201-206、212-229、234-239、243-248、256-258、265-268位氨基酸殘基區(qū)域。再結(jié)合蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、親水性、表面可能性和柔韌性，綜合分析 Rv3134c蛋白潛在的蛋白抗原決定簇，在1-7、30-37、65-81、89-100、111-120、138-148、184-195、209-216、233-238位氨基酸殘基區(qū)域β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)較多、親水性和表面可能性指數(shù)較高、柔韌性較大，暴露于表面的幾率較大，且易發(fā)生扭曲、折疊，提示作為B細(xì)胞抗原表位的可能性最大。

2.1.6 Rv3134c蛋白T細(xì)胞抗原表位的預(yù)測(cè)分析 用Rothbard-Taylor方法預(yù)測(cè)含有特定基序(motif)的潛在T淋巴細(xì)胞抗原表位，結(jié)果(圖6)顯示，18-22、30-33、62-66、73-76、93-96、159-167、182-185、195-198、204-213、219-223、229-233、252-255位氨基酸殘基處是潛在的T細(xì)胞抗原表位，且分布較均勻。以AMPHI方法預(yù)測(cè)48-53、55-59、65-75、89-97、123-125、142-147、149-156、181-183、185-195、203-212、224-231、248-254位氨基酸殘基可能是免疫優(yōu)勢(shì)的輔助性T淋巴細(xì)胞抗原位點(diǎn)，7-12、14-19、38-43、46-51、113-119、121-126、144-154、160-165、176-186、195-206、215-220、260-266位氨基酸殘基可能是與小鼠 MHC IId型蛋白質(zhì)相互作用的抗原位點(diǎn)。綜合分析，62-76、89-97、185-195、203-213、219-231、248-255位氨基酸殘基處作為T細(xì)胞抗原表位的可能性較大。

圖5 結(jié)核分枝桿菌Rv3134c蛋白抗原指數(shù)分析

圖6 結(jié)核分枝桿菌Rv3134c蛋白T細(xì)胞抗原表位的預(yù)測(cè)

2.2 MTB Rv3134c蛋白與人類蛋白質(zhì)氨基酸序列BLAST分析 通過BLAST分析，發(fā)現(xiàn)Rv3134c蛋白的氨基酸序列與人半椎蛋白-2前體(Hemicentin-2 precursor)只有12%(32/268個(gè)氨基酸)的同源性，同源性主要位于第76～160位氨基酸殘基，這段同源性達(dá)到30%。

3 討 論

由于MTB生長緩慢，天然蛋白抗原獲取困難，常常成為研究MTB致病機(jī)理的障礙。通過基因工程技術(shù)獲得重組蛋白抗原是一個(gè)簡便、有效的途徑[8-9]。而生物信息學(xué)分析和預(yù)測(cè)蛋白優(yōu)勢(shì)抗原表位為重組蛋白抗原奠定了前期基礎(chǔ)，增強(qiáng)了實(shí)驗(yàn)的目的性，減少了不必要的人力、物力和時(shí)間的浪費(fèi)，目前已被越來越多的研究者采用[10-11]。

MTB的雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)DevS、DevT和DevR分別由Rv3132c、Rv2027c和Rv3133c基因編碼，其中Rv3133c、Rv3132c和 Rv3134c基因構(gòu)成操縱子，Rv3134c/Rv3133c/Rv3132c基因組在缺氧情況下能被快速的誘導(dǎo)[2,5]。Sherman[12]研究發(fā)現(xiàn)，敲除Rv3134c 編碼序列后，下游的基因表達(dá)受影響，Rv3134c蛋白可能參與了雙組分系統(tǒng)的磷酸化過程。Saini[13]等研究發(fā)現(xiàn)MTB強(qiáng)毒株H37Rv在低氧條件下DevR蛋白增加的水平與Rv3134c-devR-devS操縱子誘導(dǎo)的RNA水平上調(diào)是相關(guān)的。Kaur[14]等最近也發(fā)現(xiàn)，DevRS A-ext和DevRS D模擬肽抑制Rv3134c啟動(dòng)子活性的同時(shí)，DevR調(diào)節(jié)子其他成員的表達(dá)也受損。這些研究結(jié)果均表明Rv3134c蛋白在MTB適應(yīng)缺氧中起重要作用。

本文通過生物學(xué)軟件對(duì)Rv3134c蛋白的抗原表位首次進(jìn)行初步的預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)1-7、67-72、96-100、115-119、139-145、185-194、234-236位氨基酸殘基是潛在的B細(xì)胞抗原表位；73-75、93-97、204-212、229-231、252-254位氨基酸殘基是潛在的T細(xì)胞抗原表位。另外，通過BLAST分析，發(fā)現(xiàn)Rv3134c蛋白的氨基酸序列與人半椎蛋白-2前體的同源性很低，少數(shù)同源性主要位于第76～160位氨基酸殘基。因此，在抗原表位設(shè)計(jì)、合成時(shí)避開這些同源性區(qū)域就可獲得交叉反應(yīng)性低、特異性高的抗原表位。這些預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)為進(jìn)一步研究其在潛伏感染中的作用奠定了理論基礎(chǔ)。但由于預(yù)測(cè)軟件的局限性和機(jī)體免疫反應(yīng)的復(fù)雜性，預(yù)測(cè)結(jié)果只能作為參考，應(yīng)綜合應(yīng)用多個(gè)軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)并做體外試驗(yàn)驗(yàn)證。

總之，MTB Rv3134c蛋白既含有潛在的B細(xì)胞抗原表位，又含有潛在的T細(xì)胞抗原表位，本研究的抗原表位預(yù)測(cè)結(jié)果為該蛋白免疫學(xué)特性的深入研究，揭示MTB的潛伏感染機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。

[1]Hingley-Wilson SM, Lougheed KEA, Ferguson K, et al. IndividualMycobacteriumtuberculosisuniversal stress protein homologues are dispensableinvitro[J]. Tuberculosis, 2010, 90(4): 236-244. DOI: 10.1016/j.Tube.2010.03.013

[2]Bagchi G, Chauhan S, Sharma D, et al. Transcription and autoregulation of the Rv3134c-devR-devS operon ofMycobacteriumtuberculosis[J]. Microbiology, 2005, 151: 4045-4053. DOI: 10.1099/mic.0.28333-0

[3]Fallow A, Domenech P, Reed MB. Strains of the East Asian (W/Beijing) lineage of Mycobacterium tuberculosis are DosS/DosT-DosR two-component regulatory system natural mutants[J]. J Bacteriol, 2010, 192(8): 2228-2238. DOI: 10.1128/JB. 01597-09

[4]Mayuri, Bagchi G, Das TK. Molecular analysis of the dormancy response inMycobacteriumsmegmatis: expression analysis of genes encoding the DevR-DevS two-component system, Rv3134c and chaperone K-crystallin homologues[J]. FEMS Microbiol Lett, 2002: 231-237.DOI: 10.1111/j.1574-6968.2002.tb11230.x

[5]Bandyopadhyay A, Biswas S, Maity AK, et al. Analysis of DevR regulated genes inMycobacteriumtuberculosis[J]. Systems Synthetic Biol, 2014, 8(1): 3-20. DOI: 10.1007/s11693-014-9133-y

[6]Zhu YJ, Liu B, Zheng WW, et al. Gene sequence of the protein structural analysis software Protean use of technology[J]. Fujian Agr Biotechnol Communications, 2004, 6(4): 8-12. (in Chinese) 朱育菁,劉波,鄭偉文,等.基因序列蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析軟件Protean使用技術(shù)[J].福建農(nóng)業(yè)生物技術(shù)通訊,2004, 6(4):8-12.

[7]Wang GX, Shang YJ, Lü ZL, et al. Prediction of secondary structures and cell epitopes of F1L protein of ORFV[J]. Chin J Zoonoses, 2012, 28(12): 1185-1190. DOI: 10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2012.12.006 (in Chinese) 王光祥,尚佑軍,呂占祿,等.羊口瘡病毒F1L蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析與表位測(cè)[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào), 2012, 28(12):1185-90.

[8]Yang YR, Wu XQ, Zhao WG, et al. Preparation and preliminary application of fusion protein Rv0057 Rv1352 ofMycobacteriumtuberculosis[J]. Chin J Biologicals, 2013, 26(6): 851-856. (in Chinese) 陽幼榮,吳雪瓊,趙衛(wèi)國.結(jié)核分枝桿菌Rv0057-Rv1352融合蛋白的制備及其初步應(yīng)用[J].中國生物制品學(xué)雜志,2013, 26(6): 851-856.

[9]Lu JB, Chen BW, Wang GZ, et al. Recombinant tuberculosis vaccine AEC/BC02 induces antigen-specific cellular responses in mice and protects guinea pigs in a model of latent infection[J]. J Microbiol Immunol Infect, 2014, pii: S1684-1182(14)00060-7. DOI: 10.1016/j.jmii.2014.03.005

[10]Greory AP, lnna GO, Kenneth LJ, et al. The role of mass spectrometry in vaccine development[J]. Vaccine, 2001(17-19): 2692-2700. DOI: 10.1016/S0264-410X(00)00505-3

[11]Zhu DD, Duan YN, Chen YL. Prediction on the antigenic epitopse of the kexin protein fromPneumocystiscarinii[J]. Mod Prevent Med, 2011, 38(6): 1077-1079. (in Chinese) 朱丹丹,段義農(nóng),陳金鈴.卡氏肺孢子蟲 kexin 蛋白抗原表位預(yù)測(cè)[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2011,38(6):1077-1079.

[12]Sherman DR, Voskuil M, Schnappinger D, et al. Regulation of the Mycobacterium tuberculosis hypoxic response gene encoding α-crystallin[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2001, 98(13): 7534-7539. DOI: 10.1073/pnas.121172498

[13]Saini DK, Malhotra V, Dey D, et al. DevR-DevS is a bona fide two-component system of Mycobacterium tuberculosis that is hypoxia-responsive in the absence of the DNA-binding domain of DevR[J]. Microbiology, 2004, 150: 865-875.DOI: 10. 1099/mic.0.26218-0

[14]Kaur,Taneja NK, Dhingra S, et al. DevR (DosR) mimetic peptides impair transcriptional regulation and survival ofMycobacteriumtuberculosisunder hypoxia by inhibiting the autokinase activity of DevS sensor kinase[J]. BMC Microbiol, 2014, 14: 195. DOI: 10.1186/1471-2180-14-195

s: Wu Xue-qiong, Email: wu-xueqiong@263.net; Zhao Wei-guo, Email: zhaowg309@163.com

Prediction of epitopes ofMycobacteriumtuberculosisRv3134c protein

CUI Rui-na1,2,BAI Xue-juan1,YANG You-rong1,LIANG Yan1, ZHANG Jun-xian1,ZHAO Wei-guo2,WU Xue-qiong1

(1.ArmyTuberculosisControlandPreventionKeyLaboratory/BeijingKeyLaboratoryofTuberculosisNewDiagnosisandTreatmentTechnology/InstituteofTuberculosisResearch,Beijing100091,China; 2.DepartmentofRespiratoryMedicine,the309thHospitalofChinesePLA,Beijing100091,China)

In this study, we predicted the epitopes ofMycobacteriumtuberculosisRv3134c protein and investigated its immunological characteristics. The amino acid sequence of Rv3134c protein was input and predicted the epitopes of B cell and T cell using multi-parameters including the secondary structure, hydrophilicity, antigenicity, accessibility, flexibility, charge distribution by Protean software of DNAStar software package. Results showed that the Rv3134c protein had rich secondary structure and multiple sections with higher antigenicity. There were a few potential B cell epitopes at 1-7, 30-37, 65-81, 89-100, 111-120, 138-148, 184-195, 209-216, and 233-238 amino acid residues or nearby, and theses epitopes had better antigenicity, contained beta angle and irregular coil structure, presented in the surface probability and had larger flexibility. There also were more potential T cell epitopes of the protein containing at 62-76, 89-97, 185-195, 203-213, 219-231, 248-255, amino acid residues or nearby. There was low homology between Rv3134c protein and human protein by BLAST analysis. In conclusion,MycobacteriumtuberculosisRv3134c protein had more B-cell epitopes and T-cell epitopes, which will lay the foundation for its further study and the development of vaccine.

Mycobacteriumtuberculosis; Rv3134c protein; epitope; secondary structure; prediction

國家重大傳染病防治科技重大專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(No.2012ZX10003008002)，軍隊(duì)醫(yī)學(xué)科技“十二五”重點(diǎn)項(xiàng)目(No.BWS11J050)，北京市科技創(chuàng)新基地培育與發(fā)展工程專項(xiàng)項(xiàng)目(No.Z141107004414021)

吳雪瓊，Email: wu-xueqiong@263.net； 趙衛(wèi)國，Email: zhaowg309@163.com

1.解放軍第309醫(yī)院全軍結(jié)核病研究所，全軍結(jié)核病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，結(jié)核病診療新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；北京 100091; 2.解放軍第309醫(yī)院呼吸科，北京 100091

Supported by grants from the National Science and Technology Major Infectious Diseases of Major Funded Project (No. 2012ZX10003008002), the Military Medical Science "Twelve Five" Key Project (No. BWS11J050), the Beijing Technology Innovation Base Nurturing and Development Special Projects (No. Z141107004414021)

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.06.010

R378.91

A

1002-2694(2015)06-0541-06

2014-12-05；

2015-03-30